Name: Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie automatisiertes bildgeführtes Patch-Clamp zur Untersuchung von Neuronen in akuten Gehirnschnitten. Diese Methode steigert die Effizienz elektrophysiologischer Aufzeichnungen erheblich.

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Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der Whitehall Foundation. Wir danken Samuel T. Kissinger für die wertvollen Kommentare.

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
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<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
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<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

Eine nicht vorläufige Patentanmeldung &quot;SYSTEME UND METHODEN FÜR AUTOMATISIERTE BILDGEFÜHRTE PATCH-CLAMP-ELEKTROPHYSIOLOGIE IN VITRO&quot; US Serial Nr .: 15 / 353,719, wurde am 16. November 2016 eingereicht, Ref. Nr .: PRF 67270-02.

Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwende...

Die Patch - Clamp - Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen 1 zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet - sowohl in vitro als auch in vivo - in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen 2 . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch-Pipette in der Nähe der Zelle zu bewegen, die Anwendung von positiven und negativen Druck auf die Pipette zur richtigen Zeit, um eine enge Gigaseal Patch, Und ein Einbruch, um eine Ganzzell-Patch-Konfiguration zu etablieren. Patch-Clamping wird in der Regel manuell durchgeführt und erfordert umfangreiche Schulungen zu meistern. Auch für einen Forscher, der mit dem Patch erlebt wurdeKlemme, die Erfolgsquote ist relativ gering. In jüngster Zeit wurden mehrere Versuche unternommen, Patch-Clamp-Experimente zu automatisieren. Zwei Hauptstrategien haben sich entwickelt, um die Automatisierung zu erreichen: die Erweiterung der Standard-Patch-Clamp-Ausrüstung, um die automatische Steuerung des Patching-Prozesses und die Gestaltung neuer Geräte und Techniken von Grund auf zu ermöglichen. Die frühere Strategie ist an vorhandene Hardware anpassbar und kann in einer Vielzahl von Patch-Clamp-Anwendungen verwendet werden, einschließlich in vivo Blind Patch Clamp 3 , 4 , 5 , in vitro Patch Clamp von akuten Hirnschnitten, organotypischen Slice Kulturen und kultivierten dissoziierten Neuronen 6 . Es ermöglicht die Abfrage von komplexen lokalen Schaltungen durch die Verwendung mehrerer Mikromanipulatoren gleichzeitig 7 . Die Planar-Patch-Methode ist ein Beispiel für die neue Entwicklungsstrategie, die gleichzeitig den Hochdurchsatz erreichen kannAtch Klemme von Zellen in Suspension für Drogen-Screening-Zwecke 8 . Allerdings ist das Planar-Patch-Verfahren nicht für alle Zelltypen, insbesondere für Neuronen mit langen Prozessen oder intakten Schaltungen, die umfangreiche Verbindungen enthalten, anwendbar. Dies beschränkt seine Anwendung auf die Abbildung der komplizierten Schaltungen des Nervensystems, was ein wichtiger Vorteil der traditionellen Patch-Clamp-Technologie ist. Wir haben ein System entwickelt, das den manuellen Patch-Clamp-Prozess in vitro automatisiert, indem er Standard-Patch-Clamp-Hardware erweitert. Unser System, Autopatcher IG, bietet automatische Pipettenkalibrierung, Fluoreszenzzelle Zielidentifikation, automatische Steuerung der Pipettenbewegung, automatisches Ganzzellpatching und Datenlogging. Das System kann automatisch mehrere Bilder von Gehirnscheiben in verschiedenen Tiefen erwerben; Analysiere sie mit Computer Vision; Und extrahieren Informationen, einschließlich der Koordinaten von fluoreszenzmarkierten Zellen. Diese Information kann dann seinVerwendet, um zu zielen und automatisch patch Zellen von Interesse. Die Software ist in Python geschrieben - eine freie, Open-Source-Programmiersprache - mit mehreren Open-Source-Bibliotheken. Dies sorgt für die Zugänglichkeit für andere Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit und Strenge der elektrophysiologischen Experimente. Das System ist modular aufgebaut, so dass zusätzliche Hardware problemlos mit dem hier dargestellten System verbunden werden kann.

