Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität
11. November 2017
Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.
Hallo, mein Name ist Dai Mitsushima. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie Gehirnschnitte bei trainierten Tieren vornehmen können, indem Sie die Patch-Clamp-Daten bei untrainierten Tieren vergleichen. Wir können die lerninduzierte synaptische Plastizität analysieren.
Hallo, mein Name ist Hiroyuki Kida. In diesem Experiment untersuchten wir den Neuromechanismus des Motorlaufs mit Hilfe des Rotorstabtests. Der Rotorstangentest wird häufig verwendet, um die motorische Wahrnehmung von Nagetieren zu bewerten.
Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass wir den Entdeckungsgrad während des Tests ändern können, indem wir die Drehzahl des Rotators erhöhen. Prüfung der Rotorstange. Vor der Motoraufgabe sollte die Rotorstangenvorrichtung über einen Zeitraum von 300 Sekunden auf einen Beschleunigungsmodus von 4 auf 40 U/min eingestellt werden.
Die Ratten wurden dazu gebracht, für jeden Test zehn Versuche durchzuführen. Das Zeitintervall zwischen den Versuchen betrug 30 Sekunden. Während der ersten Trainingseinheit fallen Ratten in der Regel von der Stange, auch bei niedrigen Geschwindigkeiten und laufen manchmal in die falsche Richtung.
Nach Wiederholung des Trainings kann die Ratte jedoch mit einer höheren Geschwindigkeit laufen. Durch die Messung der Latenz an der Stange können wir die Lernleistung der Fähigkeit der Ratte abschätzen. Hier sehen wir die Ergebnisse des Rotorstangentests.
Wie in dieser Abbildung dargestellt, reichen zwei Tage Training aus, um die motorischen Fähigkeiten zu erlernen. Verglichen mit der Latenz beim ersten Versuch zeigte die Post-hoc-Analyse eine signifikante Verbesserung gegenüber dem letzten Versuch am Trainingstag. Durch die Messung der Latenz an der Stange können wir die Lernleistung der Fähigkeit der Ratte abschätzen.
Als nächstes zeigen wir Ihnen einen Test zur hemmenden Vermeidung. Dieser Test ist nützlich bei der Analyse der kontextuellen Lernleistung. Der inhibitorische Vermeidungsapparat besteht aus heller und dunkler Seite, die durch eine Falltür getrennt sind.
Während der Trainingseinheit werden die Ratten in den beleuchteten Bereich gesetzt und erhalten eine kurze Zeit, um sich an die Umgebung zu gewöhnen. Sobald sich die Tür öffnet, können Ratten den abgedunkelten Bereich nach Belieben betreten. Beim Betreten des abgedunkelten Bereichs wird die Tür geschlossen und die Ratten erhalten zwei Sekunden lang einen leichten Elektroschock.
Nachdem die Ratten nach Beendigung des Versuchs für 30 Minuten in ihre Käfige zurückgebracht wurden, werden sie wieder in den beleuchteten Bereich des Geräts gebracht. Dreißig Minuten nach dem Schock zeigten die trainierten Ratten durchweg eine längere Latenzzeit, bevor sie in den dunklen Bereich eindrangen. Hier sehen wir die Ergebnisse des Tests zur inhibitorischen Vermeidung.
Nach dem Elektroschock lernten die Ratten, den abgedunkelten Bereich zu meiden und auf der beleuchteten Seite zu bleiben, was sie normalerweise nicht bevorzugen würden. Diese Tendenz, die dunkle Seite zu meiden, deutet auf den Erwerb von Kontexterinnerungen hin. Gehirnschnitte nach dem Training.
Vor dem Schnitt kühlen wir alle Scheren, Blutstiller und Becher mit Crushed Ice ab. Hier sehen Sie unsere Vorbereitung zum Sezieren. Die Dissektion des Gehirns sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
Nach dieser tiefen Betäubung wird die Ratte in eine flache Schale mit zerstoßenem Eis gelegt und ein Schnitt gemacht, um die Bauchhöhle zu öffnen. Nach dem Zwerchfellschnitt wird ein weiterer seitlicher Schnitt gesetzt. Um die Brusthöhle zu öffnen, sollte der Rippenknorpel mit einem Hämostaten verklumpt werden.
Nach der Freilegung des Herzens wird eine 18-Gauge-Nadel aus Edelstahl in den hinteren Teil des linken Ventrikels eingeführt. Die Spitze der Nadel sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein. Nach dem Schneiden der rechten Ohrmuschel wird mit der Perfusion begonnen.
Achten Sie darauf, dass sowohl die Nadel als auch die Spritze zuerst mit gasförmigem eiskaltem Dissektionspuffer gefüllt werden. Eventuelle Luftblasen sollten ebenfalls vor der Perfusion entfernt werden. Schneiden Sie zuerst am hinteren Ende des Schädels.
Machen Sie dann einen seitlichen Schnitt, gefolgt von einem mittleren Schnitt, um das Gehirn freizulegen. Nach der Dissektion sollte das Gehirn für fünf Minuten in blubbernden, eiskalten Puffer gelegt werden. Bevor Sie mit der Dissektion fortfahren, sollte das Filterpapier mit eiskaltem Puffer angefeuchtet werden.
Dann wird das Gehirn auf eine eiskalte Edelstahlbühne gestellt. Der Winkel des Schneidtisches ist entscheidend, um einen korrekten Schnittwinkel für den Hirnschnitt zu gewährleisten. Ein falscher Winkel könnte möglicherweise die Ziel-Pyramidenneuronen durchtrennen.
