Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Projektionsmuster von Motoneuronen in späten Embryonen von Drosophila melanogaster zu analysieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der neuronalen Entwicklung zu beantworten, wie z.B. die motorische Axonführung und die Bildung neuraler Unterkuben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise Visualisierung des motorischen Axons in sich entwickelnden Embryonen ermöglicht, was eine zuverlässige Analyse der axonalen Wegfindung ermöglicht und auf den Zustandsdefekt abzielt.

Einen Tag nach dem Aufstellen der Eierauffangplatten werden die Platten durch neue ersetzt, die einen Klecks frisch hergestellte Hefepaste enthalten. Nach drei Stunden auf den frischen Tellern die Fliegen in neue Lebensmittelflaschen umfüllen. Und die Eierplatten über Nacht bei 25 Grad Celsius inkubieren.

Geben Sie morgens 1,8 Milliliter PBT-Lösung auf die Platten. Und verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Embryonen zu entfernen. Übertragen Sie dann mit einer 1-Milliliter-Pipette die Embryonen und die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Sobald sich die Embryonen am Boden abgesetzt haben, aspirieren Sie so viel Lösung wie möglich. Spülen Sie die Embryonen dann zweimal mit einem Milliliter PBT pro Spülung. Um die Embryonen zu dekorieren, ersetzen Sie die letzte Spülung durch einen Milliliter 50%iges Bleichmittel und schütteln Sie die Tube drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um das Bleichmittel zu entfernen, spülen Sie die Embryonen dreimal mit PBT aus. Ersetzen Sie dann die letzte Spülung durch einen halben Milliliter 100 % Heptan und einen halben Milliliter 4 % Paraformaldehyd. Inkubieren Sie nun die Embryonen 15 Minuten lang unter leichtem Schaukeln.

Entfernen Sie nach der Inkubation die darunterliegende Lösungsschicht und fügen Sie 500 Mikroliter 100%iges Methanol wieder hinzu. Schütteln Sie nun den Schlauch 30 Sekunden lang kräftig, um die Embryonen zu entgiften. Entfernen Sie dann die darüber liegende Lösung, fügen Sie wieder 500 Mikroliter 100%iges Methanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen weitere 10 Sekunden lang.

Nachdem Sie den Schlauch geschüttelt haben, klopfen Sie darauf, um den Embryonen zu helfen, sich zu setzen und so viel Lösung wie möglich zu entfernen. Spülen Sie anschließend die Embryonen kurz mit 100%Methanol aus. Spülen Sie die Embryonen dann sofort dreimal mit PBT aus.

Nun resuspendieren Sie die Embryonen in einem Milliliter frischem PBT. Und inkubieren Sie die Embryonen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um sie für die LacZ-Färbung vorzubereiten. Während die Embryonen inkubieren, bereiten Sie ein Aliquot von einem Milliliter X-Gal-Färbelösung vor.

Erwärmen Sie das Aliquot in einem 65 Grad Celsius warmen Wasserbad, bis es trüb wird. Übertragen Sie es dann in einen 37 Grad Celsius heißen Block. Nachdem die Embryonen 15 Minuten lang erwärmt wurden, entfernen Sie die PBT-Lösung und ersetzen Sie sie durch das Aliquot von einem Milliliter Färbelösung.

Fügen Sie dann 20 Mikroliter X-Gal-Substrat hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen etwa zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schaukeln, bis sich ein blauer Niederschlag bildet. Entfernen Sie dann die Färbelösung und spülen Sie die Embryonen dreimal mit PBT bei Raumtemperatur aus.

Verwenden Sie nach den Spülungen eine Nadelsonde oder eine Pinzette, um die Embryonen unter einem Seziermikroskop von Hand zu sortieren. Sammeln Sie die gefärbten Embryonen von Interesse in einem halben Millimeter Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Ein-Milliliter-Pipette. Waschen Sie anschließend die ausgewählten Embryonen mit 0,4 Millilitern PBT.

Ersetzen Sie dann das PBT durch 0,3 Milliliter Blockierungslösung und lassen Sie die Embryonen 15 Minuten lang unter sanftem Rühren inkubieren. Nach 15 Minuten fügen Sie 75 Mikroliter des Primärantikörpers hinzu und setzen Sie die Inkubation über Nacht fort. Waschen Sie die Embryonen am nächsten Morgen etwa zwei Stunden lang mit PBT und wechseln Sie die Waschlösung etwa alle 30 Minuten.

