Name: Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung motorischer Axon-Navigation und die Quantifizierung der Axon-Arborisation in Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie. Diese Methode ermöglicht 3D-Analysen neuronaler Entwicklungsprozesse.

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LSFM Experimente und Datenanalyse wurden teilweise mit der fortschrittliche optische Mikroskope der Division of Instruments Service in Academia Sinica und mit Unterstützung von Frau Shu-Chen Shen durchgeführt. Wir danken Frau Sue-Ping Lee von Imaging Core Facility der IMB erhebliche technische Unterstützung für Imaris Bildanalyse. Die IMB wissenschaftlichen englischen Bearbeitung Kern überprüft das Manuskript. Diese Arbeit wird von Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), die meisten (104-2311-B-001-030-MY3) und NMRI (NMRI-EX106-10315NC) finanziert.

Alle lebende Tiere wurden in einen spezifischen Erreger frei (SPF) Tierhaus, zugelassen und beaufsichtigt durch die IACUC der Academia Sinica gehalten.
1. Fixierung
<ol><li>Embryonen von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) sammeln dann enthaupten und sie Ausweiden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Embryonen individuell 24-Well-Platten mit 1 mL/auch der frisch zubereitete 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) über Nacht. Inkubieren Sie bei 4 ° C in einen Shaker geben.</li>
	<li>Die festen Embryonen mindestens 3 x, jeweils für ca. 5-10 min, mit 1 mL 1 X PBS waschen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker, der restliche Paraformaldehyd zu entfernen.</li>
</ol>2. gesamte-Mount Immunostaining
<ol><li>Jeder Embryo in 1 mL 0,5 % permeabilize PBS-Triton-X-100 (PBST) über Nacht bei 4 ° C in einen Shaker geben.</li>
	<li>Jede Probe mit 1 mL 10 % bereitete FBS in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Embryo mit 1 mL Anti-GFP Primärantikörper (1:1, 000 Verdünnung in 10 % FBS) bei 4 ° C für 72 h mit ständigen Zittern um das GFP-Signal des motorischen Nerven zu intensivieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation Primärantikörper zu waschen, mit 1 mL 0,5 % PBST im Laufe von 1-2 Tagen bei 4 ° C auf einem Shaker, ändern die 0,5 % PBST mindestens dreimal.</li>
	<li>1 mL der Sekundärantikörper anwenden (1:1, 000 Verdünnung in 10 % FBS) und inkubieren Sie über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C mit konstanter schütteln.</li>
	<li>3 X mit 1 mL 0,5 % waschen PBST bei 4 ° C auf einem Boston-Shaker im Laufe von 2-3 Tagen. Halten Sie Proben mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C bis zum Vortag der Bildgebung. Hinweis: Embryonen können in kleinere Segmente vor der Lichtung, seziert werden, je nachdem, welcher Teil der Embryonen abgebildet werden. Vorderbeine sind in diesem versuchsansatz (Abbildung 1A) erhalten.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Embryo in einem kommerziellen Clearing-Reagenz mit einem Brechungsindex von 1,49 nD in einer 1,5 mL Tube, lichtgeschützt bei Raumtemperatur über Nacht, um den Embryo für die Bildgebung transparent zu machen. Hinweis: Die Lautstärke des Clearing-Reagenz ist etwa fünf Mal das Probenvolumen.</li>
</ol>(3) LSFM (2 – 3 h)
