Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Das übergeordnete Ziel dieses Workflows ist es, bestimmte Ziele für die ultrastrukturelle Bildgebung innerhalb eines Gewebes mittels Lichtmikroskopie zu identifizieren, gefolgt von 3D-Bildgebung in einem REM mit sehr hoher Auflösung. Der hier vorgestellte Bildgebungs-Workflow kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Zell- oder Gewebe-Ultrastruktur in einer Reihe von Bereichen zu beantworten, wie z. B. Zellbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften oder sogar Pathologie. Der Hauptvorteil der Technik, die eigentlich auf der Array-Tomographie basiert, besteht darin, dass das Aufteilen von Gewebe in Arrays von seriellen Schnitten die Identifizierung von Zielstrukturen erleichtert, selbst wenn sie zunächst im ursprünglichen Probenvolumen vergraben sind.

Die Array-Tomographie wurde ursprünglich im neurowissenschaftlichen Kontext eingeführt, kann aber auch auf eine Vielzahl anderer Systeme angewendet werden, darunter Bakterien, Pflanzen, Tiere und sogar Patientenproben in der Pathologie. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden Schwierigkeiten haben, da das Sammeln vieler Serienabschnitte sehr schwierig ist. Das Arbeiten ohne zusätzliche Unterstützung kann zum Verlust von Abschnitten oder zur Unordnung der Bänder führen.

Beschichten Sie mit einem winzigen Pinsel, der aus ein paar Haaren besteht, die an einem Zahnstocher befestigt sind, vorsichtig die Vorder- und Hinterseite eines vorgeschnittenen Blocks mit einer Klebemischung. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, da das Lösungsmittel dieser Mischung innerhalb von Sekunden verdampft. Während die Proben trocknen, schneiden Sie Stücke von Siliziumwafern auf eine Größe zu, die in das Messerschiffchen passt, und markieren Sie sie mit einem Diamantritzer.

Reinigen Sie dann den Siliziumwafer manuell mit Isopropanol und fusselfreiem Gewebe. Befestigen Sie das Substrat mit einem ablösbaren Kleber an einem Ende der Trägerplatte. Nach dem Abbinden aktiviert das Plasma das Substrat durch Glimmentladung mit Luft, um eine hydrophile Oberfläche zu erhalten.

Halten Sie das montierte Substrat näher an der Messerkante und setzen Sie den Träger in die Klemme des Substrathalters ein. Führen Sie anschließend ein Jumbo-Diamantmesser in den Messerhalter ein und stellen Sie den Freiwinkel auf null Grad ein. Füllen Sie dann das Messerschiffchen mit destilliertem Wasser.

Nähern Sie sich dem Messer so, dass es ein bis zwei Millimeter von der Probe entfernt ist. Senken Sie dann das Substrat mit den Schrauben eins bis drei des Substrathalters ins Wasser. Prüfen Sie, ob sich die Wasserleitung im oberen Drittel des Untergrundes befindet.

Da es bei der Verwendung eines Siliziumwafers schwierig ist, die Bodenfreiheit zu erkennen, senken Sie das Substrat ab, bis Sie das Gefühl haben, dass es den Boden berührt. Heben Sie dann das Substrat ein wenig an. Achten Sie darauf, dass weder das Substrat noch der Träger das Messerschiffchen beim Schneiden berühren.

Verwenden Sie anschließend eine Spritze oder Pipette, um den Wasserstand im Boot einzustellen. Während Sie durch das Fernglas beobachten, fügen Sie Wasser hinzu oder entfernen Sie es, bis die gesamte Wasseroberfläche eine homogene Reflexion der oberen Lichtbeleuchtung des Ultramikrotoms zeigt. Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe.

Wenn mehrere Abschnitte geschnitten wurden, stoppen Sie den Trennvorgang und lösen Sie das Band von der Messerkante, indem Sie mit einer Wimper oder einem sehr weichen Katzenhaar sanft über die Messerkante streichen. Bewegen Sie das Farbband in Richtung des Substrats und schieben Sie vorsichtig den ersten Abschnitt des Farbbandes, um es am trockenen Teil des Substrats zu befestigen. Fahren Sie mit dem Schneiden der Probe fort und befestigen Sie die Bänder an dem Substrat.

Beginnen Sie auf einer Seite des Substrats und bewegen Sie sich mit jedem neuen Farbband allmählich zur anderen Seite. Wenn das Substrat vollständig mit Bändern bedeckt ist, heben Sie das Substrat vorsichtig mit den Mikromanipulatorschrauben des Substrathalters aus dem Messerschiffchen heraus. Lassen Sie das Farbband-Array trocknen, und lagern Sie es dann in einer staubfreien Umgebung.

