Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Das übergeordnete Ziel dieser Technologie besteht darin, mithilfe von Computer Vision fluoreszierende Zellen automatisch zu erkennen und an diesen Zellen in akuten Hirnschnitten eine automatisierte Patch-Clamp-Aufnahme durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Schwierigkeiten im Bereich der Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu überwinden, wie beispielsweise die Identifizierung, gezielte Ansteuerung und die Patch-Clamp-Aufnahme fluoreszenzmarkierter Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Patch-Pipetten und fluoreszierende Zellen automatisch erkennen sowie diese Schritte mit der automatischen Patch-Clamp-Technik verbinden kann.

Diese Innovation erhöht die experimentelle Durchsatzkapazität erheblich. Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zur Therapie oder Diagnose neurologischer Erkrankungen, da eine hochdurchsatzfähige, bildgesteuerte automatische Patch-Clamp-Methode für pharmakologische Untersuchungen in physiologischeren neuronalen Präparationen eingesetzt werden kann. Diese Methode kann außerdem auf andere In-vitro-Präparationen angewendet werden, wie beispielsweise neuronale Organelltypen oder Schnittkulturen, dissoziierte Neuronen sowie beliebige nicht-neuronale Zellen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, schalten Sie den Verstärker, die Mikroskopsteuerung und die Manipulatorsteuerung ein. Führen Sie anschließend Autopatcher IG mit Python über ein Befehlszeilenterminal aus, indem Sie zuerst das Verzeichnis wechseln, in dem Autopatcher IG installiert ist. Geben Sie danach „Python Autopatcher_IG“ ein.

PYW in das Befehlszeilen-Terminal eingeben und die Eingabetaste drücken. Danach die gesamte Glaspipette mit Innenlösung füllen und auf die Kopfstufe aufsetzen. Die Pipettenspitze in das mikroskopische Sichtfeld bewegen und scharfstellen.

Wenn das Ziffernfeld verwendet wird, um die Manipulatoren auf dem Mikroskoptisch zu bewegen, aktualisieren Sie die Koordinaten, indem Sie die Taste Z auf der Tastatur drücken. Die primäre Kalibrierung wandelt den Winkel und die Bewegungsstrecke des Manipulators in das Koordinatensystem des Mikroskops um. Der Manipulator bewegt sich in drei Richtungen mit voreingestellter Distanz, und die Software erfasst die Koordinaten der Pipettenspitze innerhalb des mikroskopischen Sichtfelds.

Klicken Sie im Haupt-GUI auf die Schaltfläche „Kalibrierung starten“ für die entsprechende Einheit, auf der die Pipette montiert ist. Speichern Sie die Kalibrierung anschließend, indem Sie im Haupt-GUI unten auf „Kalibrierung speichern“ klicken. Diese Erstkalibrierung muss nur einmal durchgeführt werden, es sei denn, die physikalische Anordnung des Aufbaus wird geändert.

In diesem Schritt eine Gehirnscheibe in die Mitte der Ableitungskammer legen. Die Gehirnscheibe mit einer Schnittfixierung oder einer Harfe stabilisieren. Um die fluoreszierende Zelle zu detektieren, den interessierenden Bereich unter vierfacher Vergrößerung finden.

Danach bewegen Sie den Mikroskoptisch, indem Sie den „Click-to-Move“-Modus aktivieren und auf die Mitte des gewünschten Bereichs klicken. Alternativ können Sie den Mikroskoptisch mithilfe des Ziffernblocks bewegen. Wechseln Sie anschließend zum Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie die Fokussierung ein, indem Sie das Mikroskop entlang der Z-Achse mit der RF-Taste auf dem Ziffernblock bewegen.

Die Software steuert das Mikroskop und die Kamera, um eine Reihe von Bildern in verschiedenen Tiefen aufzunehmen. Anschließend werden diese Bilder einer Bildverarbeitung unterzogen, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu finden. Die endgültige Ausgabe ist eine Liste der erkannten Zellkoordinaten.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Zelle erkennen“ in der Haupt-GUI-Spalte Einheit null. Wenn die LED- oder Laserlichtquelle der Aufbauten nicht über das TTL-Signal gesteuert werden kann, schalten Sie die LED oder den Laser manuell ein. Schalten Sie die LED oder den Laser gegebenenfalls wieder aus.

Eine Liste der Zellkoordinaten wird im Speicherpositionen-GUI angezeigt. Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie auf die Schaltfläche X neben den Koordinaten klicken. Alternativ, wenn Zielzellen nicht fluoreszenzmarkiert sind, klicken Sie im Haupt-GUI auf den Mausmodus.

Klicken Sie dann auf die gewünschte Zelle. Ein gelber Punkt mit einer Zahl erscheint auf der Zelle, und die Koordinaten der Zelle werden in der Speicherpositionen-GUI angezeigt. Um eine sekundäre Kalibrierung zur Bestimmung der Pipetten-Offset-Koordinaten durchzuführen, füllen Sie ein Drittel einer Glaspipette mit der internen Lösung. Laden Sie anschließend die Pipette in den Pipettenhalter, der am Kopfstück befestigt ist.

