Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Hallo, mein Name ist Dai Mitsushima. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie Gehirnschnitte bei trainierten Tieren vornehmen können, indem Sie die Patch-Clamp-Daten bei untrainierten Tieren vergleichen. Wir können die lerninduzierte synaptische Plastizität analysieren.

Hallo, mein Name ist Hiroyuki Kida. In diesem Experiment untersuchten wir den Neuromechanismus des Motorlaufs mit Hilfe des Rotorstabtests. Der Rotorstangentest wird häufig verwendet, um die motorische Wahrnehmung von Nagetieren zu bewerten.

Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass wir den Entdeckungsgrad während des Tests ändern können, indem wir die Drehzahl des Rotators erhöhen. Prüfung der Rotorstange. Vor der Motoraufgabe sollte die Rotorstangenvorrichtung über einen Zeitraum von 300 Sekunden auf einen Beschleunigungsmodus von 4 auf 40 U/min eingestellt werden.

Die Ratten wurden dazu gebracht, für jeden Test zehn Versuche durchzuführen. Das Zeitintervall zwischen den Versuchen betrug 30 Sekunden. Während der ersten Trainingseinheit fallen Ratten in der Regel von der Stange, auch bei niedrigen Geschwindigkeiten und laufen manchmal in die falsche Richtung.

Nach Wiederholung des Trainings kann die Ratte jedoch mit einer höheren Geschwindigkeit laufen. Durch die Messung der Latenz an der Stange können wir die Lernleistung der Fähigkeit der Ratte abschätzen. Hier sehen wir die Ergebnisse des Rotorstangentests.

Wie in dieser Abbildung dargestellt, reichen zwei Tage Training aus, um die motorischen Fähigkeiten zu erlernen. Verglichen mit der Latenz beim ersten Versuch zeigte die Post-hoc-Analyse eine signifikante Verbesserung gegenüber dem letzten Versuch am Trainingstag. Durch die Messung der Latenz an der Stange können wir die Lernleistung der Fähigkeit der Ratte abschätzen.

Als nächstes zeigen wir Ihnen einen Test zur hemmenden Vermeidung. Dieser Test ist nützlich bei der Analyse der kontextuellen Lernleistung. Der inhibitorische Vermeidungsapparat besteht aus heller und dunkler Seite, die durch eine Falltür getrennt sind.

Während der Trainingseinheit werden die Ratten in den beleuchteten Bereich gesetzt und erhalten eine kurze Zeit, um sich an die Umgebung zu gewöhnen. Sobald sich die Tür öffnet, können Ratten den abgedunkelten Bereich nach Belieben betreten. Beim Betreten des abgedunkelten Bereichs wird die Tür geschlossen und die Ratten erhalten zwei Sekunden lang einen leichten Elektroschock.

Nachdem die Ratten nach Beendigung des Versuchs für 30 Minuten in ihre Käfige zurückgebracht wurden, werden sie wieder in den beleuchteten Bereich des Geräts gebracht. Dreißig Minuten nach dem Schock zeigten die trainierten Ratten durchweg eine längere Latenzzeit, bevor sie in den dunklen Bereich eindrangen. Hier sehen wir die Ergebnisse des Tests zur inhibitorischen Vermeidung.

Nach dem Elektroschock lernten die Ratten, den abgedunkelten Bereich zu meiden und auf der beleuchteten Seite zu bleiben, was sie normalerweise nicht bevorzugen würden. Diese Tendenz, die dunkle Seite zu meiden, deutet auf den Erwerb von Kontexterinnerungen hin. Gehirnschnitte nach dem Training.

Vor dem Schnitt kühlen wir alle Scheren, Blutstiller und Becher mit Crushed Ice ab. Hier sehen Sie unsere Vorbereitung zum Sezieren. Die Dissektion des Gehirns sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.

Nach dieser tiefen Betäubung wird die Ratte in eine flache Schale mit zerstoßenem Eis gelegt und ein Schnitt gemacht, um die Bauchhöhle zu öffnen. Nach dem Zwerchfellschnitt wird ein weiterer seitlicher Schnitt gesetzt. Um die Brusthöhle zu öffnen, sollte der Rippenknorpel mit einem Hämostaten verklumpt werden.

Nach der Freilegung des Herzens wird eine 18-Gauge-Nadel aus Edelstahl in den hinteren Teil des linken Ventrikels eingeführt. Die Spitze der Nadel sollte durch die Wand der Aorta sichtbar sein. Nach dem Schneiden der rechten Ohrmuschel wird mit der Perfusion begonnen.

