Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Projektionsmuster von Motoneuronen in fortgeschrittenen Embryonalstadien von Drosophila melanogaster zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neuronalen Entwicklung zu beantworten, wie beispielsweise die Lenkung motorischer Axone und die Bildung neuronaler Subtypen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine präzise Visualisierung motorischer Axone in sich entwickelnden Embryonen ermöglicht, wodurch eine zuverlässige Analyse des axonalen Wegfindungsverhaltens und der Zielinnervation sowie von Entwicklungsstörungen möglich ist.

Ein Tag nach dem Aufstellen der Eiersammelplatten ersetzen Sie die Platten durch neue mit einem Tupfen frisch hergestellter Hefepaste. Nach drei Stunden auf den frischen Platten überführen Sie die Fliegen in neue Nährflaschen. Inkubieren Sie die Eierplatten über Nacht bei 25 Grad Celsius.

Am Morgen 1,8 Milliliter PBT-Lösung zu den Platten geben. Die Embryonen mit einem Wattestäbchen lösen. Anschließend die Embryonen und die Lösung mit einer 1-Milliliter-Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Sobald die Embryonen sich am Boden abgesetzt haben, saugen Sie so viel Lösung wie möglich ab. Spülen Sie die Embryonen anschließend zweimal mit je einem Milliliter PBT. Um die Embryonen zu dechorionieren, ersetzen Sie die letzte Spülung durch einen Milliliter 50 %iger Bleichlauge und schütteln das Gefäß drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um die Bleiche zu entfernen, spülen Sie die Embryonen dreimal mit PBT. Ersetzen Sie dann den letzten Spülschritt durch ein halbes Milliliter 100 % Heptan und ein halbes Milliliter 4 % Paraformaldehyd. Inkubieren Sie die Embryonen anschließend 15 Minuten bei sanftem Schütteln.

Nach der Inkubation entfernen Sie die untere Lösungsschicht und geben 500 µL 100 % Methanol zurück. Schütteln Sie das Reagenzglas nun 30 Sekunden lang kräftig, um die Embryonen von der Dotterhülle zu befreien. Entfernen Sie danach die obere Lösungsschicht, geben erneut 500 µL 100 % Methanol hinzu und schütteln das Reagenzglas weitere 10 Sekunden lang.

Nach dem Schütteln des Reaktionsgefäßes klopfen Sie es leicht, um die Embryonen abzusetzen, und entfernen Sie so viel Lösung wie möglich. Spülen Sie die Embryonen anschließend kurz mit 100 % Methanol. Danach spülen Sie die Embryonen unverzüglich dreimal mit PBT.

Suspenderen Sie die Embryonen nun in einem Milliliter frischem PBT und inkubieren Sie die Embryonen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um sie für die LacZ-Färbung vorzubereiten. Während die Embryonen inkubieren, bereiten Sie ein Milliliter-Aliquot der X-gal-Färbelösung vor.

Erwärmen Sie die Aliquot in einem Wasserbad von 65 Grad Celsius, bis sie trüb wird. Danach überführen Sie sie in einen Wärmeprobeblock mit 37 Grad Celsius. Nachdem die Embryonen 15 Minuten lang erwärmt wurden, entfernen Sie die PBT-Lösung und ersetzen Sie sie durch die eine Milliliter-Aliquot der Färbungslösung.

Dann 20 µL X-gal-Substrat hinzufügen. Das Reagenzglas für etwa zwei bis vier Stunden bei 37 °C mit sanftem Schütteln inkubieren, bis sich ein blauer Niederschlag bildet. Anschließend die Färbelösung entfernen und die Embryonen dreimal mit PBT bei Raumtemperatur waschen.

Nach den Spülschritten die Embryonen unter einem Stereomikroskop mit einer Nadelsonde oder Pinzette manuell sortieren. Die gefärbten Embryonen von Interesse mit einer 1 mL-Pipette in ein halbes Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen sammeln. Anschließend die ausgewählten Embryonen mit 0,4 Millilitern PBT waschen.

Danach das PBT durch 0,3 Milliliter Blockierungslösung ersetzen und die Embryonen unter leichtem Schütteln 15 Minuten lang inkubieren lassen. Nach 15 Minuten 75 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzufügen und die Inkubation über Nacht fortsetzen. Am folgenden Morgen die Embryonen etwa zwei Stunden lang mit PBT waschen, wobei die Waschlösung etwa alle 30 Minuten gewechselt wird.

