Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben
31. Juli 2017
Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.
Das übergeordnete Ziel dieser Technologie ist es, mithilfe von Computer Vision fluoreszierende Zellen automatisch zu erkennen und eine automatisierte Patch-Clamp dieser Zellen in akuten Hirnschnitten durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Schwierigkeiten im Bereich der Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu überwinden, wie z. B. die Identifizierung, das Targeting und die Patch-Clamp von fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Patch-Pipetten und Fluoreszenzzellen automatisch erkennen und die Schritte in die automatische Patch-Klemme integrieren kann.
Diese Innovation erhöht den experimentellen Durchsatz erheblich. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose neurologischer Störungen, da die bildgesteuerte automatische Patch-Klemme mit hohem Durchsatz für pharmakologische Screenings in physiologischeren neuronalen Präparaten verwendet werden kann. Diese Methode kann auch auf andere in vitro Präparate angewendet werden, wie z. B. neuronale Organellen-typische oder Schnittkulturen, dissoziierte Neuronen sowie alle nicht-neuronalen Zellen.
Um diesen Vorgang zu starten, schalten Sie den Verstärker, den Mikroskop-Controller und den Manipulator-Controller ein. Führen Sie dann Autopatcher IG mit python von einem Befehlszeilenterminal aus aus, indem Sie zuerst das Verzeichnis ändern, in dem Autopatcher IG installiert ist. Geben Sie als Nächstes Python Autopatcher_IG ein.
PYW im Befehlszeilenterminal und drücken Sie die Eingabetaste. Füllen Sie danach die gesamte Glaspipette mit innerer Lösung und geben Sie sie auf den Kopftisch. Bewegen Sie die Pipettenspitze in das Gesichtsfeld des Mikroskops und bringen Sie es in den Fokus.
Wenn die Wähltastatur zum Bewegen der Manipulatoren im Mikroskoptisch verwendet wird, aktualisieren Sie die Koordinaten, indem Sie Z auf der Tastatur drücken. Die primäre Kalibrierung wandelt den Bewegungswinkel und die Entfernung des Manipulators in das Koordinatensystem des Mikroskops um. Der Manipulator bewegt sich in drei Richtungen mit voreingestelltem Abstand und die Software erkennt die Koordinaten der Pipettenspitze innerhalb des Gesichtsfelds des Mikroskops.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Kalibrierung starten" in der Hauptbenutzeroberfläche für die entsprechende Einheit, auf der die Pipette geladen ist. Speichern Sie anschließend die Kalibrierung, indem Sie unten in der Haupt-GUI auf Kalibrierung speichern klicken. Diese primäre Kalibrierung muss nur einmal durchgeführt werden, es sei denn, die physische Organisation des Prüfgeräts wird geändert.
Platzieren Sie in diesem Schritt eine Gehirnscheibe in der Mitte der Aufnahmekammer. Stabilisieren Sie die Gehirnscheibe mit einem Schnitthaltegriff oder einer Harfe. Um die Fluoreszenzzelle zu erkennen, suchen Sie den interessierenden Bereich unter der vierfachen Vergrößerung.
Verschieben Sie dann den Mikroskoptisch, indem Sie den Klickmodus aktivieren und auf die Mitte des Interessenbereichs klicken. Alternativ können Sie den Mikroskoptisch über die Tastatur bewegen. Wechseln Sie als Nächstes zum Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie den Fokus ein, indem Sie das Mikroskop mit RF auf der Tastatur in der Z-Achse bewegen.
Die Software steuert das Mikroskop und die Kamera, um eine Reihe von Bildern in unterschiedlichen Tiefen aufzunehmen. Dann werden diese Bilder einer Computer-Vision-Verarbeitung unterzogen, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu finden. Die endgültige Ausgabe ist eine Liste der erkannten Zellenkoordinaten.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zelle erkennen" in der Hauptspalte der GUI-Spalte Einheit Null. Wenn die LED- oder Laserlichtquelle des Setups nicht über das TTL-Signal gesteuert werden kann, schalten Sie die LED oder den Laser manuell ein. Schalten Sie die LED oder den Laser bei Bedarf aus.
Eine Liste der Zellenkoordinaten wird in der Benutzeroberfläche für Speicherpositionen angezeigt. Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie auf die Schaltfläche X neben den Koordinaten klicken. Wenn die Zielzellen nicht fluoreszenzmarkiert sind, klicken Sie alternativ auf den Mausmodus in der Hauptbenutzeroberfläche.
Klicken Sie dann auf die gewünschte Zelle, ein gelber Punkt mit einer Zahl erscheint auf der Zelle und die Koordinaten der Zelle werden in der Benutzeroberfläche für Speicherpositionen angezeigt. Um eine Sekundärkalibrierung durchzuführen und die Pipetten-Offset-Koordinaten zu ermitteln, füllen Sie 1/3 einer Glaspipette mit interner Lösung. Laden Sie dann die Pipette auf den Pipettenhalter, der am Kopftisch befestigt ist.
Bei geringer Vergrößerung verwenden Sie die Tastenkombination eins und zwei, um zwischen Einheit eins und Einheit zwei zu wechseln. Bringen Sie dann die Pipette in das Gesichtsfeld und stellen Sie den Fokus über die Tastatur ein. Laden Sie anschließend die primäre Kalibrierung, indem Sie auf Lastkalibrierung klicken.
Schalten Sie das Mikroskopobjektiv auf hohe Vergrößerung um und klicken Sie 40 Mal auf die Hauptbenutzeroberfläche. Bringen Sie die Pipettenspitze in die Mitte. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche für die sekundäre Kalibrierung in der Haupt-GUI unter dem Gerät, das verwendet wird.
