Quantifizierung von Mikroorganismen in geringen Konzentrationen mit Hilfe digitalen holographischen Mikroskopie (DHM)

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Nachweis von Mikroorganismen in sehr geringen Mengen mit Hilfe der digitalen holographischen Mikroskopie zu demonstrieren. Diese Technik ist empfindlicher als die herkömmliche Lichtmikroskopie und liefert Echtzeitinformationen über das Verhalten von Bakterien. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biologischen und kosmologischen Bereich zu beantworten, etwa bei der Suche nach pathogenen Organismen im Wasser oder bei Leben in unserem Sonnensystem auf Eismonden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich bei DHM um eine volumetrische Technik handelt, was bedeutet, dass wir dreidimensionale Informationen sofort auf unserer Probe erfassen können, ohne dass wir physisch neu fokussieren müssen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Blutstrom- oder Liquorinfektionen, da niedrige Bakterienkonzentrationen nachgewiesen werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, wird am Tag des Experiments eine spektrophotometrische Messung der bakteriellen Masterkultur durchgeführt, die voraussichtlich im Bereich von 0,6 bis 0,7 liegen wird.

Entnehmen Sie dann eine Probe der Masterkultur und zählen Sie die Zellen direkt mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer, um sowohl lebende als auch tote Zellen zu zählen. Übertragen Sie eine 10-Mikroliter-Probe der unverdünnten Kultur mit einer Mikropipette in die Kammer. Bilden Sie es unter einem hohen trockenen Objektivmikroskop mit Phasenkontrast ab.

Zählen Sie anschließend die Bakterien in mindestens 20 Quadraten und mitteln. Berechnen Sie die Konzentration als Durchschnitt von 20 Quadraten multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor. Um nur lebende Zellen aufzuzählen, führen Sie eine serielle Verdünnung jeder der ausgewählten Bakterienproben mit steriler 0,9%iger Kochsalzlösung durch, indem Sie 20 Mikroliter der Bakterienlösung in eine andere Vertiefung überführen und mit 180 Mikrolitern Kochsalzlösung verdünnen.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis die niedrigste Konzentration etwa 10 bis drei Zellen pro Milliliter beträgt. Als nächstes entnehmen Sie 100 Mikroliter der Proben aus mindestens zwei Verdünnungen und plattieren sie auf die entsprechenden Feststoffplatten. Verteilen Sie sie mit einem sterilen Streuer und führen Sie mindestens drei Wiederholungen jeder Verdünnung durch.

Inkubieren Sie sie danach über Nacht bei einer geeigneten Temperatur oder bis die Völker wachsen. Dann zähle die Völker. Berechnen Sie die koloniebildenden Einheiten und mitteln Sie über die Replikate.

Bei diesem Verfahren werden serielle Verdünnungen der Masterkultur für DHM und Post-DHM-Zählung von KBE auf Lysogeny-Bouillon-Medienplatten vorgenommen. Verdünnen Sie die Bakterien in 25 Milliliter eines minimalen Mediums, das die Beweglichkeit fördert, aber die Zellteilung hemmt, so dass sich die Konzentration der Zellen während des Experiments nicht nennenswert ändert. Um DHM-Videos aufzunehmen, ziehen Sie mit einer sterilen Spritze etwa 10 Milliliter der gewünschten Verdünnung auf.

Verbinden Sie dann die Spritze mit sterilen Anschlüssen und Schläuchen mit der DHM-Probenkammer. Fließen Sie die Probe aus der Spritze kontinuierlich mit einer Spritzenpumpe durch die Probenkammer. Während die Probe durch die Probenkammer fließt, erfassen Sie Hologramme nacheinander mit einer geeigneten Bildrate.

Lassen Sie ausreichend Zeit, damit die gesamten 10 Milliliter Probe durch das DHM fließen können. Um sicherzustellen, dass während der Experimente keine Bakterien wachsen oder absterben, inokulieren Sie die angereicherten Medienplatten mit 100 Mikrolitern des verbrauchten Mediums nach der DHM-Bildaufnahme, indem Sie es mit einem sterilen Spreader verteilen. Inkubieren Sie sie dann 24 Stunden lang bei der entsprechenden Temperatur, bevor Sie die Völker zählen.

Eine genaue Zellzählung ist unerlässlich, um die Nachweisgrenzen quantitativ zu bestimmen. Es ist wichtig, alle Verdünnungen mit großer Sorgfalt mit kalibrierten Mikropipetten durchzuführen und alle Zählungen durch optische Dichte, Beschichtung und direkte Zählung in der Petroff-Hausser-Kammer zu bestätigen. Um die Daten auf das Vorhandensein von Bakterien in den erfassten Hologrammvideos zu analysieren, führen Sie eine subtrahierte Filterung des Mediums durch, indem Sie die Bilder zuerst in ein 32-Bit-Format konvertieren.

Berechnen Sie dann den mittleren Pixelwert. Subtrahieren Sie abschließend diesen Medianwert von den einzelnen Pixeln, um stationäre Artefakte im Hologramm zu eliminieren. Zählen Sie danach die Anzahl der sichtbaren Bereichsringe und fokussierten Zellen manuell.

Jede Serie von Hologrammen wird von einer Zeitstempeldatei begleitet. Verwenden Sie die Zeitstempeldatei, um die Gesamtmenge der Probe zu berechnen, die zum Zeitpunkt der Aufnahme des Bildes gepumpt wurde. Berechnen Sie anschließend die Zelldichte, indem Sie die Gesamtzahl der erkannten Zellen durch das Gesamtvolumen der abgebildeten Probe dividieren.

Durchschnittlich fünf bis 10 Frames für genaue Statistiken. Dieses Diagramm zeigt die vorhergesagten Zellen pro Sichtfeld basierend auf einem Probenvolumen von 365 Mikrometern mal 365 Mikrometern mal einem Millimeter. Bei Konzentrationen, bei denen die Anzahl der Zellen pro Sichtfeld unter eins fällt, sind mehrere Bilder erforderlich, um eine Detektion zu erreichen.

Hierbei handelt es sich um eine DHM-Hologrammsequenz einer Serratia marcescens-Kultur mit 2.100 Zellen pro Milliliter, gemessen durch Plattenzahl. Die Sequenz zeigt etwa alle ein bis zwei Sekunden eine Zelle, was sehr gut zur Vorhersage passt. Und das ist eine weitere DHM-Hologrammsequenz einer Serratia marcescens-Kultur mit 620 Zellen pro Milliliter, gemessen durch Plattenzahl.

Diese Sequenz zeigt etwa alle sechs bis sieben Sekunden eine Zelle. Wenn Sie die digitale holographische Mikroskopie zur Abbildung von Zellen verwenden, denken Sie daran, Filtersterilisationstechniken zur Vorbereitung aller Lösungen zu verwenden. Dadurch wird vermieden, dass Feinstaub in das Gerät gelangt.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gesunde Zellkulturen vorzubereiten und zusätzliches Wachstumsmedium, Platten und Motilitätsmedium zur Hand zu haben. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Fluoreszenzfärbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. den Prozentsatz der Zellen, die lebendig und tot sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg, um die dreidimensionale Motilität in kultivierten Zellen und Umweltproben zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bakterien mithilfe der holografischen Mikroskopie aufzählen und die Ergebnisse mit anderen Zähltechniken validieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Bakterienkulturen äußerst gefährlich sein kann. Beim Anbau und Umgang mit lebenden Organismen sollten stets geeignete Biosicherheitsvorkehrungen getroffen werden.