<ol><li>
Probe-Set-up
	<ol>
<li>Einrichten von 5 X / 0.1 Beleuchtungsoptik und 5 X / 0,16 Erkennung Optik. Montieren Sie der Probenhalter und Probe Kapillare (1,5 mm Innendurchmesser, grün) und legen Sie sie in das Mikroskop. Hinweis: Beziehen sich auf des Mikroskops Bedienungsanleitung für detaillierte Set-up-Verfahren.</li>
		<li>Montieren Sie den Embryo wie folgt:<ol>
<li>Bereiten Sie die PIPETTENSPITZE P200 durch den oberen Teil wegschneiden, so dass es den Durchmesser der Kapillare passt und entfernen Sie den Spitzen Teil (~ 3 mm) für die Beispiel-Anlage.</li>
			<li>Schmelzen Sie abgeschnittenen Ende der Pipettenspitze mit einer kleinen Flamme.</li>
			<li>Löschen der Flamme und schnell Befestigen des Embryos vertikal auf das geschmolzene Ende.</li>
			<li>Passen Sie den oberen Teil des die PIPETTENSPITZE mit der Probe Kapillare.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Erlauben Sie des Kammer-Puffers, mit dem Embryo für 1 min, klar aus Schutt oder Luftblasen equilibrate.</li>
		<li>Über die imaging-Software, wählen Sie Locate Kapillare unter der Registerkarte " Suchen " und passen Sie die X, y, Z-Achsen, die Probe Kapillare zu positionieren.</li>
		<li>Wählen Sie Locate Probe und Zoomen Sie, um 0,6 X auf den Embryo zu konzentrieren. Drehen Sie den Embryo um sicherzustellen, dass die Längsachse des abgebildeten Gliedes mit den Lichtweg der zwei Lichtquellen (Abbildung 1 b) richtet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bildaufnahme
	<ol>
<li>Unter der Registerkarte " Übernahme " der Lichtweg Parameter wie Erkennung Ziele definieren, laser-blocking Filter, Strahlteiler, Kameras und Lasern. Hinweis: Der GFP-Kanal wird in diesem Experiment verwendet (Erregung Wellenlänge: 488 nm; Emission Filter: BP 505, 545 nm, Strahlteiler: SPS LP 560).</li>
		<li>Das Kontrollkästchen Sie Pivot-Scan für Schatten-Reduktion.</li>
		<li>Definieren Sie die Einstellungen der Akquisition: bit-Tiefe, 16-Bit; Zoom, 0,36-0,7 X; einseitige Beleuchtung (links/rechts) oder Dual-Side-Beleuchtung.</li>
		<li>Klicken Sie auf fortlaufend und legen Sie die Laserintensität, Belichtungszeit, Laserleistung und leichte Blatt Position um schärfere Bilder zu erwerben. Hinweis: Die Laserleistung bleibt so gering wie möglich zu lichtbedingten zu minimieren.</li>
		<li>Drücken Sie STOP um Ende Bildaufnahme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mehrdimensionale Erfassung
	<ol>
<li>Definieren Sie die Z-Stapel durch die Z-Position für das erste und letzte Bild verschieben. Klicken Sie auf Optimal um die Slice-Nummer festzulegen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Experiment starten , um die ausgewählten Z-Stapel zu erwerben.</li>
		<li>Wenn es fertig ist, speichern Sie das Bild im .czi-Format.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bildverarbeitung (optional)
	<ol>
<li>Fahren Sie mit der doppelten Seite Fusion unter dem Ärmelkanal Lichtscheibe Verarbeitung , wenn Dual-Side Beleuchtung angewendet wird. MultiView Verarbeitung ist erforderlich, wenn mehrere Ansichten erworben werden, um Bilder aus unterschiedlichen Blickwinkeln zu kombinieren.</li>