<table><tbody><tr><td>CCD-Kamera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophysiologie-Rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Inklusive Mikroskop und Manipulatoren. Die vom Hersteller zur Verfügung gestellte Software zur Steuerung des Manipulators, die in diesem Manuskript demonstriert wird, ist " Linlab2".</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computergesteuerter Mikroelektrodenverstärker</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED-Lichtquelle</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>Wellenlänge 488 nm</td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Sekundäre Datenerfassung. Siehe Handbuch unter : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Magnetventile</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Luftpumpe</td><td>Virtuelle Industrie</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Luftdrucksensor</td><td>Freescale Semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice Niederhalter</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, flach für RC-40 Kammer, 2,0 mm, 19,7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>Version 2.7 (32-Bit für Windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Schraubklemmen</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Schraubklemmen 3,5 mm Raster (2-polig)</td></tr><tr><td>(2-polig)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Kanal MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Steckdosen Lötfahne - 8-polig</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Rot 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Grün</td><td>5mm Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Hohlstecker/Steckverbinder (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wandadapter Netzteil - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Anschlusskabel - Sortiment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Verriegelung Stecker x Buchse x Buchse Absperrhahn</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Schläuche</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Außendurchmesser: 1/8 Zoll Innendurchmesser: 1/16 Zoll</td></tr><tr><td>BNC-Stecker auf BNC-Stecker Koaxialkabel</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Widerstand (5% Toleranz)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung von automatisierten bild-geführten patch-clamp für die studie von neuronen in gehirn-scheiben

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.

<html> Unser System wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zellen in akuten Hirnschnitten, Maus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert in Neuronen, und HEK 293 Zellen künstlich ausdrücken Kanäle von Interesse. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit Thy1-ChR2-YFP-transgenen Mäusen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), die auf fluoreszenzmarkierte Schicht-5-Pyramiden-Neuronen im visuellen Kortex zielen. Die Zielzelle war eine der automatisch...

