Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Hallo, mein Name ist Dai Mitsushima. Hier zeigen wir Ihnen, wie man Gehirnschnitte an trainierten Tieren herstellt, indem wir Patch-Clamp-Daten an nicht trainierten Tieren vergleichen. Wir können die lerninduzierte synaptische Plastizität analysieren.

Hallo, mein Name ist Hiroyuki Kida. In diesem Experiment untersuchten wir den neuromechanischen Hintergrund des motorischen Laufverhaltens mithilfe des Rotarod-Tests. Der Rotarod-Test wird häufig verwendet, um die motorische Leistungsfähigkeit von Nagetieren zu bewerten.

Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass wir während des Tests das Erkennungsniveau erhöhen können, indem wir die Rotorgeschwindigkeit steigern. Rotorstab-Test. Vor der motorischen Aufgabe sollte die Rotorstab-Apparatur auf beschleunigenden Modus von 4 bis 40 U/min über einen Zeitraum von 300 Sekunden eingestellt werden.

Die Ratten wurden zehn Versuche pro Test durchführen lassen. Zwischen den Versuchen lag ein Zeitintervall von 30 Sekunden. Während der ersten Trainingssitzung fallen die Ratten gewöhnlich vom Stab, selbst bei niedrigen Geschwindigkeiten, und laufen manchmal in die falsche Richtung.

Nach wiederholtem Training kann die Ratte jedoch mit höherer Geschwindigkeit laufen. Durch die Messung der Latenz auf der Stange können wir die Lernleistung der Ratte bezüglich dieser Fähigkeit beurteilen. Hier sehen wir die Ergebnisse des Rotorstangentests.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, sind zwei Tage Training ausreichend, um die motorische Fähigkeit zu erwerben. Im Vergleich zur Latenz beim ersten Versuch zeigte die Post-hoc-Analyse eine signifikante Verbesserung beim letzten Versuch der Trainingstage. Durch die Messung der Latenz auf der Stange können wir die Lernleistung der Ratte bezüglich der Fähigkeit abschätzen.

Danach zeigen wir Ihnen einen Test zur inhibitorischen Vermeidung. Dieser Test eignet sich zur Analyse der kontextuellen Lernleistung. Die Versuchsanordnung für die inhibitorische Vermeidung besteht aus einem hellen und einem dunklen Bereich, die durch eine Falltür getrennt sind.

Während der Trainingssitzung werden die Ratten in den beleuchteten Bereich gesetzt und kurz Zeit gegeben, sich an die Umgebung zu gewöhnen. Sobald sich die Tür öffnet, können die Ratten jederzeit in den abgedunkelten Bereich wechseln. Sobald sie den abgedunkelten Bereich betreten, wird die Tür geschlossen und die Ratten erhalten zwei Sekunden lang einen leichten elektrischen Schlag.

Nachdem die Ratten nach Abschluss des Versuchs für 30 Minuten in ihre Käfige zurückgebracht wurden, werden sie erneut in den beleuchteten Bereich der Versuchsanordnung platziert. Dreißig Minuten nach dem Schock zeigten die trainierten Ratten durchgängig eine längere Latenz, bevor sie den dunklen Bereich betraten. Hier sehen wir die Ergebnisse des inhibitorischen Vermeidungstests.

Nach dem elektrischen Schock lernten die Ratten, den abgedunkelten Bereich zu meiden und auf der beleuchteten Seite zu bleiben, was sie normalerweise nicht bevorzugen würden. Diese Tendenz, die abgedunkelte Seite zu vermeiden, weist auf den Erwerb kontextueller Erinnerungen hin. Gehirnschnitte nach dem Training.

Vor dem Einschnitt kühlen wir alle Scheren, Hämostasen und Becher mit zerstoßenem Eis herunter. Hier sehen Sie unsere Vorbereitung für die Dissektion. Die Gehirndissektion sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.

Nachdem die Ratte tief anästhesiert ist, wird sie in eine flache Schale mit zerstoßenem Eis gelegt und ein Schnitt wird vorgenommen, um die Bauchhöhle zu öffnen. Nach dem Schnitt in das Zwerchfell wird ein weiterer lateraler Schnitt gesetzt. Um die Brusthöhle zu öffnen, sollte der Rippenknorpel mit einer Hämoklippe zusammengedrückt werden.

Nachdem das Herz freigelegt wurde, wird eine 18-Gauge-Edelstahlnadel in den hinteren Teil des linken Ventrikels eingeführt. Die Nadelspitze sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein. Nach dem Öffnen des rechten Aurikels wird die Perfusion begonnen.

