Name: Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie ein EDV-gestütztes Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System die Effizienz neuronaler Aufzeichnungen steigert. Diese Methode ermöglicht simultane Whole-Cell-Aufnahmen von bis zu 12 Zellen zur Untersuchung kleiner neuronaler Schaltkreise.

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Wir möchten Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi und Sonia Garcia für wertvolle Erfahrungsberichte zu Verbesserungen für die Patch-Clamp-Verfahren Automatisierung danken. Wir danken Rajnish Ranjan für wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Software-Implementierung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der EU-Synapse-Projekt und teilweise von der Human Frontiers Science Program gefördert.

1. Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Steuer Manipulatoren von einem Computer <ol><li> Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232). </li><li> Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen. </li><li> Standardisieren Sie das Bezugssystem der Manipulatoren, so dass Null ist der nächstmögliche Position in Bezug auf die Motoren und positive Bewegung weg von den Motoren gerichtet. </li><li> Positionieren des Mikroskops an seiner zentralen Position 2 mm oberhalb der Probe Brennebene (Koordinaten [0, 0, 2000]). </li><li> Speicher für jeden Manipulator, der lokalen Koordinaten, die die Spitze einer Pipette, in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops beobachtet werden können. Dies ist der erste Bezugspunkt für jede Elektrode. </li></ol></li><li> VisuaLize Elektrodenpositionen. Es ist sehr nützlich, um die Position einer jeden Elektrode während eines Experiments zu verfolgen. Eine grafische Darstellung ist die intuitive Weise, dies zu erreichen. Zu diesem Zweck werden die Referenzsysteme jeder Elektrode und der des Mikroskops abgeglichen werden müssen. Ein einfacher Weg, dies zu erreichen ist: <ol><li> Bringt die Spitze einer Elektrode zu der Mitte des Sichtfeldes. </li><li> Speichern die Position auf jeder Achse des Manipulators und jede Achse des Mikroskops. </li><li> Ausführen mit der x-Achse des Manipulators eine relativ große Bewegung (1 mm). </li><li> Suchen Sie die Spitze noch einmal bewegen nur das Mikroskop. </li><li> Berechnen Sie die Differenz im Mikroskop Position, seit es zuletzt gemessen. Dies sind die Vorsprünge des Elektrodenachsenbewegung auf das Mikroskop Achsen. </li><li> Die Schritte von 2,3 bis 2,5 für die Y-und Z-Achsen der Elektrodenmanipulator. Dies ermöglicht eine Matrix von Vorsprüngen auf dem Mikroskop-Achsen bestimmt werden (&lt;strong&gt; Abbildung 2) auch als Kosinus-Matrix: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg"></li><li> Invertieren dieser Matrix, die es ermöglichen, die Bewegungen in drei Dimensionen, die durch die Elektrode Manipulator erforderlich, um eine bestimmte Position im Mikroskop Koordinatensystem zu erreichen berechnen: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg"></li><li> Mit dem ersten Referenzpunkt und der Kosinus-Matrix bestimmen die Position jeder Elektrode in Mikroskop koordiniert. </li><li> Grafisch dargestellt, basierend auf dem Objektkoordinaten, die Position jeder Elektrode in regelmäßigen Abständen. Wir entschieden uns für C / C + +-Bibliotheken Zeichnung (GDI +) zu verwenden, um Elektrodenpositionen alle 40 ms zu ziehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.2.7 jedem Manipulator Winkel verändert oder Positionsänderungen von mehreren Millimetern erforderlich sind, zum Beispiel wenn die Art der Elektrode verändert wird. </li></ol></li><li> Aktivieren Sie das Speichern der Positionierungns der relevanten Merkmale in das Gewebe, wie z. B. Zellen oder anatomischen Referenzpunkten, die im Mikroskop koordiniert. </li><li> Erwerben Sie Video-und relevanten Informationen zu