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technologie besteht darin, mithilfe von Computer Vision fluoreszierende Zellen automatisch zu erkennen und an diesen Zellen in akuten Hirnschnitten eine automatisierte Patch-Clamp-Aufnahme durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Schwierigkeiten im Bereich der Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu überwinden, wie beispielsweise die Identifizierung, gezielte Ansteuerung und die Patch-Clamp-Aufnahme fluoreszenzmarkierter Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Patch-Pipetten und fluoreszierende Zellen automatisch erkennen sowie diese Schritte mit der automatischen Patch-Clamp-Technik verbinden kann.Diese Innovation erhöht die experimentelle Durchsatzkapazität erheblich. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie oder Diagnose neurologischer Erkrankungen, da eine hochdurchsatzfähige, bildgesteuerte automatische Patch-Clamp-Methode für pharmakologische Untersuchungen in physiologischeren neuronalen Präparationen eingesetzt werden kann. Diese Methode kann außerdem auf andere In-vitro-Präparationen angewendet werden, wie beispielsweise neuronale Organelltypen oder Schnittkulturen, dissoziierte Neuronen sowie beliebige nicht-neuronale Zellen.Um dieses Verfahren zu beginnen, schalten Sie den Verstärker, die Mikroskopsteuerung und die Manipulatorsteuerung ein. Führen Sie anschließend Autopatcher IG mit Python über ein Befehlszeilenterminal aus, indem Sie zuerst das Verzeichnis wechseln, in dem Autopatcher IG installiert ist. Geben Sie danach „Python Autopatcher_IG“ ein.PYW in das Befehlszeilen-Terminal eingeben und die Eingabetaste drücken. Danach die gesamte Glaspipette mit Innenlösung füllen und auf die Kopfstufe aufsetzen. Die Pipettenspitze in das mikroskopische Sichtfeld bewegen und scharfstellen.Wenn das Ziffernfeld verwendet wird, um die Manipulatoren auf dem Mikroskoptisch zu bewegen, aktualisieren Sie die Koordinaten, indem Sie die Taste Z auf der Tastatur drücken. Die primäre Kalibrierung wandelt den Winkel und die Bewegungsstrecke des Manipulators in das Koordinatensystem des Mikroskops um. Der Manipulator bewegt sich in drei Richtungen mit voreingestellter Distanz, und die Software erfasst die Koordinaten der Pipettenspitze innerhalb des mikroskopischen Sichtfelds.Klicken Sie im Haupt-GUI auf die Schaltfläche „Kalibrierung starten“ für die entsprechende Einheit, auf der die Pipette montiert ist. Speichern Sie die Kalibrierung anschließend, indem Sie im Haupt-GUI unten auf „Kalibrierung speichern“ klicken. Diese Erstkalibrierung muss nur einmal durchgeführt werden, es sei denn, die physikalische Anordnung des Aufbaus wird geändert.In diesem Schritt eine Gehirnscheibe in die Mitte der Ableitungskammer legen. Die Gehirnscheibe mit einer Schnittfixierung oder einer Harfe stabilisieren. Um die fluoreszierende Zelle zu detektieren, den interessierenden Bereich unter vierfacher Vergr&ouml;&szlig;erung finden.Danach bewegen Sie den Mikroskoptisch, indem Sie den „Click-to-Move“-Modus aktivieren und auf die Mitte des gewünschten Bereichs klicken. Alternativ können Sie den Mikroskoptisch mithilfe des Ziffernblocks bewegen. Wechseln Sie anschließend zum Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie die Fokussierung ein, indem Sie das Mikroskop entlang der Z-Achse mit der RF-Taste auf dem Ziffernblock bewegen.Die Software steuert das Mikroskop und die Kamera, um eine Reihe von Bildern in verschiedenen Tiefen aufzunehmen. Anschließend werden diese Bilder einer Bildverarbeitung unterzogen, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu finden. Die endgültige Ausgabe ist eine Liste der erkannten Zellkoordinaten.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Zelle erkennen“ in der Haupt-GUI-Spalte Einheit null. Wenn die LED- oder Laserlichtquelle der Aufbauten nicht über das TTL-Signal gesteuert werden kann, schalten Sie die LED oder den Laser manuell ein. Schalten Sie die LED oder den Laser gegebenenfalls wieder aus.Eine Liste der Zellkoordinaten wird im Speicherpositionen-GUI angezeigt. Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie auf die Schaltfläche X neben den Koordinaten klicken. Alternativ, wenn Zielzellen nicht fluoreszenzmarkiert sind, klicken Sie im Haupt-GUI auf den Mausmodus.Klicken Sie dann auf die gewünschte Zelle. Ein gelber Punkt mit einer Zahl erscheint auf der Zelle, und die Koordinaten der Zelle werden in der Speicherpositionen-GUI angezeigt. Um eine sekundäre Kalibrierung zur Bestimmung der Pipetten-Offset-Koordinaten durchzuführen, füllen Sie ein Drittel einer Glaspipette mit der internen Lösung. Laden Sie anschließend die Pipette in den Pipettenhalter, der am Kopfstück befestigt ist.Verwenden Sie bei niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung die Tasten Eins und Zwei auf dem Ziffernblock, um zwischen Einheit eins und Einheit zwei zu wechseln. Bringen Sie dann die Pipette ins Sichtfeld und stellen Sie die Fokussierung &uuml;ber den Ziffernblock ein. Laden Sie anschlie&szlig;end die Prim&auml;rkali­brierung, indem Sie auf Kali­brierung laden klicken.Wechseln Sie das Mikroskopobjektiv auf hohe Vergrößerung und klicken Sie 40-mal auf die Haupt-GUI. Bringen Sie die Pipettenspitze in die Mitte. Klicken Sie dann auf die sekundäre Kalibrierungsschaltfläche in der Haupt-GUI unter der verwendeten Einheit.Um eine Zielzelle zu patchen, klicken Sie auf die Patch-Steuerungsschaltfläche, um die Patch-Steuerungs-GUI zu öffnen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Gehe zu“ neben der gewünschten Zelle in der Koordinatenliste der Speicherpositions-GUI. Anschließend klicken Sie in der Haupt-GUI auf die CTM-Schaltfläche der Einheit, um die Bewegung zu aktivieren.Klicken Sie auf die gewünschte Zelle, um die Pipettenspitze zur Zelle zu bewegen. Aufgrund mechanischer Einschränkungen des Manipulators kann es bei Wegstrecken von mehr als 500 Mikrometer zu einer geringfügigen Positionsabweichung kommen. Um eine größere mechanische Positionsabweichung zu vermeiden, sollte eine sekundäre Kalibrierung in der Nähe der Zielzelle durchgeführt werden.Als Nächstes verwenden Sie die Einheitsauswahl-Schaltfläche, um das Eingangssignal zwischen den beiden Einheiten umzuschalten. Klicken Sie auf die „Patch“-Schaltfläche in der Patch-Steuerungs-GUI. Der automatische Patch-Vorgang beginnt, und der Druck sowie der Widerstand können über die Patch-Steuerungs-GUI überwacht werden.Der automatische Patch-Algorithmus überwacht den Widerstand und steuert den Druck über eine Reihe von logischen Schleifen, um eine Gigaseal zu bilden. Ein Popup-Fenster meldet die Bildung der Gigaseal. Das System nutzt die Änderung des Widerstands, um den Kontakt zwischen Zelle und Oberfläche zu erkennen.Wenn der Zelloberflächenkontakt nicht rechtzeitig erkannt wird, verwenden Sie die nächste Schaltfläche, um die Patch-Stufe voranzutreiben, während Sie im selben automatischen Patch-Versuch verbleiben. Steuern Sie den automatischen Prozess jederzeit, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der Patch-Steuerungs-GUI klicken. Wählen Sie anschließend „Ja“, um mit kombiniertem Zap und Saugung einzudringen.Alternativ wählen Sie „Nein“, um nur mit Saugung zu perforieren. Danach speichern Sie das Patch-Log der Experimente. Diese Abbildung zeigt die ausgewählten Positionen, die in die Befehlssequenz-GUI geladen wurden.Die linke Spalte zeigt die Liste der Koordinaten und die rechte Spalte die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jeden Standort. Hier sind die Bildschirmfotos während des Medikamentenapplikationsversuchs, die den drei ausgewählten Positionen entsprechen. KCL-Lösung wurde mit rotem fluoreszierendem Farbstoff zur Visualisierung gemischt.Einheit eins war die Pipette mit KCL und Einheit zwei die Patch-Pipette. In dieser Abbildung zeigen die schrittweisen Strominjektionen ein regelmäßiges Aktionspotenzialfeuern des Neurons. Dargestellt sind hier die Spannungsclamp-Aufzeichnungssignale nach lokaler Applikation einer 500 Millimolar Kaliumchloridlösung an drei Positionen.Die rote Spur mit dem einwärts gerichteten Strom wurde bei dem Versuch aufgezeichnet, bei dem die Applikation von Kaliumchlorid nahe an der Patch-Zelle erfolgte. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Kaliumchlorid-Applikation an. Mit dieser Methode kann man einen Patch-Clamp-Versuch innerhalb von vier Minuten durchführen, ohne dass umfangreiche Schulung im Vergleich zur manuellen Patch-Technik erforderlich ist.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Optogenetik, Chemogenetik und pharmakologische Eingriffe angewendet werden, um Fragen im Zusammenhang mit Ihrem Forschungsprojekt zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften den Weg zu hochdurchsatzfähigen Studien von synaptischen Rezeptoren und Ionenkanälen in verschiedenen in-vitro-Präparationen ebnen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bildgeführte automatisierte Patch-Clamp-Experimente durchführt.