Nach der Wäsche 0,3 Milliliter Blockierungslösung mit sekundärem Antikörper hinzufügen und das Gefäß über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren. Am nächsten Morgen die Embryonen etwa drei Stunden lang mit PBT waschen. Während der Waschdauer den PBT mindestens fünfmal wechseln.

Nach der Wäsche die Embryonen in 0,3 Milliliter DAB-Lösung resuspendieren und zwei Mikroliter 3 % Wasserstoffperoxid hinzufügen. Anschließend im Dunkeln unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren, bis ausreichend Precipitat gebildet ist. Dies dauert in der Regel 30 bis 60 Minuten.

Danach die Embryonen viermal mit PBT spülen und in 0,2 Milliliter Einbettlösung resuspendieren. Nun die Embryonen im Dunkeln bei 4 Grad Celsius äquilibrieren lassen. Um die Embryonen zu filetieren, auf einem Objektträger positionieren.

Versetzen Sie sie zunächst in einen Tropfen Glycerin mit der ventralen Seite nach oben. Schneiden Sie danach unter einem Stereomikroskop den vorderen Teil sowie ein Viertel der Körperlänge ab und entfernen Sie den hintersten Bereich, der frei von motorischen Axonen ist. Bewegen Sie nun mit einer Nadelsonde die Präparation aus dem Glycerin heraus, mit der dorsalen Seite nach oben orientiert, und positionieren Sie sie horizontal im Sichtfeld.

Der nächste Schritt erfordert eine feine Wolframnadel, die in den hohlen Bereich einer Nadelsonde eingeführt und dann an der Spitze gebogen wurde. Mit der Wolframnadel einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos machen und entlang der dorsalen Mittellinie weiter schneiden. Darauf achten, dass die Spitze der Wolframnadel während der Dissektion die Oberfläche des Objektträgers nicht berührt, da die Nadel leicht an dem Glas verbiegen kann.

Dann mit der Sonde die Präparation zurück in den Glyzerintropfen bringen und sie mit der dorsalen Seite nach oben positionieren. Dort den Darm von der Körperwand lösen, indem jede Körperwand in ventrolateraler Richtung entfaltet wird. Die beiden Körperwände sollten sich voneinander lösen.

Verwenden Sie nun die Sonde, um die Wandklappen des Körpers vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen. Entfernen Sie auf dem Objektträger mithilfe einer Wolframnadel die inneren Organe, indem Sie sie seitlich wegschieben. Um die Wolframnadel zu stabilisieren und Beschädigungen vorzubeugen, lassen Sie die Hohlnadel eingestochen und stützen Sie die Wolframnadel während der Handhabung gegen die Oberfläche des Objektträgers.

Bringen Sie die Präparate nun in acht Mikrolitern Eindecklösung auf einem neuen Objektträger an. Legen Sie ein Deckglas auf und versiegeln Sie die Ränder mit gewöhnlichem Nagellack. Erfassen Sie anschließend Bilder mit hoher Auflösung mithilfe der DIC-Optik.

Mithilfe der beschriebenen Methode wurden Embryonen im Stadium 16 mit einem Fas2-Antikörper gefärbt und zur Visualisierung der motorischen Neurone sowie der abdominalen Hemi-Segmente A3 und A4 aufbereitet. Normalerweise verlängern sich mindestens sieben motorische Neurone und faszikulieren ihre Axone, um einen ISNb-Nervenzweig zu bilden. Zahlreiche umgebende Nervenbündel waren in dieser Präparation ebenfalls erkennbar. Wenn das intersegmentale Nervenbündel den Entscheidungspunkt an den Muskeln 6 und 7 erreicht, lösen sich zwei Axone selektiv von dem Bündel ab und innervieren die Muskeln 6 und 7.

Dasselbe geschieht an anderen Entscheidungspunkten, während sich das Bündel dorsal fortsetzt. Anschließend, am letzten Entscheidungspunkt, innervieren zwei Axone den Muskel 12. Im Gegensatz dazu defaszikulieren dieselben Axone in Sema-1a-Mutanten-Embryonen an ihren Entscheidungspunkten nicht.

Dies ist nicht überraschend, da bekannt ist, dass das Sema-1 aegean-Produkt bei der Ausbildung von Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuralen Entwicklung hilft. Somit kann die beschriebene Methode zur Analyse von Mutantenphänotypen verwendet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die gewünschten mutierten Embryonen sortiert, wie man die axonalen Projektionsmuster von motorischen Neuronen immunfärbt und wie man fixierte Embryonen zur flachen Präparation disseziert.