überlagern. <ol><li> Mechanisch die x-Achse der Bewegung des Mikroskops ausgerichtet mit der horizontalen Achse des Mikroskop-Kamera. </li><li> Installieren Sie auf dem Computer einen Framegrabber mit Live-Video-und Overlay-Fähigkeit und ein Software Development Kit (SDK). </li><li> Implementieren Sie Live-Video-Display-Betrieb mit dem SDK. </li><li> Konvertieren das Mikroskop Koordinatensystem der Kamera-Referenzsystem durch die geeignete Übersetzung und Skalierung. </li><li> Daraus die relevanten Merkmale in Kamerakoordinaten und die Überlagerung auf dem Live-Video das resultierende Bild in regelmäßigen Abständen von etwa 40 ms (Fig. 3). </li></ol></li><li> Regelverstärker. <ol><li> Verwenden Sie die Software, um die Verstärker Verstärkereinstellungen von der Schnittstelle zu steuern. </li></ol></li><li> CoNTROL Oszilloskope. <ol><li> Schließen Sie die Oszilloskope mit seriellen Schnittstellen mit dem PC. </li><li> Bestimmen Sie die Oszilloskop-Skala, Kupplung und zeitliche Auflösung für die verschiedenen Schritte der Patch-Clamp-Verfahren in Voltage-Clamp (zB Elektrode im Bad, Dichtung Bildung, Ganzzell-Konfiguration) und Strom-Klemme. </li><li> Senden der geeigneten Oszilloskop Einstellbefehle wenn Verstärker Befehle von der Schnittstelle ausgegeben. </li></ol></li><li> Steuer Pipette Druck. <ol><li> Zusammenstellung eines Drucksteuersystems gemäß 4. <ol><li> Verwenden Sie eine 12 V / 5 V-Stromversorgung, jede elektronische Komponente entsprechend zu versorgen. </li><li> Den Ausgang der Membranpumpe nach einem der Überdruckpuffer (100 ml Behälter). </li><li> Den Eingang einer Membranpumpe mit der Unterdruckpuffer (100 ml Behälter). </li><li> Verbinden den Pipettenhalter Schlauch mit einem Drucksensor in der pressuWiedersteuersystem und ein pneumatisches Ventil, das an dem Hauptdruckraum verbindet. </li><li> Verbinden jeder der Druckpuffer auf ein Ventil mit der Hauptdruckkammer verbunden ist. </li><li> Verbinden eines Ventils zwischen der Hauptdruckkammer und der Atmosphäre. </li><li> Schließen Sie einen Drucksensor an der Hauptdruckraum. </li><li> Schließen Sie einen Drucksensor, der jeden Puffer. </li><li> Schließen Sie den Druckkontrollsystem mit einer Datenerfassungskarte. </li><li> Verbinden Sie jeden Drucksensor mit einem Analogeingang. </li><li> Verbinden jedes Ventil mit einem digitalen Ausgang. </li></ol></li><li> Entfernen Atmosphärendruck durch Öffnen aller Ventile mit Ausnahme der Verbindung zu den Membranpumpen und Subtraktion der gemessene Druck von allen Sensoren kompensiert. </li><li> Implementieren Druckkontrolle <ol><li> Definieren Sie in der Schnittstelle ein Steuerelement zu aktivieren oder zu de-aktivieren positive Druckregelung für jede Pipette. </li><li> Definieren Sie eine minimale Überdruck für die Pipettes von etwa 70 mbar. </li><li> In regelmäßigen Abständen (alle 0,5 sec) erkennen, wenn Druck in Pipetten unter aktiver Druckregelung unter den eingestellten Schwellenwert. </li><li> Nach der Schwellenwertüberschreitung öffnen Sie die Überdruckpuffer in den Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage während der kurzen Perioden (20 ms), bis der Druck in den Pipetten oberhalb der Schwelle ist. Schließen Sie alle anderen Ventile. </li><li> De-aktivieren weitere Druckkontrolle als der letzte Ansatz für eine Zelle von Interesse ausgelöst. </li></ol></li><li> Bewerben Unterdruck zur Bildung Dichtung <ol><li> Schließen Sie alle Ventile und öffnen Sie die Unterdruckpuffer Ventil in Richtung der Hauptdruckraum und dieses Fach in Richtung der Pipette in Frage für die Dauer der Experimentator erfordert, indem sie eine Taste gedrückt wird. </li></ol></li></ol></li><li> Zentralisieren Sie Befehle auf eine Human Interface Device. <ol><li> Schließen Sie einen handelsüblichen wireless-Gamepad an den PC. </li><li> Implementieren Auslesen der Joystick-Status. So verwenden Sie