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Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Patch-Clamp-Aufzeichnung von der dendritischen Membranoberfläche. Dies hilft dabei, die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und den zugrundeliegenden spannungsgesteuerten Ionenkanälen in dopaminergen Neuronen direkt zu untersuchen.

Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom Dendriten eines dopaminergen Neurons in einem Hirnschnitt

Dieses Video zeigt, wie eine feine Pipette in der Nähe von Hirnschnitten positioniert wird, um eine Versiegelung mit einer neuronalen Zelle zu bilden. Durch den Sog wird die Zellmembran aufgebrochen, wodurch eine Ganzzell-Patch-Klemme entsteht, die Strommessungen für elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Etablierung einer Ganzzell-Voltage-Clamp-Konfiguration für elektrophysiologische Aufzeichnungen in Hirnschnitten

Dieses Video beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Abbildung und Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von transgenen Gehirnschnitten, die neuronenspezifische fluoreszierende Proteine enthalten. Das Verfahren besteht darin, den Hirnschnitt in einer Perfusionskammer mit belüfteter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu halten, fluoreszenzmarkierte Zellen mit einer Lichtquelle anzuregen und die elektrischen Signale mit einer Mehrkanalsonde und einer Patch-Klemme aufzuzeichnen.

Gleichzeitige optische und elektrophysiologische Überwachung von neuronalen Zellen in Hirnschnitten

In diesem Video werden Hirnschnitte in einer Aufnahmekammer immobilisiert und die interessierenden Zellen mit einem computergesteuerten Mikroskop lokalisiert und fokussiert. Das automatisierte Bildverarbeitungssystem positioniert dann präzise eine Patch-Pipette, um die Zellmembran zu versiegeln und elektrische Signale zu überwachen.

Automatisierte bildgeführte Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung von Neuronen in Hirnschnitten

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kartierung synaptischer Verbindungen durch Sichern eines Gehirnschnitts, Positionieren von Pipetten, um Ganzzellkonfigurationen zu erreichen, und Stimulierung präsynaptischer Neuronen, um postsynaptische Reaktionen aufzuzeichnen, wodurch die neuronale Konnektivität aufgeklärt wird.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Erfahren Sie automatisiertes bildgeführtes Patch-Clamp zur Untersuchung von Neuronen in akuten Gehirnschnitten. Diese Methode steigert die Effizienz elektrophysiologischer Aufzeichnungen erheblich.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

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