Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die dynamischen phänotypischen Reaktionen heterozellulärer Populationen auf Pertubationen unter Unterscheidung zwischen Subpopulationen quantitativ zu bewerten. Die meisten physiologischen Wechselwirkungen finden in Gegenwart mehrerer Zelltypen statt. Mit dieser Methode können Zellbiologen beurteilen, wie heterogene Zellen auf identische Umwelteinflüsse reagieren und wie sich unterschiedliche Zellen gegenseitig beeinflussen.

Diese Technik hat mehrere Vorteile: Sie unterscheidet zwischen mehreren Zelltypen, sie ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Subpopulationen, einschließlich Geburten- und Sterberaten und morphologischer Dynamik. Während dieses Protokoll zur Untersuchung vieler biologischer Prozesse verwendet werden kann, werden wir den Arbeitsablauf anhand von H3255-Tumorzellen und CCD19LU Fibroblastenzellen demonstrieren, die mit Erlotinib, einem Chemotherapeutikum, behandelt wurden. Nachdem Sie die Zellsuspensionen in Röhrchen gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, drehen Sie die Röhrchen zunächst um, um die Zellen in Lösung zu mischen und die Aussaat zu standardisieren.

Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter jeder Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 10 Mikroliter Trypanblau hinzu. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Lösung in einen Objektträger für die Zellzählung und führen Sie den Objektträger in einen automatisierten Zellzähler ein. Wiederholen Sie die Zellzählung mindestens dreimal oder bis die erhaltenen Zählungen konsistent sind.

Mit einer Mehrkanalpipette säen Sie insgesamt 1.500 Zellen in 100 Mikrolitern RPMI in den Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Plattieren Sie jede Zellsuspension in dreifacher Ausfertigung mit identischen Plattenanordnungen für jeden Zeitpunkt. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.

Fügen Sie DMSO zu Erlotinib-Pulver hinzu, um eine 10 millimolare Erlotinib-Stammlösung herzustellen. Verwenden Sie dann das Zellkulturmedium, um das Arzneimittel auf das Zweifache der höchsten Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu verdünnen. Verdünnen Sie das Medikament viermal seriell im Verhältnis 1:10, für insgesamt fünf Wirkstoffkonzentrationen und eine Kontrolle ohne Arzneimittel.

Pipettieren Sie 100 Mikroliter Arzneimittellösung in die entsprechenden Vertiefungen der 96-Well-Zellplatte für eine endgültige Arzneimittelkonzentration von 1x verdünnt in Medium. Um die Zellen für die fluoreszenzbasierte Klassifizierung zu färben, bereiten Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter Kernfärbung und fünf mikromolare Totzellfärbung in PBS vor. Für die morphologische Klassifizierung bereiten Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Kernfärbung, fünf mikromolare Totzellfärbung und fünf mikromolare Zellfärbung in PBS vor.

Geben Sie 20 Mikroliter Farbstofflösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Proben dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius lichtgeschützt. Um Bilder aufzunehmen, wischen Sie den Boden der Platte mit 70 % Ethanol ab und legen Sie die Platte in die Bildgebungskammer.

Klicken Sie auf der Registerkarte "Einrichten" unter "Kanalauswahl" auf die Plus-Schaltfläche, um dem Bild die entsprechenden Kanäle hinzuzufügen. Legen Sie unter Layoutauswahl alle zwei Mikrometer einen Z-Stapel von Testbildern fest, beginnend bei null Mikrometern und endend bei 20 Mikrometern, um die Fokusebene zu identifizieren. Klicken Sie unter jedem Kanal auf Schnappschuss, um die Intensitäten zu bewerten und die Belichtungszeiten zu optimieren.

Geben Sie je nach Bedarf höhere oder niedrigere Werte unter Zeit ein. Die Zellkerne müssen fokussiert sein, um die Genauigkeit der nachgelagerten Analyse zu gewährleisten. Markieren Sie im Plattenschema die entsprechenden Vertiefungen.

Markieren Sie dann im Bohrlochschema die 25 Felder, die auf ähnliche Weise abgebildet werden sollen. Identifizieren Sie unter Experiment ausführen die Platte im Plattennamen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Start, um das Bildaufnahmeprotokoll mit einem 10-fachen Objektiv auszuführen und Graustufen-TIFF-Bilder in den ausgewählten Kanälen zu erzeugen. Öffnen Sie nach der Installation der Open-Source-Software CellProfiler und der CellProfiler-Analyse CellProfiler, klicken Sie auf Datei, Importieren, Pipeline aus Datei und wählen Sie die entsprechende Datei aus.

