Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Patch-Clamp-Aufzeichnungen von bis zu 12 Zellen im Ganzzellmodus durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Position jeder interessierenden Zelle markiert und jeder Zelle eine Pipette zugewiesen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Spitze jeder Pipette zu lokalisieren und die Pipetten automatisch neben die ihnen zugewiesenen Zellen zu bewegen.

Nähern Sie sich dann jeder Zelle mit jeweils einer Pipette. Um eine dichte Abdichtung mit der Zellmembran herzustellen, besteht der letzte Schritt darin, die Membran der Zellen aufzubrechen und Ganzzellaufzeichnungen durchzuführen. Letztendlich wird die computergestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet, um die Netzwerkeigenschaften kleiner neuronaler Schaltkreise mit hoher Auflösung darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Patch-Clamp besteht darin, dass die Anzahl der Verbindungen, die in einem Netzwerk beobachtet werden können, mit dem Quadrat der Anzahl der aufgezeichneten Neuronen wächst. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da die Patch-Clamp-Schritte aufgrund der Komplexität und der Geschwindigkeit, mit der sie ausgeführt werden müssen, schwer zu erlernen sein können. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie ein Hirnschnitt mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebungsbereichs des Mikroskops platzieren.

Identifizieren Sie als Nächstes die interessierenden Zellen. Speichern Sie dann die Position der Zellen basierend auf dem Koordinatensystem des Mikroskops. Die grafische Benutzeroberfläche zeigt sowohl die ausgewählten Zellen als auch die Mikropipetten für einen globalen Überblick an, und die Software fügt eine Markierung an der Zellposition hinzu, die auf den Bildern überlagert wird.

Zusätzlich wird ein Bild der Zelle als zukünftige Referenz aufgenommen. Nachdem Sie die gewünschten Zellen ausgewählt haben, weisen Sie die Pipetten zu, die zur Aufzeichnung der einzelnen Zellen verwendet werden, indem Sie die Zuweisungssteuerelemente in der grafischen Benutzeroberfläche festlegen. Visualisieren Sie eine Vorschau der endgültigen Konfiguration, indem Sie das Kontrollkästchen Endpositionen anzeigen aktivieren.

Bereiten Sie nun die Pipetten mit intrazellulärer Lösung vor und setzen Sie sie auf ihre Halterungen. Platzieren Sie die Kopfstufen in ihren Fixierungen, aber schieben Sie sie nicht nach vorne. Um zu vermeiden, dass Sie das Bad mit der Pipettenspitze berühren, aktivieren Sie die Überdruckregelung und wählen Sie alle Pipetten aus.

Um sicherzustellen, dass die Spitzen sauber bleiben, schieben Sie jede Kopfstufe vorsichtig an ihren Platz. Positionieren Sie als nächstes das Mikroskop in einer zentralen Position mit einem Fokus von zwei Millimetern über der Schnittscheibe, indem Sie die Taste R zwei drücken, während Sie die Taste A gedrückt halten. Verwenden Sie für jeden Manipulator die entsprechende Position, wie sie aus dem vorherigen Experiment gespeichert ist, indem Sie die Taste L zwei drücken, während Sie die Taste gedrückt halten A.At diesem Punkt sollte entweder ein deutlicher Schatten der Pipette zu sehen sein oder eine kleine Bewegung entlang der Pipettenachse sollte ausreichen um es zu beobachten. Der Ausgleich der geringfügigen Unterschiede in der Pipettenform muss manuell erfolgen.

Bringen Sie als Nächstes die Pipettenspitze in den Fokus. Platzieren Sie dann die Spitze auf dem roten Mittelpunkt des Videodisplays. Informieren Sie die Software, ohne das Mikroskop zu bewegen, dass sich die Pipette in der Mitte des Displays befindet, indem Sie die Z-Taste drücken, während Sie die Taste C des Controllers gedrückt halten.

Nachdem sich die einzelne Pipettenspitze positioniert hat, drehen Sie diese Pipette nach hinten, so dass die nächste Pipette gefunden werden kann, indem Sie die Taste L eins drücken, während Sie die Taste a gedrückt halten. Sobald alle Pipettenspitzen genau lokalisiert wurden und jede Pipette einer Zelle zugeordnet wird. Positionieren Sie die Pipetten automatisch in der Nähe der jeweiligen Zellen, indem Sie einfach mit der rechten Maustaste auf die Mitte der Zellgruppe im grafischen Darstellungsfenster klicken und die Option "Cluster" im Popup-Menü auswählen.

Wählen Sie im Fenster "Cluster-Optionen" alle Pipetten aus, die Sie zu diesem Zeitpunkt positionieren möchten, und klicken Sie auf "Mit den markierten Pipetten weiter". Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Cluster von Zellen, die Sie interessieren. Um den endgültigen Ansatz durchzuführen, geben Sie die Position der Pipetten relativ zu den Zellen als 200 Mikrometer von der Zelle entfernt in der Achse der Pipette und 200 Mikrometer darüber in vertikaler Richtung an, was ausreicht, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten.

Warten Sie dann, bis die Positionierung der Pipetten abgeschlossen ist. Bewegen Sie dann das Mikroskop in Richtung Pipette, indem Sie die Taste R 1 drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten.Kalibrieren Sie jede Pipettenposition neu, indem Sie das Mikroskop auf seine Spitze an einer beliebigen Stelle im Videodisplay fokussieren und die B-Taste drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten.Ein quadratisches Raster sollte kurz erscheinen, das die identifizierte Position der Pipette anzeigt. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt des Videodisplays und drücken Sie die Z-Taste, während Sie die Taste C des Controllers gedrückt halten.