		<li>Erstellen Sie ein 2D-Bild mit Daten aus der höchsten Intensität Pixel entlang der Projektion-Achse unter der Maximalen Intensität Projektion -Kanal.</li>
		<li>Klicken Sie unter Kopie Kanal Teilmenge um Teilmengen von Bildern aus der ursprünglichen Gruppe auszuwählen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Quantifizierung der Axon Arborization (30 Min für jeden einzelnen Nerv)
<ol><li>Öffnen Sie die Bilddatei in der bildgebenden Analysesoftware (standardmäßig das Bild mit den XYZ-Daten ist geöffnet im Surpass-Modus sowie eine 3D-gerenderte Ansicht).</li>
	<li>Passen Sie das Bildfarbe, Helligkeit und Kontrast Displayanpassung Fenster (Bearbeiten | Displayanpassung zeigen), Filamente, die basierend auf lokalen Intensität Kontrast zu erkennen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol Hinzufügen neue Filamente und wählen Sie den Autopath (kein Loop) -Algorithmus in der Drop-Down-Menü.</li>
	<li>Wählen Sie die Region von Interesse (in diesem Fall, die Segmentierung Axon von Interesse). Klicken Sie auf nächste Wenn Sie fertig sind.</li>
	<li>Definieren Sie die Start- und Samen Punkte zuweisen die größten und dünnste Durchmesser Messungen, die mit dem Slice -Modus gemessen werden kann.</li>
	<li>Weisen Sie einen Ausgangspunkt am Rand der Region von Interesse. Um manuell hinzufügen oder Entfernen von Ausgangspunkte zu erreichen, ändern Sie zunächst den Zeiger-Modus (Navigate | Wählen Sie) und dann bei gedrückter Umschalttaste mit der rechten Maustaste auf die Punkte des Interesses.</li>
	<li>Wählen Sie manuelle Schwellenwerte für Kontrollpunkte um sicherzustellen, dass alle sichtbaren Arborization markiert ist. Ändern Sie den Zeiger-Modus (Navigate | Wählen Sie) und dann Shift + Linksklick auf die Punkte des Interesses, manuell hinzufügen oder Entfernen von Ausgangspunkten. Hinweis: Es ist wichtig, manuell Hintergrundgeräusche und Signale von benachbarten Nerven entfernen.</li>
	<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kontrollpunkte um Ansatzpunkte zu entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie, um Ausgrenzung von Punkten zu ermöglichen, sind zu weit weg und darstellen, die Hintergrundgeräusche, Entfernen Segmente getrennt . Geben Sie die Maximallänge der Lücke im nächsten Schritt definieren die Obergrenze für den Ausschluss.</li>
	<li>Passen Sie den Schwellenwert für Hintergrundabzug, die einen Gauß-Filter verwendet, um die hintergrundintensität jedes Voxel zu schätzen.</li>
	<li>Festlegen Sie automatische Schwellenwert für Dendrit Durchmesser mit dem ungefähren Querschnitt Algorithmus.</li>
	<li>Überspringen Sie die Schritte für die Berechnung der Wirbelsäule.</li>
	<li>Beenden Sie den Vorgang, und wählen Sie den gewünschten Stil und Farbe.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Kontrollkästchen der Lautstärke in Eigenschaften , um nur die rekonstruierten Axone anzuzeigen.</li>
	<li>Wählen Sie unter der Registerkarte " Statistik " detailliert. Verwenden Sie Filament Nein. Dendrit Terminal Punkte zu die motorischen Nerv Klemmen als Indikator für motor Axon Arborization zu quantifizieren. Hinweis: Statistische Anmerkungen hinzugefügt werden kann falls gewünscht.</li>
	<li>Exportieren Sie das Bild der rekonstruierten Axon als .tif Datei.</li>
</ol>