die DirectX-Bibliotheken für C / C + +, um alle 5 ms Anzeigen durchzuführen. </li><li> Vergleichen Sie den aktuellen Status mit früheren Status zu erkennen, welche Tasten betätigt wurden, freigegeben oder gedrückt gehalten seit dem letzten Zeitschritt. </li><li> Zuweisen von Funktionen zu jeder Taste in dem Gamepad. Ein Beispiel dieser Abbildung ist in Fig. 5 gezeigt. </li></ol></li></ol> 2. Patch-Clamp-Verfahren <ol><li> Vorbereitung der Hirnschnitten der Region von Interesse. </li><li> Legen Sie einen Hirnschnitt von Interesse, mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebebereich des Mikroskops. </li><li> Zellselektion <ol><li> Identifizieren Zellen von Interesse, indem Sie mit dem Mikroskop. Bewahren Sie die Position der Zellen auf der Basis des Mikroskops ein Koordinatensystem mit der rechten Maustaste auf das Live-Video-Anzeige auf der Oberseite der Zelle von Interesse. </li> Die grafische Oberfläche werden die ausgewählten Zellen sowie die Mikropipetten für einen globalen Überblick und Software anzuzeigen, eine Markierung auf der Zellposition, die auf den Bildern überlagert werden hinzuzufügen. Darüber ein Bild von der Zelle wird für die Zukunft in der Datei 'Zelle #. Jpg' eingefangen. </ol></li></ol><li> Namensnennung von Zellen, Pipetten <ol><li> Nach der Auswahl der Zellen von Interesse, weisen Sie die Pipette jede Zelle aufnehmen wird. Die grafische Oberfläche bietet Zuordnung Steuerelemente, die eingestellt werden soll. Visualisieren Sie eine Vorschau auf die endgültige Konfiguration indem Sie die Kontrollkästchen 'Final Positionen Show'. </li><li> Wählen Sie jede Pipette, für die die endgültige Position Vorschau gewünscht oder überprüfen Sie die "Select All" Kontrollkästchen. Deaktivieren Sie die Anzeige der aktuellen Position zur besseren Visualisierung, wenn nötig. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Pipetten <ol><li> Füllen Sie die Pipetten (6-8 MOhm sind in der Regel am besten, wenn viele Pipetten verwendet werden) with intrazellulären Lösung und laden sie in ihre Inhaber. Legen Sie die headstages in ihren Aufzeichnungen aber nicht schieben Sie sie nach vorne zu vermeiden, berühren Sie das Bad mit der Pipettenspitze. </li><li> Aktivieren Sie die positive Drucksteuerung und wählen Sie alle Pipetten, um sicherzustellen, dass die Spitzen bleibt sauber. Schieben Sie jede heads an Ort und Stelle. </li></ol></li><li> Auffinden der Pipettenspitzen <ol><li> Positionieren Sie das Mikroskop in eine zentrale Position mit Fokus 3 mm über der Scheibe durch Drücken der Taste bei gedrückter R2-Taste 'A'. Verwenden Sie die entsprechende Position für jeden Manipulator aus dem vorherigen Experiment durch Drücken der Taste L2-Taste gespeichert werden, während A. Halten Hinweis: An dieser Stelle sollte es entweder ein unverwechselbares Schatten einer Pipette in Aussicht oder eine kleine Bewegung entlang der Pipette Achse sein sollte, genug, um es in den meisten Fällen zu beobachten. Vergütung für die leichte Unterschiede in Form Pipette muss manuell durchgeführt werden. </li><li> Bringen Sie die Pipettenspitze in den Fokus. Die Spitze auf dem roten Punkt in der Mitte des Videoanzeige ohne Bewegung des Mikroskops (es sollte noch in Position [0, 0 2000] sein). </li><li> Informieren Sie die Software, die die Pipette ist in der Mitte der Anzeige durch Drücken der Taste Z, während die Taste C gehalten Nach jeder Pipettenspitze befindet, senden diese Pipette nach hinten, so dass die folgende kann man durch Drücken der Taste L1-Taste, während A. hält befinden </li></ol></li><li> Annäherung an die Zellen <ol><li> Sobald alle Pipettenspitzen haben genau lokalisiert worden und jede Pipette wird mit einer Zelle zugeschrieben, die Pipetten in der Nähe ihrer jeweiligen Zellen automatisch zu positionieren. Einfach mit der rechten Maustaste in der Mitte der Gruppe von Zellen, und wählen