Entfernen Sie nach dem Trocknen den mit Klebstoff aufgezogenen Untergrund so schnell wie möglich vom Träger. Färben Sie dann Ihre Probe für die Lichtmikroskopie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und führen Sie eine Bildgebung durch. Als nächstes färben Sie die Probe für die Elektronenmikroskopie und montieren sie mit einem klebrigen Kohlepad auf Aluminiumstummel.

Bilden Sie nun diese Arrays im Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop ab. Um eine Aufladung zu vermeiden, verwenden Sie Primärelektronenenergien von drei kV oder weniger und einen Strahlstrom zwischen 50 und 800 Pikoampere. Bei Verwendung von ITO-beschichteten Glasabdeckgläsern verbinden Sie die leitende Oberfläche mit Kupferband und silberner Farbe mit dem Mikroskopträger.

Der erste Schritt in der hierarchisch abbildenden Kaskade besteht darin, eine Übersicht über das Array so zu generieren, dass die einzelnen Abschnitte erkannt werden können. Definieren Sie zunächst die vier Ecken Ihres Arrays, indem Sie ein Bild jeder Ecke bei geringer Vergrößerung, etwa 100x, grafisch darstellen, und erstellen Sie dann einen ROI, der das gesamte Array umschließt. Weisen Sie diesem ROI ein Imaging-Protokoll mit den folgenden Parametern zu.

Verwenden Sie den Sekundärelektronendetektor für die Hochgeschwindigkeitsbildgebung mit einer kurzen Verweilzeit von etwa 0,2 Mikrosekunden. Wählen Sie eine große Bildpixelgröße und eine Kachelgröße von 2000 x 2000 Pixeln. Das Ergebnis ist ein sehr verrauschtes Bild, aber auch hier ist das Gewebe innerhalb des Schnitts sichtbar.

Generieren Sie dann einen Abschnittssatz, indem Sie einen Interessenbereich erstellen und nur das Gewebe im ersten Abschnitt umreißen. Klonen Sie es mit dem Stempelwerkzeug in alle nachfolgenden Abschnitte. Drehen Sie die interessierenden Bereiche bei Bedarf, um gebogene Farbbänder aufzunehmen.

Weisen Sie dem Schnitt, der die Substruktur des Gewebes am besten darstellt, ein Protokoll zu. Hier wurde eine mittlere Pixelgröße von 60 Nanometern, eine Kachelgröße von 12000 x 12000 Pixeln und eine Verweilzeit von 3,2 Mikrosekunden verwendet. Aufgrund der schlechten Qualität wurde ein zweiter Abschnitt mit einigen ausgewählten Zellen mit einer kleineren Pixelgröße und einem empfindlicheren Detektor erstellt.

Nun ist es möglich, die beiden Zielzellen sehr gut zu erkennen. Erstellen Sie ein Site-Set innerhalb des Abschnittssatzes, der die Zielstruktur für REM-Imaging mit höherer Auflösung enthält. Machen Sie den interessierenden Bereich groß genug, um die gestaffelte Präzision zu berücksichtigen.

Überprüfen und passen Sie die Positionen der Websites an. Die automatische Optimierung ist erforderlich, wenn viele Abschnitte abgebildet werden. Es ist wichtig, die interessierenden Bereiche so zu platzieren, dass das Zentrum nicht auf leerem Material ohne strukturelle Details, z. B. Vakuolen, sitzt.

Definieren Sie als Nächstes die Einstellungen für den Autofokus, und überprüfen Sie die Bildgebungsleistung über die Länge eines Farbbands in einem kleinen Interessenbereich, der sich in der Nähe der Stelle befindet, die abgebildet werden soll. Definieren Sie dann ein Bildgebungsprotokoll für die hochauflösende REM-Aufnahme. Um Membrankompartimente zu sehen, wählen Sie eine Bildpixelgröße zwischen drei und fünf Nanometern.

Wählen Sie je nach Detektor eine Verweilzeit, damit das Bild nicht zu verrauscht wird. Da die Bühne eine große Distanz zwischen der Aufnahme dieses und dieses Abschnitts zurücklegen muss, definieren Sie die Fokuswerte mindestens für den ersten Abschnitt jedes Menübands mit der Option Protokoll prüfen. Starten Sie dann die automatisierte REM-Bildgebung über die gesamte Reihe von Zielregionen.