Um eine Zielzelle zu patchen, klicken Sie auf die Schaltfläche Patch-Steuerung, um die Patch-Steuerungs-GUI zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Gehe zu neben der gewünschten Zelle in der Koordinatenliste in der Benutzeroberfläche für die Speicherposition. Klicken Sie anschließend auf die CTM-Schaltfläche des Geräts in der Hauptbenutzeroberfläche, um die Bewegung zu aktivieren.
Klicken Sie auf die gewünschte Zelle, um die Pipettenspitze in die Zelle zu bewegen. Aufgrund der mechanischen Begrenzung des Manipulators kann es bei einer Entfernung von mehr als 500 Mikrometern zu einem leichten Positionierungsfehler kommen. Um einen großen mechanischen Positionierungsfehler zu vermeiden, sollte die Sekundärkalibrierung in der Nähe der Zielzelle durchgeführt werden.
Verwenden Sie anschließend die Taste für die eins-ausgewählte Einheit, um das Eingangssignal zwischen den beiden Einheiten umzuschalten. Klicken Sie auf die Patch-Schaltfläche in der GUI der Patch-Steuerung. Das automatische Patchen beginnt und der Druck und der Widerstand können auf der Patch-Control-GUI überwacht werden.
Der automatische Patching-Algorithmus überwacht den Widerstand und steuert den Druck durch eine Reihe von Logikschleifen, um einen Gigaseal zu bilden. Ein Popup-Fenster benachrichtigt über die Bildung eines Gigaseals. Das System nutzt die Widerstandsänderung, um den Kontakt zwischen Zelle und Oberfläche zu erkennen.
In der Situation, dass der Kontakt zwischen Zelle und Oberfläche nicht rechtzeitig erkannt wird, verwenden Sie die Schaltfläche Weiter, um die Patchphase zu beenden, während Sie sich im selben automatischen Patching-Versuch befinden. Sie können den automatischen Prozess jederzeit manipulieren, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der Patch-Control-GUI klicken. Wählen Sie dann Ja, um mit kombiniertem Zap und Saugen einzubrechen.
Alternativ können Sie auch Nein wählen, um nur mit Saugen einzufahren. Speichern Sie dann das Patchprotokoll des Experiments. Diese Abbildung zeigt die ausgewählten Speicherorte, die in die Befehlssequenz-GUI geladen wurden.
In der linken Spalte wird die Liste der Koordinaten und in der rechten Spalte die Liste der Befehle in Form von TTL-Signalen für jede Position angezeigt. Hier sind die Screenshots während des Experiments zur Medikamentenapplikation, die den drei ausgewählten Orten entsprechen. Die KCL-Lösung wurde zu Visualisierungszwecken mit rotem Fluoreszenzfarbstoff gemischt.
Einheit eins war die KCL-haltige Pipette und Einheit zwei war die Patchpipet. In dieser Abbildung zeigen die Stufenstrominjektionen ein reguläres Spiking-Neuron. Hier ist die Spannungszange zu sehen, die Spuren von der lokalen Applikation von 500 millimolare Kaliumchloridlösung an drei Stellen aufzeichnet.
Die rote Spur mit nach innen gerichteten Strom wurde aus dem Versuch aufgezeichnet, als die Kaliumchlorid-Applikation in der Nähe der Patch-Zelle erfolgte. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Kaliumchlorid-Anwendung an. Mit dieser Methode kann man im Vergleich zum manuellen Patchen innerhalb von vier Minuten ohne umfangreiche Schulung einen Patch-Clamp-Versuch durchführen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Optogenetik, Chemogenetik und pharmakologische Manipulationen durchgeführt werden, um Fragen zu Ihrem Forschungsprojekt zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg ebnen, Hochdurchsatzstudien von synaptischen Rezeptoren und Ionenkanälen in verschiedenen In-vitro-Präparaten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bildgeführte automatisierte Patch-Clamp-Experimente durchführen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Durchführung automatischer bildgeführter Patch-Clamp-Experimente unter Verwendung fortschrittlicher Computer-Vision-Technologie. Dieser Ansatz verbessert die Effizienz der Identifizierung und Zielerfassung fluoreszenzmarkierter Zellen in akuten Gehirnschnitten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Elektrophysiologie
- Neurowissenschaften
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist entscheidend für die Untersuchung neuronaler Aktivität.
- Die Identifizierung und Zielerfassung spezifischer Zellen kann herausfordernd sein.
- Automatisierte Techniken können den experimentellen Durchsatz verbessern.
- Fluoreszente Markierung unterstützt die Identifizierung von Zellen.
Zweck der Studie
- Automatisierung der Detektion fluoreszierender Zellen für Patch-Clamp-Experimente.
- Steigerung der Effizienz elektrophysiologischer Aufzeichnungen.
- Erleichterung pharmakologischer Screenings in neuronalen Präparaten.
Verwendete Methoden
- Computer-Vision-Technologie zur Zelldetektion.
- Automatisiertes Patch-Clamp-Setup zur Aufzeichnung.
- Integration von Detektions- und Aufzeichnungsprozessen.
- Anwendung auf verschiedene in vitro neuronale Präparate.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Automatisierung der Zellidentifizierung und Patch-Clamping.
- Erhöhte Durchsatzleistung für elektrophysiologische Experimente.
- Potenzielle Anwendungen in der pharmakologischen Forschung.
- Vielseitigkeit bei der Anwendung auf verschiedene Zelltypen.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert die experimentelle Effizienz erheblich.
- Sie adressiert Schlüsselherausforderungen bei traditionellen Patch-Clamp-Methoden.
- Der Ansatz hat Auswirkungen auf die Forschung zu neurologischen Störungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