Sie die Option 'Cluster' im Popup-Menü. Auf dem Cluster-Optionen-Fenster, die angezeigt wird, wählen Sie alle Pipetten, die Sie in dieser Zeit positionieren möchten, und klicken Sie auf 'Go mit allen Pipetten überprüft. Wiederholen dieses Vorgangs für jedes Cluster von Zellen von Interesse. </li><li> Perform den Endanflug manuell. Die Position der Pipette in Bezug auf die Zellen unterschiedlich festgelegt werden, aber gewöhnlich ist einfach 200 &amp;mgr; m entfernt von der Zelle in der Achse der Pipette und 200 um darüber in der vertikalen Richtung, die ausreichen, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten, ist . Warten Sie, bis die Positionierung der Pipetten ist fertig und das Mikroskop zu bewegen in Richtung einer Pipette durch Drücken der Taste bei gedrückter R1-Taste C. </li><li> Kalibrieren Sie jede Pipette Position durch die Fokussierung des Mikroskops auf der Spitze überall in der Videoanzeige und Drücken der Taste B bei gedrückter Taste C ein quadratisches Gitter sollte kurz erscheinen, die die identifizierten Position der Pipette. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt der Videoanzeige und drücken Sie die Taste Z gedrückt gehaltener Taste C. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Cell-Attached-Konfiguration <ol><li> Bestätigen Sie, dass die Zelle von Interesse für die aktuelle Pipette richtig istmarkiert. Ansonsten bewegen das Mikroskop, um die Zelle von Interesse mit dem zentralen roten Punkt übereinstimmen. Markieren Sie die Zelle mit der Taste Y-Taste bei gedrückter C-Taste drücken, während L2 Taste C halten, um die Pipette 200 um weg von dem ihm zugewiesenen Zelle positionieren, wird das Mikroskop automatisch in die entsprechende Position zu bewegen. </li><li> Stellen Sie die Pipette Position, damit es den roten Punkt übereinstimmt. Stellen Sie die Pipette durch Drücken der Taste R1-Taste, während X. hält Offset </li><li> Aktivieren Sie den Testimpuls durch Drücken der Taste bei gedrückter L1-Taste X. Langsam nähern sich der Pipette auf seine Zelle zurückgeführt. </li><li> Nach Beobachtung der Bildung einer Vertiefung auf der Oberfläche der Membran der Zelle gelten eine kurze Puls der Unterdruck durch Drücken der Taste Y, während die Taste Z halten, damit der aufgebrachte Druck, um die Zelle zu erreichen. Ein Haltepotential von etwa-65mV sei an dieser Stelle durch Drücken der Taste L2, während die Taste X. Holding gegründet </li></ol></li><li> Whole-Cell-Konfiguration<ol><li> Sobald eine Giga-Dichtung für jede Zelle gebildet, beginnen Aufbrechen der Membranen durch Aufbringen von Unterdruck. </li></ol></li><li> Führen Aufnahmen <ol><li> Verwenden Sie die Stimulation / Erfassungssystem, um Ihre Aufnahmen durchzuführen. Gelten Impulse oder Impulsfolgen auf einer Einzelzelle zu einer Zeit und Reaktionen beobachten, auf den übrigen Zellen, um die Verbindung zwischen den aufgenommenen Zellen abzubilden. </li></ol></li><li> Zurücktreten Pipetten <ol><li> Sobald Aufnahmen fertig sind, zurücktreten Pipetten langsam aus dem Gewebe mit der rechten Maustaste auf die Tabelle Radio-Button. Wählen Sie "zurücktreten-&gt; Pipetten 500 um" zu haben, die Pipetten rücken eine kurze Strecke entlang ihrer Achsen. Beachten Sie die Drift in Potential der Zellen (Clearing die Tipps durch die Anwendung einiger positiver Druck kann helfen). </li><li> Um Pipetten ganzen Weg zurück zurückgehen, stellen Sie die Positionierungsgeschwindigkeit auf 'Fast' und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, aber wählen Sie das "Alle"-Option. Entfernen Sie die verbrauchtePipetten durch vorsichtiges Schieben Sie die headstages und Lösen der Pipetten aus den Halterungen. Es ist nützlich, um zu vermeiden, drehen die Inhaber in ihren Höhlen da dies stark mit der Pipettenspitze Position stören. </li></ol></li>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wie diese P...

Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig 1 untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen 2.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Immersionsobjektiv</td></tr><tr><td>Manipulatoren</td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Verwendetes serielles Protokoll</td></tr><tr><td>Amplifiers</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK gebraucht</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC Analogausgang</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Datenübersetzung</td><td>DT3120</td><td>SDK gebraucht</td></tr><tr><td>Oszilloskope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>Serielle Kommunikation</td></tr><tr><td>Datenerfassung</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassung</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>Gebrauchte Bibliothek (.dll)</td></tr><tr><td>Druckventil</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>Drucksensor</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>Membran Pumpe</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

eine edv-gestützte multi-elektroden-patch-clamp-system

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.

Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt. Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwischenk...

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Patch-Clamp-Aufzeichnungen von bis zu 12 Zellen im Ganzzellmodus durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Position jeder interessierenden Zelle markiert und jeder Zelle eine Pipette zugewiesen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Spitze jeder Pipette zu lokalisieren und die Pipetten automatisch neben die ihnen zugewiesenen Zellen zu bewegen.Nähern Sie sich dann jeder Zelle mit jeweils einer Pipette. Um eine dichte Abdichtung mit der Zellmembran herzustellen, besteht der letzte Schritt darin, die Membran der Zellen aufzubrechen und Ganzzellaufzeichnungen durchzuführen. Letztendlich wird die computergestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet, um die Netzwerkeigenschaften kleiner neuronaler Schaltkreise mit hoher Auflösung darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Patch-Clamp besteht darin, dass die Anzahl der Verbindungen, die in einem Netzwerk beobachtet werden können, mit dem Quadrat der Anzahl der aufgezeichneten Neuronen wächst. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da die Patch-Clamp-Schritte aufgrund der Komplexität und der Geschwindigkeit, mit der sie ausgeführt werden müssen, schwer zu erlernen sein können. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie ein Hirnschnitt mit dem interessierenden Bereich in der Mitte des Verschiebungsbereichs des Mikroskops platzieren.Identifizieren Sie als Nächstes die interessierenden Zellen. Speichern Sie dann die Position der Zellen basierend auf dem Koordinatensystem des Mikroskops. Die grafische Benutzeroberfläche zeigt sowohl die ausgewählten Zellen als auch die Mikropipetten für einen globalen Überblick an, und die Software fügt eine Markierung an der Zellposition hinzu, die auf den Bildern überlagert wird.Zusätzlich wird ein Bild der Zelle als zukünftige Referenz aufgenommen. Nachdem Sie die gewünschten Zellen ausgewählt haben, weisen Sie die Pipetten zu, die zur Aufzeichnung der einzelnen Zellen verwendet werden, indem Sie die Zuweisungssteuerelemente in der grafischen Benutzeroberfläche festlegen. Visualisieren Sie eine Vorschau der endgültigen Konfiguration, indem Sie das Kontrollkästchen Endpositionen anzeigen aktivieren.Bereiten Sie nun die Pipetten mit intrazellulärer Lösung vor und setzen Sie sie auf ihre Halterungen. Platzieren Sie die Kopfstufen in ihren Fixierungen, aber schieben Sie sie nicht nach vorne. Um zu vermeiden, dass Sie das Bad mit der Pipettenspitze berühren, aktivieren Sie die Überdruckregelung und wählen Sie alle Pipetten aus.Um sicherzustellen, dass die Spitzen sauber bleiben, schieben Sie jede Kopfstufe vorsichtig an ihren Platz. Positionieren Sie als nächstes das Mikroskop in einer zentralen Position mit einem