Achten Sie darauf, dass sowohl die Nadel als auch die Spritze zuerst mit gasförmigem eiskaltem Dissektionspuffer gefüllt werden. Eventuelle Luftblasen sollten ebenfalls vor der Perfusion entfernt werden. Schneiden Sie zuerst am hinteren Ende des Schädels.

Machen Sie dann einen seitlichen Schnitt, gefolgt von einem mittleren Schnitt, um das Gehirn freizulegen. Nach der Dissektion sollte das Gehirn für fünf Minuten in blubbernden, eiskalten Puffer gelegt werden. Bevor Sie mit der Dissektion fortfahren, sollte das Filterpapier mit eiskaltem Puffer angefeuchtet werden.

Dann wird das Gehirn auf eine eiskalte Edelstahlbühne gestellt. Der Winkel des Schneidtisches ist entscheidend, um einen korrekten Schnittwinkel für den Hirnschnitt zu gewährleisten. Ein falscher Winkel könnte möglicherweise die Ziel-Pyramidenneuronen durchtrennen.

Nach dem Trimmen sollte ein Tropfen Sekundenkleber auf die Bühne des Vibratos aufgetragen werden. Um eine feste Haftung zu gewährleisten, sollte überschüssiger Dissektionspuffer mit einem Stück Filterpapier entfernt werden. Mit dem Vibraton können dünne Gehirnscheiben in einem sprudelnden, eiskalten Puffer gehalten werden.

Unser Zielgebiet ist der primäre motorische Kortex. Der Zielbereich des Gehirns kann mit einer Irisschere weggeschnitten werden. Die Trennkammer kann mit einem Lebensmittelbehälter aus Kunststoff hergestellt werden.

Der Deckel der Grenzflächenkammer ist notwendig, um das Gas aufzunehmen. Die Scheiben werden mit einem Infrarot-DIC-Mikroskop beobachtet. Hier sehen wir ein Beispiel für Schicht-2/3-Neuronen im primären motorischen Kortex.

Patch-Recording-Pipetten werden mit der entsprechenden intrazellulären Lösung gefüllt. Die Lösung für die Stromzangenanalyse unterscheidet sich von der Spannungszangenanalyse. Repräsentative Ergebnisse.

Die Current-Clamp-Technik ist nützlich für die Analyse der intrinsischen Zelleigenschaften. Nach dem Training der Rotorstange waren wir in der Lage, die aktuellen Klemmdaten von Neuronen der Schicht 2/3 im primären motorischen Kortex zu erhalten. Feld A zeigt typische Spuren, die durch Strominjektionen induziert werden.

Feld B zeigt das Verhältnis zwischen dem eingespeisten Strom und der Anzahl der Spitzen an. Eintägig trainierte Ratten induzierten weniger Spikes, während zwei Tage trainierte Ratten viel mehr Spikes induzierten als untrainierte Ratten. Wie in den unteren Panels zu sehen ist, zeigten eintägig trainierte Ratten ein geringeres Ruhepotenzial, eine höhere Spike-Schwelle und eine tiefere Nachhyperpolarisation.

Zwei Tage trainierte Ratten zeigten ein höheres Ruhepotenzial und eine höhere Membranresistenz. Die Voltage-Clamp-Technik ist nützlich für die Analyse der lerninduzierten synaptischen Plastizität. Hier können wir Daten von CA1-Neuronen nach kontextuellem Training sehen.

Wir erhielten miniaturisierte postsynaptische Ströme von CA1-Neuronen, die durch einzelne Vesikel von Glutamat oder GABA induziert wurden. Die Felder A und B zeigen repräsentative Spuren eines postsynaptischen Miniaturstroms. In Gegenwart von Tetrodotoxin wurden Miniatur-EPSCs bei minus 16 Millivolt und Miniatur-IPSCs bei null Millivolt nacheinander in denselben Neuronen gemessen.

Panel C zeigt zweidimensionale Diagramme der Miniatur-EPSC- und Miniatur-IPSC-Amplituden bei untrainierten, trainierten, ungepaarten und Walk-through-Ratten. Feld D zeigt die Diagramme für die Miniaturfrequenzen. Wie in den unteren Panels zu sehen ist, stärkten kontextuelle Trainings sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Synapsen signifikant und förderten die Vielfalt der synaptischen Inputs an die Neuronen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Stromklemmentechnik nützlich ist, um lerninduzierte Veränderungen der Zelleigenschaften zu analysieren. Außerdem ist die Voltage-Clamp-Technik ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse der lerninduzierten Plastizität an exzitatorischen und inhibitorischen Synapsen. Die detaillierten Ergebnisse dieser Analysen finden Sie in den folgenden Publikationen.