Verwenden Sie bei niedriger Vergrößerung die Tasten Eins und Zwei auf dem Ziffernblock, um zwischen Einheit eins und Einheit zwei zu wechseln. Bringen Sie dann die Pipette ins Sichtfeld und stellen Sie die Fokussierung über den Ziffernblock ein. Laden Sie anschließend die Primärkali­brierung, indem Sie auf Kali­brierung laden klicken.

Wechseln Sie das Mikroskopobjektiv auf hohe Vergrößerung und klicken Sie 40-mal auf die Haupt-GUI. Bringen Sie die Pipettenspitze in die Mitte. Klicken Sie dann auf die sekundäre Kalibrierungsschaltfläche in der Haupt-GUI unter der verwendeten Einheit.

Um eine Zielzelle zu patchen, klicken Sie auf die Patch-Steuerungsschaltfläche, um die Patch-Steuerungs-GUI zu öffnen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Gehe zu“ neben der gewünschten Zelle in der Koordinatenliste der Speicherpositions-GUI. Anschließend klicken Sie in der Haupt-GUI auf die CTM-Schaltfläche der Einheit, um die Bewegung zu aktivieren.

Klicken Sie auf die gewünschte Zelle, um die Pipettenspitze zur Zelle zu bewegen. Aufgrund mechanischer Einschränkungen des Manipulators kann es bei Wegstrecken von mehr als 500 Mikrometer zu einer geringfügigen Positionsabweichung kommen. Um eine größere mechanische Positionsabweichung zu vermeiden, sollte eine sekundäre Kalibrierung in der Nähe der Zielzelle durchgeführt werden.

Als Nächstes verwenden Sie die Einheitsauswahl-Schaltfläche, um das Eingangssignal zwischen den beiden Einheiten umzuschalten. Klicken Sie auf die „Patch“-Schaltfläche in der Patch-Steuerungs-GUI. Der automatische Patch-Vorgang beginnt, und der Druck sowie der Widerstand können über die Patch-Steuerungs-GUI überwacht werden.

Der automatische Patch-Algorithmus überwacht den Widerstand und steuert den Druck über eine Reihe von logischen Schleifen, um eine Gigaseal zu bilden. Ein Popup-Fenster meldet die Bildung der Gigaseal. Das System nutzt die Änderung des Widerstands, um den Kontakt zwischen Zelle und Oberfläche zu erkennen.

Wenn der Zelloberflächenkontakt nicht rechtzeitig erkannt wird, verwenden Sie die nächste Schaltfläche, um die Patch-Stufe voranzutreiben, während Sie im selben automatischen Patch-Versuch verbleiben. Steuern Sie den automatischen Prozess jederzeit, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der Patch-Steuerungs-GUI klicken. Wählen Sie anschließend „Ja“, um mit kombiniertem Zap und Saugung einzudringen.

Alternativ wählen Sie „Nein“, um nur mit Saugung zu perforieren. Danach speichern Sie das Patch-Log der Experimente. Diese Abbildung zeigt die ausgewählten Positionen, die in die Befehlssequenz-GUI geladen wurden.

Die linke Spalte zeigt die Liste der Koordinaten und die rechte Spalte die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jeden Standort. Hier sind die Bildschirmfotos während des Medikamentenapplikationsversuchs, die den drei ausgewählten Positionen entsprechen. KCL-Lösung wurde mit rotem fluoreszierendem Farbstoff zur Visualisierung gemischt.

Einheit eins war die Pipette mit KCL und Einheit zwei die Patch-Pipette. In dieser Abbildung zeigen die schrittweisen Strominjektionen ein regelmäßiges Aktionspotenzialfeuern des Neurons. Dargestellt sind hier die Spannungsclamp-Aufzeichnungssignale nach lokaler Applikation einer 500 Millimolar Kaliumchloridlösung an drei Positionen.

Die rote Spur mit dem einwärts gerichteten Strom wurde bei dem Versuch aufgezeichnet, bei dem die Applikation von Kaliumchlorid nahe an der Patch-Zelle erfolgte. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Kaliumchlorid-Applikation an. Mit dieser Methode kann man einen Patch-Clamp-Versuch innerhalb von vier Minuten durchführen, ohne dass umfangreiche Schulung im Vergleich zur manuellen Patch-Technik erforderlich ist.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Optogenetik, Chemogenetik und pharmakologische Eingriffe angewendet werden, um Fragen im Zusammenhang mit Ihrem Forschungsprojekt zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften den Weg zu hochdurchsatzfähigen Studien von synaptischen Rezeptoren und Ionenkanälen in verschiedenen in-vitro-Präparationen ebnen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bildgeführte automatisierte Patch-Clamp-Experimente durchführt.