Fokus von zwei Millimetern über der Schnittscheibe, indem Sie die Taste R zwei drücken, während Sie die Taste A gedrückt halten. Verwenden Sie für jeden Manipulator die entsprechende Position, wie sie aus dem vorherigen Experiment gespeichert ist, indem Sie die Taste L zwei drücken, während Sie die Taste gedrückt halten A.At diesem Punkt sollte entweder ein deutlicher Schatten der Pipette zu sehen sein oder eine kleine Bewegung entlang der Pipettenachse sollte ausreichen um es zu beobachten. Der Ausgleich der geringfügigen Unterschiede in der Pipettenform muss manuell erfolgen.Bringen Sie als Nächstes die Pipettenspitze in den Fokus. Platzieren Sie dann die Spitze auf dem roten Mittelpunkt des Videodisplays. Informieren Sie die Software, ohne das Mikroskop zu bewegen, dass sich die Pipette in der Mitte des Displays befindet, indem Sie die Z-Taste drücken, während Sie die Taste C des Controllers gedrückt halten.Nachdem sich die einzelne Pipettenspitze positioniert hat, drehen Sie diese Pipette nach hinten, so dass die nächste Pipette gefunden werden kann, indem Sie die Taste L eins drücken, während Sie die Taste a gedrückt halten. Sobald alle Pipettenspitzen genau lokalisiert wurden und jede Pipette einer Zelle zugeordnet wird. Positionieren Sie die Pipetten automatisch in der Nähe der jeweiligen Zellen, indem Sie einfach mit der rechten Maustaste auf die Mitte der Zellgruppe im grafischen Darstellungsfenster klicken und die Option "Cluster" im Popup-Menü auswählen.Wählen Sie im Fenster "Cluster-Optionen" alle Pipetten aus, die Sie zu diesem Zeitpunkt positionieren möchten, und klicken Sie auf "Mit den markierten Pipetten weiter". Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Cluster von Zellen, die Sie interessieren. Um den endgültigen Ansatz durchzuführen, geben Sie die Position der Pipetten relativ zu den Zellen als 200 Mikrometer von der Zelle entfernt in der Achse der Pipette und 200 Mikrometer darüber in vertikaler Richtung an, was ausreicht, um die Pipettenspitze außerhalb des Gewebes zu halten.Warten Sie dann, bis die Positionierung der Pipetten abgeschlossen ist. Bewegen Sie dann das Mikroskop in Richtung Pipette, indem Sie die Taste R 1 drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten.Kalibrieren Sie jede Pipettenposition neu, indem Sie das Mikroskop auf seine Spitze an einer beliebigen Stelle im Videodisplay fokussieren und die B-Taste drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten.Ein quadratisches Raster sollte kurz erscheinen, das die identifizierte Position der Pipette anzeigt. Wenn die Position nicht korrekt ist, positionieren Sie die Spitze auf dem zentralen Punkt des Videodisplays und drücken Sie die Z-Taste, während Sie die Taste C des Controllers gedrückt halten.Vergewissern Sie sich nun, dass die Zelle, die für die aktuelle Pipette relevant ist, korrekt markiert und aktiv markiert ist. Andernfalls bewegen Sie das Mikroskop so, dass es die gewünschte Zelle mit dem zentralen roten Punkt abgleicht, indem Sie die Y-Taste drücken, während Sie die Taste C gedrückt halten. Drücken Sie dann die Taste L two, während Sie die Taste gedrückt halten, C.To positionieren Sie die Pipette 200 Mikrometer von der zugewiesenen Zelle entfernt, das Mikroskop bewegt sich automatisch in die entsprechende Position. Stellen Sie die Position der Pipette so ein, dass sie mit dem roten Punkt übereinstimmt.Stellen Sie dann den Pipettenversatz ein, indem Sie die Taste R one drücken. Während Sie die Taste x gedrückt halten. Aktivieren Sie den Prüfimpuls, indem Sie die Taste L eins drücken, während Sie die Taste x gedrückt halten.Bewegen Sie danach die Pipette langsam in die ihr zugeordnete Zelle. Wenn Sie die Bildung eines Grübchens auf der Oberfläche der Zellmembran beobachten, üben Sie einen kurzen Unterdruckimpuls aus, indem Sie die Y-Taste drücken, während Sie die Taste Z gedrückt halten, damit der ausgeübte Druck die Zelle erreichen kann. An dieser Stelle sollte ein Haltepotential von etwa minus 65 Millivolt eingestellt werden, indem die Taste L two gedrückt wird, während die Taste x gedrückt