Vergewissern Sie sich nun, dass die Zelle, die für die aktuelle Pipette relevant ist, korrekt markiert und aktiv markiert ist. Andernfalls bewegen Sie das Mikroskop so, dass es die gewünschte Zelle mit dem zentralen roten Punkt abgleicht, indem Sie die Y-Taste drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten. Drücken Sie dann die Taste L two, während Sie die Taste gedrückt halten, C.To positionieren Sie die Pipette 200 Mikrometer von der zugewiesenen Zelle entfernt, das Mikroskop bewegt sich automatisch in die entsprechende Position. Stellen Sie die Position der Pipette so ein, dass sie mit dem roten Punkt übereinstimmt.

Stellen Sie dann den Pipettenversatz ein, indem Sie die Taste R one drücken. Während Sie die Taste x gedrückt halten. Aktivieren Sie den Prüfimpuls, indem Sie die Taste L eins drücken, während Sie die Taste x gedrückt halten.

Bewegen Sie danach die Pipette langsam in die ihr zugeordnete Zelle. Wenn Sie die Bildung eines Grübchens auf der Oberfläche der Zellmembran beobachten, üben Sie einen kurzen Unterdruckimpuls aus, indem Sie die Y-Taste drücken, während Sie die Taste Z gedrückt halten, damit der ausgeübte Druck die Zelle erreichen kann. An dieser Stelle sollte ein Haltepotential von etwa minus 65 Millivolt eingestellt werden, indem die Taste L two gedrückt wird, während die Taste x gedrückt gehalten wird.

Sobald sich für jede Zelle eine Giga-Dichtung gebildet hat, beginnen Sie, die Membranen durch Anlegen von Unterdruck aufzubrechen. Verwenden Sie als Nächstes das Stimulationserfassungssystem, um die Aufnahme durchzuführen. Wenden Sie Impulse oder Impulszüge nacheinander auf einzelne Zellen an und beobachten Sie die Reaktionen der verbleibenden Zellen, um die Konnektivität zwischen diesen aufgezeichneten Zellen zu kartieren.

Sobald die Aufzeichnungen abgeschlossen sind, ziehen Sie die Pipetten langsam aus dem Gewebe zurück, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Optionsfeld für die Tabelle klicken. Wählen Sie Rücksprungpipetten 500 Mikrometer, um die Pipetten ein kurzes Stück entlang ihrer Achsen zurückzuweichen. Beobachten Sie dann die Drift des Potenzials der Zellen, die Pipetten ganz nach hinten zurückzuziehen.

Stellen Sie die Positioniergeschwindigkeit auf "schnell" ein und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, wählen Sie jedoch die Option "Alle". Entnehmen Sie die gebrauchten Pipetten, indem Sie die Kopftische vorsichtig herausschieben und die Pipetten von den Halterungen abschrauben. Hier ist ein Beispiel für Netzwerke direkter synaptischer Verbindungen, die in einzelnen Experimenten kartiert wurden.

Bei diesen drei Konnektivitätsdiagrammen handelt es sich um Sätze von 12 Parametallzellen, die in Schicht fünf mit den jeweiligen intersomatischen Abständen aufgezeichnet wurden. Und hier ist das Konnektivitätsdiagramm, das die morphologische Färbung von aufgezeichneten Parametallzellen überlagert. Diese Abbildung zeigt den gemeinsamen Nachbareffekt

Blaue Säulen zeigen die Neuronenpaare an, die gleichzeitig mit mindestens einem anderen Neuron im abgetasteten Netzwerk verbunden sind. Weisen Sie eine signifikant erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, miteinander verbunden zu sein. Hier zeigt, dass die Paare von Neuronen, die sich mehrere gemeinsame Nachbarn teilen, häufiger vorkommen als zufällig in den untersuchten Netzwerken erwartet auftreten, die Verbindungswahrscheinlichkeit innerhalb von Neuronenpaaren steigt in Abhängigkeit von der Anzahl der gemeinsamen Nachbarn, die vom Zahler geteilt werden.

Diese Eigenschaften führen wiederum zu kleinen weltbasierten Clusternetzwerken. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der Rekrutierung von Martin-Zellen. Dabei handelt es sich um eine grafische Darstellung einer Parametallzelle in Rot, die Synapsen auf einer Martinszelle in Blau bildet, die wiederum Synapsen auf einer zweiten Parametallzelle bildet.

In Schwarz führt die Stimulation der Parametallzelle über der Schwelle zur Rekrutierung der Martin-Zelle. Durch die Integration von erleichternden exzitatorischen postsynaptischen Potentialen hemmt die rekrutierte Martin-Zelle dann die zweite Parametallzelle. Dieses Diagramm zeigt die Stimulation einer zunehmenden Anzahl von Patch-geklemmten Parametallzellen und die Auswirkungen auf eine andere Parametallzelle.

Hier sind die gemittelten inhibitorischen postsynaptischen Potentiale, die von einer Parametallzelle aufgezeichnet wurden, als Funktion der Anzahl anderer nahegelegener Parametallzellen, die stimuliert werden. Die Amplitude der synaptischen DYS-Hemmung in einem lokalen Schaltkreis neigt dazu, sich zu sättigen, wenn neun oder mehr Parametallzellen stimuliert werden, und der Anteil der Zellen, die eine synaptische DYS-Hemmung erhalten, steigt schnell auf eins an, wenn eine zunehmende Anzahl von Parametallzellen stimuliert wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Spitzen der Pipetten sauber zu halten und die Gewebeverzerrung zu minimieren, indem Blutgefäße und andere Zellen während der Annäherungsphase vermieden werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden, wie z. B. die Photostimulation, eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Innovation der gepatchten Klemmzellen durch einen anderen Zelltyp. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Patch-Clamp-Verfahren für mehrere Neuronen beschleunigen und durchführen können.