Wenn Sie fertig sind, exportieren Sie die erfassten Daten als Bildserie, vorzugsweise im TIF-Format. Importieren Sie Bildserien als virtuellen Stapel nach Fidschi. Schneiden Sie anschließend den Stapel für die weitere Verarbeitung zu, indem Sie den Bereich so nah wie möglich an der gewünschten Struktur zuschneiden.

Passen Sie außerdem die Helligkeit und den Kontrast an und speichern Sie den Stapel. Öffnen Sie nach dem Zuschneiden und Optimieren ein neues TrakEM aus dem Menü Datei. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Bildfeld und importieren Sie den Stapel in TrakEM als ein Slice pro Layer.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ebenen ausrichten. Wählen Sie als Modus die kleinsten Quadrate, legen Sie den Bereich vom ersten bis zum letzten fest und wählen Sie keine als Referenz aus. Wählen Sie als Nächstes die Standardeinstellungswerte aus, und wählen Sie als gewünschte Transformation Starr aus.

Wenn die Registrierung abgeschlossen und zufriedenstellend ist, speichern Sie den ausgerichteten Datensatz, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und Exportieren auswählen. Erstellen Sie ein flaches Bild, legen Sie den Bereich vom ersten bis zum letzten Bild fest und lassen Sie die Software den resultierenden Stapel anzeigen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie den Stapel im TIF-Format.

Nach der Vorbereitung erscheint das Schnittarray als ein Array, das aus mehreren Bändern mit seriellen Schnitten besteht. Dieser Abschnitt zeigt einen Überblick über eine mit Propidiumiodid gefärbte Arabidopsis-Wurzelspitze. Die sequenziellen Abschnitte dieser Probe wurden wie im Protokoll beschrieben ausgerichtet und kombiniert, um die Probe in 3D als eine einzige Filmdatei darzustellen.

Hier sieht man die beiden Zielzellen, die später im REM mit Nanometerauflösung abgebildet werden sollen. Nach zusätzlicher Färbung mit Uranylacetat und Blutcitrat wurden die Arrays im Elektronenmikroskop abgebildet. Dieses statische Bild zeigt den Probenschnitt, der zuerst mit einer Auflösung von 20 Nanometern und in der zweiten Bildgebungsrunde mit einer Auflösung von fünf Nanometern abgebildet wurde.

Hier wurden 210 sequenzielle Bilder aus dem Elektronenmikroskop ausgerichtet und beschnitten, wie im Protokoll beschrieben. Das Video zielt nur auf zwei Zellen ab und zeigt in 3D, wie die Vakuolen innerhalb der Zellen angeordnet und manchmal auch verbunden sind. Die automatisierte hierarchische Abbildung der Arrays im REM, die hier gezeigt wird, kann eine nahtlose Kartierung auf verschiedenen Auflösungsstufen ermöglichen, von einem Überblick über das gesamte Array bis hin zu subzellulären Details.

Bei höchster Vergrößerung sind Vakuolen, Mitochondrien, der Zellkern und das endoplasmatische Retikulum erkennbar. Einmal gemeistert, kann das Platzieren von Abschnittsbändern nebeneinander auf einem typischen Substrat in wenigen Stunden erledigt werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Dadurch können Hunderte von Schnitten auf einem Substrat für die Bildgebung bereitgestellt werden.

Die Bildgebungszeit für eine so große Anzahl von Schnitten kann von Mikroskop zu Mikroskop variieren, umso mehr, wenn Ihre bevorzugten Bildgebungsinstrumente unterschiedliche Automatisierungsgrade haben. Interessant ist, dass der allgemeine Arbeitsablauf problemlos mit anderen bildgebenden Verfahren kombiniert werden kann, wie z. B. der Standard-Histo-Färbung oder sogar der Candolumineszenz, oder er kann einfach als eigenständiges Werkzeug für die arthostrukturelle Bildgebung großer Volumina verwendet werden. Ein weiterer Aspekt dieses Workflows ist die einfache Zugänglichkeit.

Erste Studien sind ohne zusätzliche Tools oder Automatisierung, d.h. ohne große Investitionen, durchführbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung vom Arbeitsablauf haben und wissen, wie multimodale sowie hierarchische Bildgebung verwendet werden können, um interessante Strukturen in einem großen 3D-Volumen in verschiedenen Auflösungsstufen anzuvisieren und abzubilden.