Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, digitale Volumendaten von organischen Materialien zu generieren. Beispiele hierfür sind Embryonen und Embryogewebe von biomedizinischen Modellorganismen, Gewebeblöcke von erwachsenen Tieren und Menschen, einschließlich Haut- oder Muskelbiopsien und Materialien wie unbeschichtetes Papier und Hautersatzstoffe. HREM hilft bei der Beantwortung grundlegender Fragen in der Medizin und der biomedizinischen Forschung.

Es ermöglicht die dreidimensionale Analyse und Visualisierung von Organen und Geweben, z. B. von genetisch veränderten Mausembryonen oder manipulierten Kükenembryonen. Es ermöglicht auch die Analyse von Krebsmodellen sowie von Biopsien aus menschlichem oder tierischem Gewebe. Der Hauptvorteil von HREM besteht darin, dass es eine einfache Möglichkeit bietet, Stapel von Bildern zu erzeugen, die von nahezu histologischer Qualität sind.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf die Erforschung der Wundheilung unter Verwendung von Tiermodellen sowie auf das Spinnen und Reparieren von Gewebepathologien beim Menschen. Vorführen wird das Verfahren von BMR Marlene Rodler und Johannes Günther vorgeführt. Beide von der Medizinischen Universität Wien, Abteilung für Anatomie.

Beginnen Sie mit fixierten Embryonen oder embryonalem Gewebe von nicht mehr als 5 x 5 x 5 Kubikmillimetern. Entfernen Sie das Fixiermittel. Und fügen Sie PBS hinzu.

Waschen Sie bei vier Grad Celsius unter ständigem Schaukeln für 24 Stunden. Geben Sie 70 % Ethanol in die Röhrchen mit dem Gewebe und legen Sie die Proben bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Nach zwei bis drei Stunden werden die Proben jeweils zwei bis drei Stunden lang in Ethanollösungen mit zunehmender Konzentration dehydriert.

Während die Proben dehydrieren, bereiten Sie die Infiltrationslösung vor, indem Sie 0,3125 g Benzoylperoxid und 0,1 g ESN zu 25 Millilitern Lösung A in ein Becherglas geben. Auf einer magnetischen Rührplatte bei vier Grad Celsius zwei bis drei Stunden lang rühren, bis sich ESN und Katalysator vollständig aufgelöst haben. Legen Sie die Proben in eine Infiltrationslösung.

Und schütteln oder drehen Sie die Proben 12 bis 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Einbettlösung. Geben Sie einen Milliliter oder Lösung B auf 25 Milliliter frische Infiltrationslösung.

Füllen Sie nach der Vorbereitung der Formbecherschalen den tiefen Hohlraum der Formen mit Einbettlösung. Übertragen Sie die Proben mit einem Löffel in die Formen. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig mit Einbettungslösung bedeckt ist, um Lufteinschlüsse zu vermeiden.

Richten Sie die Probe mit Nadeln oder Pinzetten in der Form aus. Es ist wichtig, die Ausrichtung der Probe während des Einbettens zu optimieren und ihre genaue Position auf der Blockoberfläche zu markieren. Auf diese Weise kann der interessierende Bereich klein gehalten und das Objektiv mit der höchstmöglichen Vergrößerung verwendet werden.

Sobald die Einbettlösung anfängt, viskos zu werden, setzen Sie einen Blockhalter auf die Form und fügen Sie die Einbettlösung durch das mittlere Loch des Blockhalters hinzu, bis die Einbettlösung ein bis zwei Millimeter über dem Boden des Blockhalters ansteigt. Versiegeln Sie die Formbecherschale, indem Sie sie mit flüssigem Paraffinwachs abdecken und warten Sie, bis sie ausgehärtet ist, bevor Sie sie bewegen. Lassen Sie die Blöcke die Polymerisation beenden, indem Sie die versiegelten Formbecherschalen ein bis zwei Tage bei Raumtemperatur lagern.

Für die Nachpolymerisation stellen Sie die Formbecherschalen mit den polymerisierten Blöcken in einen Standard-Laborofen und backen Sie sie mindestens ein bis zwei Tage lang bei 70 bis 80 Grad Celsius. Entferne die Blöcke aus den Formen. Identifizieren Sie dann das Sichtfeld, indem Sie weißes Licht schräg auf die Blockoberfläche richten.

