Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Beginnen Sie mit einem Röhrchen mit Drosophila-Embryonen im späten Stadium 16 in einem Eindeckmedium.

Die Motoneuronen von Drosophila sind immunmarkiert.

Übertragen Sie einen Embryo auf einen Objektträger und nehmen Sie ihn aus dem Eindeckmedium.

Platzieren Sie dann den Embryo mit der Bauchseite nach oben und präparieren Sie ihn.

Richten Sie den vorderen Abschnitt, der die Motoneuronen enthält, mit der dorsalen Seite nach oben aus.

Schneide mit einer Wolframnadel entlang der dorsalen Mittellinie und spreize die Körperwand. Bewegen Sie den Embryo in das Eindeckmedium. Entfernen Sie dann die inneren Organe, um die markierten

Neuronen

Übertragen Sie den Embryo auf einen neuen Objektträger, montieren Sie ihn und versiegeln Sie ihn.

Beobachten Sie unter einem differentiellen Interferenzkontrastmikroskop, wie Licht durch den Embryo dringt und ein hochauflösendes Bild erzeugt.

Die markierten Neuronen mit axonalen Projektionsmustern erscheinen dunkelbraun auf hellem Hintergrund.

Motoneuronen verzweigen sich in zwei Hauptnerven: den intersegmentalen und segmentalen Nerv und einen kleinen Ast, den Nervus transversal, der die Muskeln innerviert.

Um die Embryonen zu filetieren, inszenieren Sie sie auf einem Objektträger

Zuerst schieben Sie sie mit der Bauchseite nach oben in einen Tropfen Glycerin. Schneiden Sie dann unter einem Präpariermikroskop den vorderen Teil bei 1 Viertel der Körperlänge ab. Und entfernen Sie den hintersten Bereich, der frei von motorischen Axonen ist.

Bewegen Sie nun das Präparat mit einer Nadelsonde mit der dorsalen Seite nach oben aus dem Glycerin heraus und positionieren Sie es horizontal im Sichtfeld. Für den nächsten Schritt wird eine feine Wolframnadel benötigt, die in den Hohlbereich einer Nadelsonde eingeführt und dann am Ende gebogen wird. Machen Sie mit der Wolframnadel einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des Embryos und schneiden Sie die dorsale Mittellinie weiter ab.

Achten Sie darauf, dass die Spitze der Wolframnadel während des Sezierens nicht die Oberfläche des Objektträgers berührt, da sich die Nadel leicht gegen das Glas biegen kann.

Bringen Sie dann die Präparation mit der Sonde zurück in den Glycerintropfen und positionieren Sie sie mit der Rückenseite nach oben. Löse dort den Darm von der Körperwand, indem du jede Körperwand in ventraler Querrichtung entfaltest. Die beiden Körperwände sollten auseinander fallen. Schieben Sie nun mit der Sonde die Klappen der Körperwand vorsichtig auf einen Glasschieber. Verwenden Sie auf dem Objektträger eine Wolframnadel, um die inneren Organe zu entfernen, indem Sie sie seitlich drücken.

Um die Wolframnadel zu stabilisieren und vor Beschädigungen zu schützen, halten Sie die Hohlnadelsonden, die die Wolframnadel halten, gegen die Oberfläche des Objektträgers verspannt, während Sie die Wolframnadel manipulieren.

Montieren Sie nun die Präparate und 8 Mikroliter Einbettlösung auf einen neuen Objektträger. Bringen Sie ein Deckglas an und versiegeln Sie die Ränder mit normalem Nagellack. Nehmen Sie dann Bilder mit hoher Auflösung mit DIC-Optik auf.