Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die qualitative und quantitative Beurteilung von Axon-Arborisierungsmustern von Motoneuronen mit Hilfe eines Lichtblattmikroskops und einer Bildanalysesoftware an Mausembryonen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, die Entwicklung von Motoneuronen in Abstimmung mit komplexen Bewegungen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Axonverbarrungsmuster von Motoneuronen aus verschiedenen Blickwinkeln beobachten und abbilden und jeden einzelnen Nerv quantitativ analysieren können.

Das Verfahren wird von Ya-Ping Yen und Ee Shan Liau, zwei Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie die Embryonen einzeln in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter frisch zubereitetem 4%-Paraformaldehyd in PBS pro Vertiefung bei vier Grad Celsius auf einem Shaker über Nacht. Waschen Sie die fixierten Embryonen am nächsten Tag mindestens dreimal für jeweils fünf bis 10 Minuten mit einem Milliliter 1X PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Als nächstes permeabilisieren Sie jeden Embryo in einem Milliliter 0,5 % PBST über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Blockieren Sie jede Probe mit einem Milliliter 10%FBS, der über Nacht bei 4 Grad Celsius in 1X PBS auf einem Shaker hergestellt wurde. Anschließend wird jeder Embryo 72 Stunden lang unter ständigem Schütteln mit einem Milliliter Anti-GFP-Primärantikörper bei 4 Grad Celsius inkubiert.

Nach der Inkubation des Primärantikörpers waschen Sie jeden Embryo mit einem Milliliter 0,5 %PBST über einen Zeitraum von ein bis zwei Tagen bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Anschließend wird ein Milliliter Sekundärantikörper aufgetragen und über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius unter ständigem Schütteln inkubiert. Waschen Sie jeden Embryo am nächsten Tag mindestens dreimal bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen mit einem Milliliter 0,5 % PBST.

Inkubieren Sie dann jeden Embryo in einem handelsüblichen Clearing-Reagenz mit einem Brechungsindex von 1,49 nd in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das über Nacht bei Raumtemperatur vor Licht geschützt ist. Richten Sie 5X/0,1 Beleuchtungsoptiken und 5X/0,16 Detektionsoptiken ein. Montieren Sie den Probenhalter und die Probenkapillare.

Bereiten Sie die Probenkammer vor, indem Sie sie mit Reinigungslösung füllen. Um den Embryo zu montieren, bereiten Sie eine P200-Pipettenspitze vor, indem Sie den oberen Teil so abschneiden, dass er dem Durchmesser der Kapillare entspricht, und den spitzen Teil für den Probenaufsatz entfernen. Schmelzen Sie dann das abgestumpfte Ende der Pipettenspitze mit einer kleinen Flamme.

Löschen Sie die Flamme und befestigen Sie den Embryo schnell senkrecht am geschmolzenen Ende. Setzen Sie den oberen Teil der Pipettenspitze mit der Probenkapillare auf und setzen Sie die vorbereitete Probenkammer in das Mikroskop ein. Wählen Sie mit der Imaging-Software auf der Registerkarte "Lokalisieren" die Option "Kapillare lokalisieren" und passen Sie die X-, Y- und Z-Achsen an.

Wählen Sie als Nächstes Probe lokalisieren und zoomen Sie auf das 0,6-fache, um sich auf den Embryo zu fokussieren. Lassen Sie den Kammerpuffer einige Zeit mit dem Embryo ausgleichen, um Ablagerungen oder Blasen zu entfernen. Definieren Sie für die Bildaufnahme auf der Registerkarte Erfassung die Lichtwegparameter wie Detektivobjektive, Laserblocking-Filter, Strahlteiler, Kameras und Laser.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Pivot-Scan für die Schattenreduzierung. Definieren Sie dann die Erfassungseinstellungen: Bit Bepth auf 16 Bit, Zoom auf den Bereich zwischen 0,36 und 0,7X, Single-Site-Beleuchtung oder Dual-Site-Beleuchtung. Klicken Sie auf Kontinuierlich und legen Sie die Laserintensität, die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Position des Lichtblatts fest.