Wählen Sie die fluoreszenzbasierte Klassifizierungspipeline aus, um Zellen basierend auf der EGFP-Intensität entweder als H3255 oder CCD19LU zu klassifizieren und morphologische Merkmale zu berechnen. Klicken Sie auf Ausgabeeinstellungen anzeigen und wählen Sie dann den Speicherort der Bilddateien für die Analyse und das Ziel für die extrahierten Daten aus. Vor dem Ausführen der Analyse sollte das Protokoll im Testmodus getestet werden, um die Parameterwerte zu überprüfen.

Es ist wichtig, dass die nukleare und zelluläre Segmentierung genau ist. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zellen mit unterschiedlichen Zellkernfärbungen zu identifizieren und sicherzustellen, dass der Pixelwert, um den die Zellkerne erweitert werden, groß genug ist, um die Zellkerne mit der höchsten DNA-Färbung zu maskieren, aber klein genug, um die umgebenden Kerne nicht zu maskieren. Um Populationen basierend auf der Fluoreszenz zu klassifizieren, skalieren Sie zunächst den GFP-Intensitätsbereich neu, messen Sie dann die GFP-Intensität jedes identifizierten Kerns und klassifizieren Sie Objekte basierend auf einem benutzerdefinierten Schwellenwert.

Klicken Sie anschließend auf Bilder analysieren, um die Analyse zu starten. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wechseln Sie zum Standardausgabeordner, um die berechneten Daten anzuzeigen. Für eine morphologiebasierte Klassifizierung führen Sie das entsprechende Protokoll im Cell Profiler aus, um Morphologiemerkmale der gesamten Zelle zu generieren.

Öffnen Sie die Cell Profiler Analysis-Software, wählen Sie die in Cell Profiler generierte Datenbankeigenschaftendatei aus und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf die Registerkarte Klassifikator oben links auf dem Bildschirm. Um zufällige Zellbilder aus dem Experiment aufzurufen, klicken Sie auf Abrufen, die Bilder werden im nicht klassifizierten Fenster angezeigt.

Klassifizieren Sie Zellen manuell als positiv oder negativ, was hier H3255 oder CCD19LU darstellt, indem Sie Zellen auswählen und in den entsprechenden Abschnitt ziehen. Nachdem Sie mindestens 50 Zellen pro Teilauffüllung klassifiziert haben, klicken Sie auf Klassifizierer trainieren und dann auf Fortschritt überprüfen. Klicken Sie abschließend auf Alle bewerten, um eine Tabelle mit der Zellenanzahl für jede Teilpopulation zu erstellen.

In einer heterozellulären Kaltkultur von H3255-Tumor- und CCD19LU Fibroblastenzellen wurden Zellkerne identifiziert und anhand von DNA-Färbungen segmentiert. Die Zellpopulationen wurden entweder durch künstlich induzierte Fluoreszenz oder durch Training in einem Algorithmus des maschinellen Lernens klassifiziert, um Zelltypen basierend auf morphologischen Unterschieden zu identifizieren. Es besteht eine hohe Übereinstimmung zwischen der Fluoreszenz- und der morphologiebasierten Methodik.

Die beiden Klassifikationsmethoden wurden unabhängig voneinander auf dieselben Bilder bezogen und stimmten zu 97,4 % bzw. 92,5 % in der unbehandelten und behandelten Population überein. Hier wurden Veränderungen in der Zellmorphologie und das Ansprechen auf die Behandlung mit Erlotinib untersucht. Nach dreitägiger medikamentöser Behandlung wurde bei den H3255-Zellen eine Abnahme der Zellkernfläche und eine Zunahme der Zellfläche beobachtet.

Möglicherweise war dies auf den Zelltod zurückzuführen. Um zu testen, ob Erlotinib eine zytotoxische oder zytostatische Wirkung auf Zellen hat, wurden tote Zellen anhand der Propidiumiodid-Färbung identifiziert. Es wurden sowohl zytotoxische als auch zytostatische Wirkungen von Erlotinib auf H3255-Zellen beobachtet, wobei die Zahl der Todesfälle zunahm und die Zahl der Geburten nach medikamentöser Behandlung abnahm.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei nicht aufeinanderfolgenden Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie RA-Interferenz oder CRISPR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zur Erforschung der funktionellen Genomik zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsbiologie, um den Einfluss von Stromazellen auf das Fortschreiten des Tumors bei mehreren Krebsarten zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man heterozelluläre Reaktionen auf Umweltreize untersucht, insbesondere wie man mikroskopiebasierte Bildgebungsdaten mit hohem Durchsatz analysiert.