Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Diese Methode kann bei einer Schlüsselfrage im Bereich der Stammzelltechnik helfen, z. B. bei der Frage, wie die zelluläre Mikroumgebung die zellulären Phänotypen und Funktionen verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Zellen mehrere künstlich geschaffene Umgebungen in einer einzigen Platte bietet, die Sie mit einer herkömmlichen Methode auf Mikrokontaktplatten nicht durchführen könnten. Die Techniker Koki Yoshimoto und Risako Sakai aus unserem Labor werden dieses Verfahren demonstrieren. Nach der Erstellung von 3D-Bildern von Masken für Nanofaser-Arrays und Formen aus mikrofluidischen Strukturen gemäß dem Textprotokoll.

Verwenden Sie einen 3D-Drucker, um die Masken und die Form zu drucken. Zur Herstellung von Polymerlösungen für das Elektrospinnen wird 13 Prozent PMGI-Flüssigkeit mit Tetrahydrofuran auf neun Prozent verdünnt. Lösen Sie 0,08 Gramm PS in einem Volumenverhältnis von eins zu eins von THF zu Dimethylformamid und bringen Sie das Volumen mit einem flüssigen Regenten auf das endgültige von einem Milliliter PS-Lösung von acht Gewichtsprozent pro Volumen.

Lösen Sie 0,1 Gramm GT in Wasser, saurer Säure und Ethylacetat und verwenden Sie die gemischte Lösungslösung, um das Volumen auf das endgültige Volumen von einem Milliliter von 10 Volumenprozent GT-Lösung zu bringen. Anschließend scheidet man mit einer Magnetron-Sputtermaschine eine fünf Nanometer dicke Platinschicht auf eine Polystyrol-Grundplatte auf, die als Kathode im Elektrospinnaufbau dient. Laden Sie jede Polymerlösung in eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 23-Gauge-Nadel aus Edelstahl ausgestattet ist.

Verankern Sie dann die Spritzen auf einer Spritzenpumpe in einem Abstand von 12 Zentimetern zum Auffangbehälter der Elektrospinnvorrichtung. Schließen Sie die Spritzennadel an ein Hochspannungsnetzteil an und stellen Sie diese auf 11 Kilovolt ein. Stellen Sie dann die Pumpleistung auf 20 Milliliter pro Stunde ein und halten Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit bei 30 Grad Celsius bzw. weniger als 30 Volumenprozent.

Lege nun die Maske auf die Grundplatte. Stellen Sie dann durch die Löcher der Maske Nanofasern mit unterschiedlichen Dichten auf der Grundplatte her, indem Sie die Elektrospinnzeit ändern. Entfernen Sie die Maske von der Grundplatte und wiederholen Sie die Nanofaserherstellung.

Wenn das Array fertig ist, legen Sie es 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius in einen Exsikkator, um das restliche Lösungsmittel zu verdampfen. Um die GT-Nanofasern zu vernetzen, behandeln Sie sie mit 0,2 molaren EDC und 0,2 molaren NHS in Ethanol. Und inkubieren Sie die Proben vier Stunden lang bei 25 Grad Celsius.

Zum Spülen der GT-Nanofasern verwenden Sie zweimal 99,5 Prozent Ethanol und trocknen die Platten 16 Stunden lang bei 25 Grad Celsius im Vakuum. Um mikrofluidische Strukturen herzustellen, mischen Sie 2 Gramm PDMS-Härter und 20 Gramm PDMS-Base. Gießen Sie dann die Pre-PDMS-Mischung auf die fertige Form.

In einem Exsikkator wird das Pre-PDMS-Gemisch 30 Minuten lang entgast. Anschließend die Pre-PDMS-Mischung im Ofen bei 65 Grad Celsius 16 Stunden lang aushärten. Um Macme-Arrays zusammenzubauen, ziehen Sie die ausgehärtete PDMS-Struktur von der Form ab und verwenden Sie 70 Prozent Ethanol, um sie zu reinigen.

Entladen Sie dann die atmosphärische Korona an der Unterseite der PDMS-Struktur. Montieren Sie schnell die PDMS-Struktur mit dem Nanofaser-Array. Dann die Montage zwei Tage lang bei 65 Grad Celsius im Ofen backen.

Mit DPBS werden H9HESCs gewaschen, die auf einer 35-Millimeter-Schale kultiviert wurden. Geben Sie dann 0,5 Milliliter rekombinante Trypsin-Lichtprotease in die Schale und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Die überstehende Proteasemischung vorsichtig ansaugen.

Fügen Sie sofort HPSC-Medium hinzu und geben Sie das Medium wiederholt vorsichtig gegen die Oberfläche der Schale, um die Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie dann die abgelösten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen drei Minuten lang bei einer 200-fachen Schwerkraft.

Der Überstand wird aspiriert und die Zellen werden in vorgewärmtem HPSC-Medium suspendiert. Pipettieren Sie dann 12 Mikroliter der Zellsuspension in jede mikrofluidische Kammer. Nach der Fluoreszenzmarkierung der Zellen gemäß dem Textprotokoll lösen Sie die mikrofluidische PDMS-Struktur vom Macme-Array ab.

Entfernen Sie dann das restliche PBMS aus dem Macme-Array, geben Sie 90 Prozent Glycerin in PBS zu den gefärbten Zellen und bringen Sie ein Deckglas an. Zum Schluss stellen Sie die Platte kopfüber auf den Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops. Und verwenden Sie die Mikroskop-Bildgebungssoftware, um 12-Bit-Farbbilder aufzunehmen.

Hier sind Immunfluoreszenzbilder von H9HPSCs zu sehen, die bei hoher anfänglicher Aussaatdichte auf Gelatine-Nanofasern kultiviert und mit 3 zellulären phänotypischen Markern gefärbt wurden. Die SOM-Analyse wurde verwendet, um hochdimensionale multiparametrische Datensätze in niedrigdimensionale 2D-Karten umzuwandeln, um die Homogenität und Heterogenität der Expressionsniveaus für die vier phänotypischen Marker in jedem Datensatz zu vergleichen, und für die SOM-Knoten wurde ein unüberwachtes hierarchisches Clustering durchgeführt. Wie hier angedeutet, zeigten alle Gruppen eine höhere Expression von OCT4 als auf der Basalmembran-Gel-Matrix (MG). Gruppe eins zeigte hohe EdU-Signale, was darauf hindeutet, dass die meisten Zellen aktiv proliferierten.

Daher waren Mikroumgebungen in Gruppe eins für die HPSC-Erhaltung geeignet, da sich undifferenzierte HPSCs schnell vermehren, wenn die Zellzykluslückenphasen verkürzt wurden. Gruppe zwei umfasste Zellen, die mit einer unzureichenden Anfangsdichte ausgesät wurden, und Zellen, die auf 2D-GT-Gerüsten gezüchtet wurden, die die HPSC-Selbsterneuerung nicht unterstützten. Zum Beispiel ging das EdU-Signal dieser Probe verloren und die Annexin-V-Spiegel waren leicht erhöht, was darauf hindeutet, dass die Zellen ihre Stammzellen verloren hatten und allmählich apoptotisch geworden waren.

PMGI MidNF HighCD aus Gruppe drei, die die Mikroumgebungen der PMGI-Nanofasermatrizen darstellt, zeigte die größeren Schwankungen der OCT4- und EdU-Signale im Vergleich zu den anderen Bedingungen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für den Forscher auf dem Gebiet der STAMMZELLEN, das Tissue Engineering und das fortschrittliche Screening zu erforschen.