Nach dem Waschen 0,3 Milliliter Blockierungslösung mit dem Sekundärantikörper hinzufügen und das Röhrchen über Nacht bei Raumtemperatur leicht schaukeln. Am nächsten Morgen waschen Sie die Embryonen etwa drei Stunden lang mit PBT. Wechseln Sie das PBT während der Waschperiode mindestens fünfmal.

Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Embryonen in 0,3 Millilitern Tupferlösung und fügen Sie zwei Mikroliter 3%iges Wasserstoffperoxid hinzu. Inkubieren Sie sie dann im Dunkeln unter leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur, bis genügend Niederschlag gebildet wird. Dies dauert in der Regel 30 bis 60 Minuten.

Spülen Sie dann die Embryonen viermal mit PBT und resuspendieren Sie sie in 0,2 Millilitern Eindecklösung. Lassen Sie nun die Embryonen im Dunkeln bei 4 Grad Celsius äquilibrieren. Um die Embryonen zu filetieren, stellen Sie sie auf einem Objektträger dar.

Schieben Sie sie zuerst mit der Bauchseite nach oben in einen Tropfen Glycerin. Schneiden Sie anschließend unter einem Präpariermikroskop den vorderen Teil und 1/4 der Körperlänge ab und entfernen Sie den hintersten Bereich, der frei von motorischen Axonen ist. Bewegen Sie nun das Präparat mit einer Nadelsonde mit der dorsalen Seite nach oben aus dem Glycerin und positionieren Sie es waagerecht im Sichtfeld.

Für den nächsten Schritt wird eine feine Wolframnadel benötigt, die in den Hohlbereich einer Nadelsonde eingeführt und dann am Ende gebogen wird. Machen Sie mit der Wolframnadel einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und schneiden Sie die dorsale Mittellinie weiter ab. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Wolframnadel während des Sezierens nicht die Oberfläche des Objektträgers berührt, da sich die Nadel leicht gegen das Glas biegen kann.

Kehren Sie dann mit der Sonde zurück zum Glycerintropfen und positionieren Sie ihn mit der Rückenseite nach oben. Löse dort den Darm von der Körperwand, indem du jede Körperwand in ventral-lateraler Richtung entfaltest. Die beiden Körperwände sollten auseinander fallen.

Schieben Sie nun mit der Sonde die Klappen der Körperwand vorsichtig auf einen Glasschieber. Verwenden Sie auf dem Objektträger eine Wolframnadel, um die inneren Organe zu entfernen, indem Sie sie seitlich drücken. Um die Wolframnadel zu stabilisieren und zu verhindern, dass sie beschädigt wird, halten Sie die Hohlnadel angetastet und halten Sie die Wolframnadel gegen die Oberfläche des Glasschiebers, während Sie die Wolframnadel manipulieren.

Montieren Sie nun die Präparate in acht Mikrolitern Einbettlösung auf einen neuen Objektträger. Bringen Sie einen Deckslip an und versiegeln Sie die Ränder mit normalem Nagellack. Nehmen Sie dann Bilder mit hoher Auflösung mit DIC-Optik auf.

Mit der beschriebenen Methode wurden Embryonen im Stadium 16 mit Fas2-Antikörpern gefärbt und für die Visualisierung der Motoneuronen und der abdominalen Hemisegmente A3 und A4 vorbereitet. Normalerweise dehnen sich mindestens sieben Motoneuronen aus und faszikulieren ihre Axone, um einen ISNb-Nervenast zu bilden. Viele umliegende Nervenbündel waren auch in diesem Präparat identifizierbar. Wenn das intersegmentale Nervenbündel den Auswahlpunkt bei Muskel 6 und 7 erreicht, entfaszkulieren und enervieren zwei Axone selektiv die Muskeln 6 und 7.

Das Gleiche geschieht an anderen Auswahlpunkten, wenn sich das Bündel nach dorsal ausdehnt. Dann, am letzten Auswahlpunkt, enervieren zwei Axone den Muskel 12. Im Gegensatz dazu gelingt es in Sema-1a-mutierten Embryonen nicht, dass dieselben Axone an ihren Auswahlpunkten defaszkulieren.

Dies ist nicht unerwartet, da bekannt ist, dass das ägäische Produkt Sema-1 dazu beiträgt, während der neuronalen Entwicklung Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln herzustellen. Somit kann die beschriebene Methode zur Analyse mutierter Phänotypen verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die gewünschten mutierten Embryonen sortiert, wie man die axonalen Projektionsmuster von Motoneuronen immunfärbt und wie man fixierte Embryonen für eine flache Präparation präpariert.