<ol><li>Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24449832">How to make spinal motor neurons.</a> Development. 141, 491-501 (2014).</li>
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<li>Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet-based+fluorescence+microscopy+for+three-dimensional+imaging+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).</li>
<li>Pantazis, P., Supatto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+whole-embryo+imaging%3A+a+quantitative+transition+is+underway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).</li>
<li>Reynaud, E. G., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+first+light+sheet+based+fluorescence+microscopy+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop.</a> Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mehrere Schritte im Protokoll können unter bestimmten Umständen Änderungen unterzogen werden. Zum Beispiel hängt die Dauer der Fixierung auf das Alter des Embryos, variierend von 2 h bis 1 oder mehrere Tage mit frisch zubereiteten Paraformaldehyd. Da Fixierung vor dem ganzen Berg Immunostaining für Antikörper durchgeführt wird, die empfindlich auf Protein Vernetzung kann Methanol als alternative Fixativ Agent verwendet werden. Für ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis bei der Färbung, ist es notwendig, die Waschmittel Konze...

Spinale MNs sind der Teil des zentralen Nervensystems aber innervieren peripheren Muskeln, um die Bewegung zu kontrollieren. Entwickelnden Rückenmarks sind nach den Signalen aus der Chorda und angrenzenden Somiten MN Stammväter (pMNs) gegründet. Alle differenziert nach dem mitotischen MNs entstehen dann von pMNs, was schließlich zu einer Reihe von MN Subtypen der Rostrocaudal Achse des Rückenmarks1,2. Spinale MNs sind topographisch und anatomisch gut organisiert. Ihre morphologische Anordnung korreliert mit der Position von ihrem jeweiligen Ziel in der Peripherie-3. Bei ihren Muskel-Ziele zu erreichen, Axone erhalten zellularen und exogene neurotrophen Faktoren, die bewegen sie zum Erweitern und verzweigen weiter in die Muskeln. Innervation und verzweigte Mängel können zum Versagen, neuromuskuläre Kreuzungen (NMJ) bilden beitragen. Z. B. Glia-derived neurotrophen Faktoren (GDNF)-induzierte Pea3 ist unverzichtbar für Axon Arborization in kutane Maximus (CM) und Latissimus Dorsi (LD) Muskeln4,5. Darüber hinaus zeigen DINE -Knockout-Maus-Embryonen defekt Arborization phrenicus Nerven des Zwerchfells, wodurch respiratorische Insuffizienz und Sterblichkeit unmittelbar nach Geburt6,7. Daher ist dieser letzte Schritt der MN Reifung (d.h., axonale Projektion und Verzweigung) entscheidend für die Kommunikation zwischen Neuronen und Zielzellen zu gewährleisten.
Um Arborization Muster zu sehen, führen die Forscher normalerweise konfokale Bildgebung oder zwei-Photonen-Fluoreszenz Lichtmikroskopie geschnitten oder ganz-Mount Proben8,9,10. Beide dieser Mikroskopie-Techniken erzeugen akzeptable Auflösung und Tiefe Penetration. Zwei-Photonen-Fluoreszenz Lichtmikroskopie beinhaltet Erregung des Fluorophore durch gleichzeitige Aufnahme von zwei energieärmeren Photonen11. Da zwei-Photon Erregung Nah-Infrarot-Strahlung verwendet, trägt die verminderte Erregerfrequenz reduzierte Streuung und bessere Gewebe eindringen bis zu 1 mm im Gewebe, wodurch die Bildgebung mit größerer Tiefe. Konfokalen Mikroskopie wird durch Filter, die der Out-of-Focus-Signale und sammelt nur Licht in die Brennebene12,entfernt. Mit diesem Ansatz können Bilder von Proben aus verschiedenen fokalen Ebenen kombiniert werden, um ein dreidimensionales (3D) Bild über eine Z-Stapel-Funktion zu produzieren. Dennoch wird Signalintensität reduziert, da die meisten des Lichtes ist blockiert und hohe numerische Öffnungen die Depth of Field verdecken. Noch wichtiger ist, beitragen beide Techniken zur schweren lichtbedingten und Phototoxizität, da die gesamte Probe Beleuchtung erhält, selbst wenn nur in einer Ebene zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird.
Um diese Unzulänglichkeiten zu umgehen, ist LSFM eine bevorzugte Alternative, mit den Vorteilen des Seins schnelle, effiziente Licht- und weniger phototoxische13,14geworden. Darüber hinaus ermöglicht LSFM MV Bildgebung. Dieser Ansatz eignet sich besonders zur motorischen Axone und ihre Dispergier-Terminals zu visualisieren, wie sie durch den 3D Raum zu verbreiten. LSFM übertrifft die anderen beiden Optionen, weil Proben auf einer Bühne, die Drehung um eine vertikale Achse und Bewegungen entlang der x-, y- und Z-Achsen ermöglicht, montiert sind. Dieses Set-up ermöglicht nicht nur minimal blockierte Blick auf die Probe, sondern auch die Wahl eines Pfades wünschenswert Beleuchtung, ein Manko der zwei-Photonen und konfokale Mikroskopie, beide in der Montage von Proben auf einer flachen Folie benötigen. LSFM ist daher das am besten geeignete Werkzeug für die 3D Darstellung von Axon Arborization und zur Quantifizierung der motorische Nerv Terminals in mausembryonen.