Drücken Sie anschließend Stopp, um die Bildaufnahme zu beenden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die transparente Probe innerhalb des kürzesten Lichtwegs positioniert ist, um eine detaillierte Aufnahme von Bildern von feinen Baumstrukturen auf einzelnen motorischen Nerven zu ermöglichen. Für eine mehrdimensionale Erfassung definieren Sie den Z-Stapel, indem Sie die Z-Position für das erste und letzte Bild verschieben.

Klicken Sie auf Optimal, um die Segmentnummer festzulegen. Klicken Sie dann auf Experiment starten, um den ausgewählten Z-Stapel abzurufen. Wenn dies erledigt ist, speichern Sie das Bild im czi-Format.

Um die Axonverbarrung zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatei in der imagining-Analysesoftware. Passen Sie die Bildfarbe, Helligkeit und den Kontrast im Fenster "Anzeigeanpassung" an, um Filamente basierend auf dem lokalen Intensitätskontrast zu erkennen. Klicken Sie anschließend auf das Symbol Neue Filamente hinzufügen und wählen Sie im Dropdown-Menü den Autopath-Algorithmus aus.

Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und definieren Sie dann die Start- und Ausgangspunkte, indem Sie die größten und dünnsten Durchmessermessungen zuweisen, die im Slice-Modus gemessen werden können. Weisen Sie einen Startpunkt am Rand des Interessenbereichs zu. Um das manuelle Hinzufügen oder Entfernen von Startpunkten zu erreichen, ändern Sie zuerst den Zeigermodus, navigieren Sie zu der Auswahl, und klicken Sie dann mit der Umschalttaste und der rechten Maustaste auf die Points of Interest.

Wählen Sie als Nächstes manuelle Schwellenwerte für Kernpunkte aus, um sicherzustellen, dass die gesamte sichtbare Baumbildung markiert ist. Fügen Sie dann Kernpunkte manuell hinzu oder entfernen Sie sie. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Getrennte Segmente entfernen und Kernpunkte um Startpunkte entfernen.

Passen Sie anschließend den Schwellenwert für die Hintergrundsubtraktion an und beenden Sie den Vorgang. Es ist notwendig, Hintergrundartefakte zu entfernen und zu bestätigen, dass der Detektorpfad die echte Axonverbarrung widerspiegelt, um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Wählen Sie am Ende den gewünschten Stil und die gewünschte Farbe aus.

Wählen Sie auf der Registerkarte Statistik die Option Detailliert aus und verwenden Sie Filamentnummer und Dendritenterminalpunkte, um die motorischen Nervenendigungen als Indikator für die motorische Axonverbarrung zu quantifizieren. Exportieren Sie dann das Bild des rekonstruierten Axons als TIFF-Datei. LSFM bietet eine detaillierte 3D-Visualisierung der motorischen Axon-Arborisation in Mausembryonen.

Motoneuronen werden dem oben beschriebenen Protokoll unterzogen und mit transgen-exprimiertem GFP markiert. Um die Axonvergrößerung detaillierter abzubilden und eine Quantifizierung durchzuführen, kann die Vergrößerung so angepasst werden, dass jede fein verdorbene Struktur sichtbar gemacht werden kann. Schließlich kann das Axon-Arborisierungsmuster einzelner Nerven der Vordergliedmaßen mit Hilfe von Bildanalysesoftware rekonstruiert werden.

Der Autopath-Algorithmus in der Software verfolgt das Filament und quantifiziert die Gesamtzahl der Axonterminals. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben vorbereitet und Motoneuronenaxone von Mausembryonen mit dem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop abbildet. Außerdem wissen Sie, wie Sie das Baumbildungsmuster jedes einzelnen motorischen Nervs mittels MRS quantitativ beurteilen können.