Stellen Sie sicher, dass sowohl die Nadel als auch die Spritze zunächst mit gasgesättigtem, eiskaltem Puffer für die Dissektion gefüllt sind. Eventuelle Luftblasen sollten vor der Perfusion ebenfalls entfernt werden. Schneiden Sie zuerst am Hinterhaupt des Schädels an.

Danach einen lateralen Schnitt durchführen, gefolgt von einem mittigen Schnitt, um das Gehirn freizulegen. Nach der Dissektion sollte das Gehirn fünf Minuten lang in sprudelnde, eiskalte Pufferlösung gelegt werden. Vor Fortsetzung der Dissektion ist das Filterpapier mit eiskalter Pufferlösung anzufeuchten.

Anschließend wird das Gehirn auf eine eiskalte Edelstahlplatte gelegt. Der Winkel der Schneidplatte ist entscheidend, um einen korrekten Schnittwinkel für den Gehirnschnitt sicherzustellen. Ein falscher Winkel könnte die Ziel-Pyramidenzellen möglicherweise durchtrennen.

Nach dem Beschneiden sollte ein Tropfen Sekundenkleber auf den Platzhalter des Vibratoms gegeben werden. Um eine feste Haftung zu gewährleisten, sollte überschüssiger Puffer mit einem Stück Filterpapier entfernt werden. Mithilfe des Vibratoms können dünne Gehirnschnitte angefertigt werden, die in einem belüfteten, eiskalten Puffer gehalten werden.

Unser Zielgebiet ist der primäre motorische Kortex. Das Zielhirnareal kann mit Iris-Scheren herausgeschnitten werden. Die Interface-Kammer kann aus einem Kunststoffbehälter für Lebensmittel hergestellt werden.

Der Deckel der Interface-Kammer ist notwendig, um das Gas einzuschließen. Die Schnitte werden mithilfe eines Infrarot-DIC-Mikroskops beobachtet. Hier sehen wir ein Beispiel für Neurone der Schicht 2/3 der primären motorischen Rinde.

Patch-Aufnahmepipetten werden mit der geeigneten intrazellulären Lösung gefüllt. Die Lösung für die Strom-Klemm-Analyse unterscheidet sich von der für die Spannungs-Klemm-Analyse. Repräsentative Ergebnisse.

Die Stromklemmtechnik ist nützlich zur Analyse intrinsischer Zelleigenschaften. Nach dem Rotorenstab-Training konnten wir die Stromklemmdaten von Neuronen der Schicht 2/3 des primären motorischen Kortex aufzeichnen. Panel A zeigt typische Spuren, die durch Strominjektionen hervorgerufen wurden.

Panel B zeigt die Beziehung zwischen dem injizierten Strom und der Anzahl der Spikes. Einmal trainierte Ratten induzierten weniger Spikes, während zweimal trainierte Ratten deutlich mehr Spikes als untrainierte Ratten induzierten. Wie in den unteren Panels zu sehen ist, wiesen einmal trainierte Ratten ein niedrigeres Ruhepotential, eine höhere Spike-Schwelle und eine stärkere Nachhyperpolarisation auf.

Ratten mit zwei Tagen Training wiesen ein höheres Ruhepotential und einen höheren Membranwiderstand auf. Die Spannungs-Klemm-Technik eignet sich zur Analyse der lerninduzierten synaptischen Plastizität. Hier sehen wir Daten von CA1-Neuronen nach kontextuellem Training.

Wir erhielten miniaturisierte postsynaptische Ströme aus CA1-Neuronen, die durch einzelne Vesikel von Glutamat oder GABA hervorgerufen wurden. Die Panels A und B zeigen repräsentative Spuren des miniaturisierten postsynaptischen Stroms. In Gegenwart von Tetrodotoxin wurden miniaturisierte EPSCs bei minus 16 Millivolt und miniaturisierte IPSCs bei null Millivolt nacheinander in denselben Neuronen gemessen.

Panel C zeigt zweidimensionale Darstellungen der Amplituden der Miniatur-EPSCs und Miniatur-IPSCs bei nicht trainierten, trainierten, ungepaarten und Walk-through-Ratten. Panel D zeigt die Darstellungen für die Miniaturfrequenzen. Wie in den unteren Darstellungen zu sehen ist, haben kontextuelle Trainings sowohl die exzitatorischen als auch die inhibitorischen Synapsen signifikant verstärkt, wodurch die Vielfalt der synaptischen Eingänge an die Neuronen gefördert wird.

Zusammenfassend ist die Strom-Klemm-Technik nützlich zur Analyse lerninduzierter Veränderungen der Zelleigenschaften. Außerdem ist die Spannungs-Klemm-Technik ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung lerninduzierter Plastizität an exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen. Die detaillierten Ergebnisse dieser Analysen finden sich in den folgenden Veröffentlichungen.