<table><tbody><tr><td>Hb9::GFP</td><td>Das Jackson-Laborlabor</td><td>005029</td><td>Embryonen vom Embryonaltag 12.5 (E12.5)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (PFA)</td><td></td><td></td><td>Für 200ml: Fügen Sie 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH (10N) auf 7,4 ein. Filter, sterilisieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Für 1L: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 hinzufügen und mit ddH2O auffüllen. Autoklavieren und lagern bei RT.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Schafe polyklonales Anti-GFP</td><td>AbD Serotec</td><td>4745-1051</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Schaf</td><td>Invitrogen</td><td>A-11015</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>RapiClear 1.49 Clearing-Reagenz</td><td>SunJin Lab</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>1,5ml Mikro Rohr</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>24 Vertiefungen Platte</td><td>ThermoFisher</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>5 SA Pinzette</td><td>ideal-tek</td><td>3480641</td><td></td></tr><tr><td>Iris Schere striaght scharf/scharf</td><td>Aesculap</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgie Skalpelle, zum Einmalgebrauch</td><td>Aesculap</td><td>BA365</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TKS</td><td>RS-01</td><td></td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.0 Bildanalysesoftware</td><td>Bitplane, Zürich, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP Mäuse)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005029</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von motorischen axon navigation und quantifizierung der axon arborization in mausembryonen mit fluoreszenz-lichtblattmikroskopie

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinalen motorischen Neuronen (MNs) verlängern ihre Axone zur Kommunikation mit ihren innervating Ziele, wodurch die Steuerung Bewegung und komplexe Aufgaben in Wirbeltieren. Daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der wie Motor Axone zu navigieren, arborize und die peripheren Muskeln innervieren richtet sich während der Entwicklung und Degeneration zu entdecken. Obwohl transgene Mauslinien Hb9::GFP lange gedient haben, motorischen Axon Trajektorien während der Embryonalentwicklung zu visualisieren, detaillierte Beschreibungen der das gesamte Spektrum der Axon terminal Arborization blieben unvollendet aufgrund der Komplexität der Muster und Einschränkungen der aktuellen optische Mikroskopie. Hier beschreiben wir eine verbesserte Protokoll, die leichte Blech-Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) und robuste Bildanalyse, qualitativ und quantitativ zu visualisieren, Entwicklung von motorischen Axone verbindet. Dieses System kann leicht angenommen werden, um genetische Mutanten oder MN Krankheitsmodelle mit Hb9::GFP Linien, enthüllt neuere Molekulare Mechanismen, die zu defekten motor Axon Navigations-und Arborization führen zu überqueren.