Zeichnen Sie den Schatten der Probe mit dem schwarzen Marker auf der Blockoberfläche nach. Montieren Sie den Harzblock mit dem angegebenen Sichtfeld auf das Mikrotom und bewegen Sie den Blockhalter in seine Stoppposition. Starten Sie die Digitalkamera und die Datengenerierungssoftware und nehmen Sie ein Live-Bild auf.

Wählen Sie ein Objektiv mit geeigneter Vergrößerung, um den interessierenden Bereich abzudecken. Bewegen Sie die Optik nach oben und unten und das Mikrotom seitlich, bis der interessierende Bereich mit dem auf dem Computerbildschirm angezeigten Sichtfeld übereinstimmt. Schneiden Sie den Block so lange, bis die ersten Strukturen der Probe sichtbar werden.

Bewegen Sie das Mikrotom, um die Blockoberfläche in der Fokusebene der Optik anzuordnen. Wählen Sie eine Querschnittsdicke zwischen 0,5 und fünf Mikrometern. Nachdem Sie die Software gemäß den Anweisungen des Herstellers eingerichtet haben, starten Sie die Software und beginnen Sie mit der Datenerfassung.

Dieses HREM-Schnittbild zeigt einen sagittalen Schnitt durch einen Mausembryo, der am Embryonaltag 9.5 entnommen wurde. Dieses volumengerenderte 3D-Modell zeigt die Oberfläche dieses Embryos. Dieses Bild zeigt einen virtuellen sagittalen Schnitt durch ein volumengerendertes Modell des Halses des Mausembryos, der am Embryonaltag 15.5 entnommen wurde.

Das Oberflächenmodell zeigt die Lumina des Herz-Kreislauf-Systems in einer Volumendarstellung aller Gewebe eines Hühnerembryos, einem entwicklungsbedingten Hamburger Hamilton Stadium 18. Dieses Bild zeigt einen HREM-Schnitt durch einen menschlichen Nerv. Das Inlay vergrößert den Ausschnitt dieses Bildes.

Dieses Bild zeigt einen Teil eines HREM-Schnittbildes durch die Schweineleber. Dieses Bild zeigt ein volumengerendertes 3D-Modell einer Biopsie, das von einem menschlichen Daumenpolster entnommen wurde. Dieses Bild zeigt die oberflächengerenderten Modelle von Hautarterien, Venen und Nerven vor einer virtuellen Resektion durch HREM-Daten.

Diese Animation zeigt ein volumengerendertes Modell der dicken Haut eines menschlichen Daumenballens. Unterschiedliche Schwellenwerte und damit unterschiedliche Hautstrukturen, wie Blutgefäße, Nervenfasern, Schweißdrüsen und die Kanäle der Schweißdrüsen. HREM ermöglicht eine schnelle Visualisierung der Architektur von Fasermaterialien.

Dieses Bild zeigt ein volumengerendertes Modell von nativem dermalem Ersatzmaterial. Diese Animation zeigt das volumengerenderte Modell von Hautersatzmaterial. Beachten Sie die unterschiedliche Form und das Kaliber der Fasern.

Die Proben müssen dehydriert, infiltriert und in Harz eingebettet werden, so dass das gesamte Verfahren bis zu mehreren Tagen dauern kann, aber nur zwei bis drei Stunden Betriebsarbeiten zur Vorbereitung der Lösungen, zum Wechseln der Lösungen usw. umfasst. Die Datengenerierung selbst erfolgt vollautomatisch auf der HREM-Apparatur und es können 1000 Bilder in zwei bis drei Stunden erstellt werden. Nach seiner Entwicklung ebnete HREM den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie, um den Phänotyp mutierter Mausembryonen genau zu bewerten.

Ein Beispiel ist das Projekt zur Entschlüsselung von Entwicklungsstörungen (Decipfring Mechanisms of Developmental Disorders) oder DMDD, bei dem HREM zur Phänotypisierung, embryonal letale Mausembryonen in noch unbekannten Details, eingesetzt wird. Es stellte sich heraus, dass HREM auch eine hervorragende Alternative zur Lagelichtmikroskopie ist, um Blutgefäße, Nerven oder Faserarchitektur in menschlichen Gewebeproben zu untersuchen.