gehalten wird.Sobald sich für jede Zelle eine Giga-Dichtung gebildet hat, beginnen Sie, die Membranen durch Anlegen von Unterdruck aufzubrechen. Verwenden Sie als Nächstes das Stimulationserfassungssystem, um die Aufnahme durchzuführen. Wenden Sie Impulse oder Impulszüge nacheinander auf einzelne Zellen an und beobachten Sie die Reaktionen der verbleibenden Zellen, um die Konnektivität zwischen diesen aufgezeichneten Zellen zu kartieren.Sobald die Aufzeichnungen abgeschlossen sind, ziehen Sie die Pipetten langsam aus dem Gewebe zurück, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Optionsfeld für die Tabelle klicken. Wählen Sie Rücksprungpipetten 500 Mikrometer, um die Pipetten ein kurzes Stück entlang ihrer Achsen zurückzuweichen. Beobachten Sie dann die Drift des Potenzials der Zellen, die Pipetten ganz nach hinten zurückzuziehen.Stellen Sie die Positioniergeschwindigkeit auf "schnell" ein und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, wählen Sie jedoch die Option "Alle". Entnehmen Sie die gebrauchten Pipetten, indem Sie die Kopftische vorsichtig herausschieben und die Pipetten von den Halterungen abschrauben. Hier ist ein Beispiel für Netzwerke direkter synaptischer Verbindungen, die in einzelnen Experimenten kartiert wurden.Bei diesen drei Konnektivitätsdiagrammen handelt es sich um Sätze von 12 Parametallzellen, die in Schicht fünf mit den jeweiligen intersomatischen Abständen aufgezeichnet wurden. Und hier ist das Konnektivitätsdiagramm, das die morphologische Färbung von aufgezeichneten Parametallzellen überlagert. Diese Abbildung zeigt den gemeinsamen Nachbareffekt.Blaue Säulen zeigen die Neuronenpaare an, die gleichzeitig mit mindestens einem anderen Neuron im abgetasteten Netzwerk verbunden sind. Weisen Sie eine signifikant erhöhte Wahrscheinlichkeit auf, miteinander verbunden zu sein. Hier zeigt, dass die Paare von Neuronen, die sich mehrere gemeinsame Nachbarn teilen, häufiger vorkommen als zufällig in den untersuchten Netzwerken erwartet auftreten, die Verbindungswahrscheinlichkeit innerhalb von Neuronenpaaren steigt in Abhängigkeit von der Anzahl der gemeinsamen Nachbarn, die vom Zahler geteilt werden.Diese Eigenschaften führen wiederum zu kleinen weltbasierten Clusternetzwerken. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der Rekrutierung von Martin-Zellen. Dabei handelt es sich um eine grafische Darstellung einer Parametallzelle in Rot, die Synapsen auf einer Martinszelle in Blau bildet, die wiederum Synapsen auf einer zweiten Parametallzelle bildet.In Schwarz führt die Stimulation der Parametallzelle über der Schwelle zur Rekrutierung der Martin-Zelle. Durch die Integration von erleichternden exzitatorischen postsynaptischen Potentialen hemmt die rekrutierte Martin-Zelle dann die zweite Parametallzelle. Dieses Diagramm zeigt die Stimulation einer zunehmenden Anzahl von Patch-geklemmten Parametallzellen und die Auswirkungen auf eine andere Parametallzelle.Hier sind die gemittelten inhibitorischen postsynaptischen Potentiale, die von einer Parametallzelle aufgezeichnet wurden, als Funktion der Anzahl anderer nahegelegener Parametallzellen, die stimuliert werden. Die Amplitude der synaptischen DYS-Hemmung in einem lokalen Schaltkreis neigt dazu, sich zu sättigen, wenn neun oder mehr Parametallzellen stimuliert werden, und der Anteil der Zellen, die eine synaptische DYS-Hemmung erhalten, steigt schnell auf eins an, wenn eine zunehmende Anzahl von Parametallzellen stimuliert wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Spitzen der Pipetten sauber zu halten und die Gewebeverzerrung zu minimieren, indem Blutgefäße und andere Zellen während der Annäherungsphase vermieden werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Methoden, wie z. B. die Photostimulation, eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Innovation der gepatchten Klemmzellen durch einen anderen Zelltyp. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Patch-Clamp-Verfahren für mehrere Neuronen beschleunigen und durchführen können.

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