LSFM bietet detaillierte 3D Visualisierung von MN Flugbahn und Axon Arborization Maus Embryonen. Unter Hellfeld erscheinen nach dem Eintauchen in das kommerzielle Clearing-Reagenz Gewebe vollständig transparent. Keine Schrumpfung oder Schwellung der Probe wurde nach der Lagerung bei der Aufklärung von Reagenz vor Bildgebung bis zu einer Woche bemerkt. Unter Fluoreszenz Kanal sind Motoneuronen mit Transgen ausgedrückt GFP (Film 1) gekennzeichnet. In einer Instanz sind Deta...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung von Motoneuron-Projektion und Axon Arborization in transgenen Hb9::GFP -Maus-Embryonen. Nach Immunostaining für Motoneuronen verwendeten wir Fluoreszenz lichtblattmikroskopie Bild Embryonen für anschließende Quantitative Analyse. Dieses Protokoll gilt für andere Neuron Navigation Prozesse in das zentrale Nervensystem.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die qualitative und quantitative Beurteilung von Axon-Arborisierungsmustern von Motoneuronen mit Hilfe eines Lichtblattmikroskops und einer Bildanalysesoftware an Mausembryonen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, die Entwicklung von Motoneuronen in Abstimmung mit komplexen Bewegungen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Axonverbarrungsmuster von Motoneuronen aus verschiedenen Blickwinkeln beobachten und abbilden und jeden einzelnen Nerv quantitativ analysieren können.Das Verfahren wird von Ya-Ping Yen und Ee Shan Liau, zwei Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie die Embryonen einzeln in einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter frisch zubereitetem 4%-Paraformaldehyd in PBS pro Vertiefung bei vier Grad Celsius auf einem Shaker über Nacht. Waschen Sie die fixierten Embryonen am nächsten Tag mindestens dreimal für jeweils fünf bis 10 Minuten mit einem Milliliter 1X PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Als nächstes permeabilisieren Sie jeden Embryo in einem Milliliter 0,5 % PBST über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Sh

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Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung des axonalen Transports in Motoneuronen mit Hilfe eines mikrofluidischen Kammersystems. Dabei wird embryonales Rückenmarksgewebe von Mäusen in polymerbeschichteten Vertiefungen mit Nährmedium kultiviert, um das axonale Wachstum zu induzieren. Die Bewegung von fluoreszierenden Farbstoff-gefärbten Organellen in der Live-Bildgebung bestätigt den bidirektionalen axonalen Transport.

Verfolgung des axonalen Transports von Organellen in Motoneuronen mit einem mikrofluidischen Gerät

Source: Liau, E. S. et al. Visualisierung der motorischen Axonnavigation und Quantifizierung der Axon-Arborisierung in Mausembryonen mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. J. Vis. (2018). Dieses Video zeigt die Verwendung von Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zur Abbildung von Motoneuronenprojektionen und Axonverzweigungen in transgene Mausembryonen. Es beschreibt die Schritte bei der Probenvorbereitung, der Bildgebung und der 3D-Rekonstruktion axonaler Verzweigungen zur Beurteilung des...

Visualisierung von Motoneuronenprojektionen und Axonverzweigungen mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Quelle: Boyer, N. P. et. al., Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports im exzidierten Tibianerv der Maus. J. Vis. exp. (2020) Dieses Video zeigt die Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethode zur Analyse Neurofilamenttransport in myelinisierten Axonen peripherer Nerven. Durch die Verfolgung von photoaktivierten grünen Fluorophor-markierten Neurofilamenten ermöglicht die Technik Einblicke in den axonalen Transport bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Fluoreszenz-Photoaktivierungsbildgebung des Neurofilamenttransports in myelinisierten Mausaxonen 

Quelle: Jeong, S. Visualisierung des axonalen Projektionsmusters embryonaler Motoneuronen in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Visualisierung von axonalen Projektionen in Drosophila Embryonen. Die Immunmarkierung von Motoneuronen, die präzise Dissektion zur Freilegung neuronaler Strukturen und die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen zusammen eine detaillierte neuronale Architektur, wobei die axonalen Projektionsmuster hervorgehoben werden.

Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Wir präsentieren hier ein optimiertes Protokoll zur Genotypisierung, Färbung und Vorbereitung fötaler Mäuse für die Bildgebung von peripheren Nozizeptoren-Axonprojektionen im gesamten Tier, als effektive Methode zur Beurteilung sensorischer Axonwachstumsphänotypen bei der Entwicklung gentechnisch veränderter Mäuse.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die Visualisierung motorischer Axon-Navigation und die Quantifizierung der Axon-Arborisation in Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie. Diese Methode ermöglicht 3D-Analysen neuronaler Entwicklungsprozesse.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

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