Nach dem Trimmen sollte ein Tropfen Sekundenkleber auf die Bühne des Vibratos aufgetragen werden. Um eine feste Haftung zu gewährleisten, sollte überschüssiger Dissektionspuffer mit einem Stück Filterpapier entfernt werden. Mit dem Vibraton können dünne Gehirnscheiben in einem sprudelnden, eiskalten Puffer gehalten werden.
Unser Zielgebiet ist der primäre motorische Kortex. Der Zielbereich des Gehirns kann mit einer Irisschere weggeschnitten werden. Die Trennkammer kann mit einem Lebensmittelbehälter aus Kunststoff hergestellt werden.
Der Deckel der Grenzflächenkammer ist notwendig, um das Gas aufzunehmen. Die Scheiben werden mit einem Infrarot-DIC-Mikroskop beobachtet. Hier sehen wir ein Beispiel für Schicht-2/3-Neuronen im primären motorischen Kortex.
Patch-Recording-Pipetten werden mit der entsprechenden intrazellulären Lösung gefüllt. Die Lösung für die Stromzangenanalyse unterscheidet sich von der Spannungszangenanalyse. Repräsentative Ergebnisse.
Die Current-Clamp-Technik ist nützlich für die Analyse der intrinsischen Zelleigenschaften. Nach dem Training der Rotorstange waren wir in der Lage, die aktuellen Klemmdaten von Neuronen der Schicht 2/3 im primären motorischen Kortex zu erhalten. Feld A zeigt typische Spuren, die durch Strominjektionen induziert werden.
Feld B zeigt das Verhältnis zwischen dem eingespeisten Strom und der Anzahl der Spitzen an. Eintägig trainierte Ratten induzierten weniger Spikes, während zwei Tage trainierte Ratten viel mehr Spikes induzierten als untrainierte Ratten. Wie in den unteren Panels zu sehen ist, zeigten eintägig trainierte Ratten ein geringeres Ruhepotenzial, eine höhere Spike-Schwelle und eine tiefere Nachhyperpolarisation.
Zwei Tage trainierte Ratten zeigten ein höheres Ruhepotenzial und eine höhere Membranresistenz. Die Voltage-Clamp-Technik ist nützlich für die Analyse der lerninduzierten synaptischen Plastizität. Hier können wir Daten von CA1-Neuronen nach kontextuellem Training sehen.
Wir erhielten miniaturisierte postsynaptische Ströme von CA1-Neuronen, die durch einzelne Vesikel von Glutamat oder GABA induziert wurden. Die Felder A und B zeigen repräsentative Spuren eines postsynaptischen Miniaturstroms. In Gegenwart von Tetrodotoxin wurden Miniatur-EPSCs bei minus 16 Millivolt und Miniatur-IPSCs bei null Millivolt nacheinander in denselben Neuronen gemessen.
Panel C zeigt zweidimensionale Diagramme der Miniatur-EPSC- und Miniatur-IPSC-Amplituden bei untrainierten, trainierten, ungepaarten und Walk-through-Ratten. Feld D zeigt die Diagramme für die Miniaturfrequenzen. Wie in den unteren Panels zu sehen ist, stärkten kontextuelle Trainings sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Synapsen signifikant und förderten die Vielfalt der synaptischen Inputs an die Neuronen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Stromklemmentechnik nützlich ist, um lerninduzierte Veränderungen der Zelleigenschaften zu analysieren. Außerdem ist die Voltage-Clamp-Technik ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse der lerninduzierten Plastizität an exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen. Die detaillierten Ergebnisse dieser Analysen finden Sie in den folgenden Publikationen.
Übersicht
Dieser Artikel demonstriert die Slice-Patch-Clamp-Technik zur Analyse von lerninduzierten Veränderungen in synaptischen Eigenschaften und Plastizität. Die Studie konzentriert sich auf motorische Kognition und kontextuelles Lernen bei trainierten Ratten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Verhaltensanalyse
Hintergrund
- Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist entscheidend für die Untersuchung der synaptischen Funktion.
- Motorische Kognition kann mit dem Rotor-Rod-Test bewertet werden.
- Kontextuelles Lernen wird durch inhibitorische Vermeidungstests bewertet.
- Das Verständnis der synaptischen Plastizität ist wesentlich für Einblicke in Lernmechanismen.
Zweck der Studie
- Um lerninduzierte synaptische Plastizität bei Ratten zu analysieren.
- Um synaptische Eigenschaften zwischen trainierten und untrainierten Tieren zu vergleichen.
- Um den Neuromechanismus des motorischen Laufens zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Rotor-Rod-Test zur Bewertung der Erlangung motorischer Fähigkeiten.
- Inhibitorischer Vermeidungstest zur Analyse des kontextuellen Gedächtnisses.
- Gehirnschnitt-Präparation und Patch-Clamp-Aufnahmen.
- Strom- und Spannungs-Clamp-Techniken zur Analyse synaptischer Aktivität.
Hauptergebnisse
- Zwei Tage Training verbesserten die Leistung der motorischen Fähigkeiten signifikant.
- Trainierte Ratten zeigten verbesserte synaptische Eigenschaften im Vergleich zu untrainierten Ratten.
- Strom-Clamp-Daten zeigten erhöhte Spike-Aktivität bei trainierten Ratten.
- Spannungs-Clamp-Ergebnisse zeigten Veränderungen in den miniaturisierten postsynaptischen Strömen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bestätigt die Wirksamkeit der Slice-Patch-Clamp-Technik.
- Training verbessert sowohl motorische Fähigkeiten als auch synaptische Plastizität.
- Diese Ergebnisse tragen zum Verständnis der neuronalen Grundlagen des Lernens bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
