Name: Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie Array-Tomographie für die ultrastrukturelle Bildgebung von Geweben mittels Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Identifizierung zellulärer Zielstrukturen in großen 3D-Volumina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von Grant FKZ 13GW0044 vom Bundesministerium für Bildung und Forschung, Projekt MorphiQuant-3D unterstützt. Wir danken Carolin Bartels für den technischen Support.

<ol><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+third+dimension%3A+Volume+electron+microscopy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience.</a> J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jmi.12087/full">Array tomography.</a> J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).</li>
<li>Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).</li>
<li>Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+Microscopes%3A+3D+Correlative+Light+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Complex+Biological+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures.</a> Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).</li>
<li>De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopy%3A+ultrasructure+lights+up%21%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up!</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li>
<li>Verkade, P., Müller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerkade%2C+P+%22Methods+in+Cell+Biology+Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+III%22">Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III</a>. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).</li>
<li>Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescing+the+Electron%3A+Strategies+in+Correlative+Experimental+Design%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design.</a> Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).</li>
<li>Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+goes+3D%3A+Exploring+the+potential+of+array+tomography+versus+FIB+nanotomography+for+a+CADASIL+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample.</a> Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).</li>
<li>Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+imaging%3A+a+new+concept+for+targeted+imaging+of+large+volumes+from+cells+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues.</a> BMC Cell Biol. 17 (1), 38(2016).</li>
<li>Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper%3A+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).</li>
<li>Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+Production+of+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: Production of Arrays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).</li>
<li>Fahrenbach, W. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060010407/abstract">Continuous serial thin sectioning for electron microscopy.</a> J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).</li>
<li>Harris, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+serial+sectioning+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy.</a> J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+Tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
</ol>

KIT hat Rückzahlungen durch Boeckeler Instrumente zur Versorgung der ein funktionierendes Modell der Substrat-Inhaber erhalten. Marlene Thaler ist Mitarbeiter des ZEISS Microscopy GmbH, Hersteller von Mikroskopsystemen, die in diesem Artikel erwähnt. Darüber hinaus bietet ZEISS bestimmte Lösungen wie ZEISS Atlas Lösungspakete für ein breites Anwendungsspektrum in der großflächigen, 3D Bildgebung für SEM und FIB-SEM Instrumente. Andere Autoren haben nichts preisgeben.

Ein Workflow für die Ausrichtung auf bestimmte Zellen in einem Gewebe von Multi-modale hierarchische AT zeigte: eine Probe Harz eingebettet in Arrays von Schnittserien, die auf einem leitfähigen Substrat mit einem maßgeschneiderten Substrat Halter platziert werden zerschnitten ist. Nach Markierung mit einem Fluorophor und Bildgebung in der FLM, dient das rekonstruierte Volumen für die Auswahl der Zielzellen. Nach zusätzlichen Färbung mit Schwermetallen runden, Kontrast einzuführen, sind diese Ziele über mehrere hundert Abschnitte mit nanoskaligen Auflösung in einem SEM mit einer automatisierten Software-Plattform abgebildet.
Für die Herstellung von dicht gepackten Arrays mit mehreren langen Bändern, ist Inhaber eines Substrat ähnlich der hier beschriebenen notwendig. Eine qualifizierte und geduldige Person möglicherweise mehrere Bänder an Silizium-Substrat, halb eingetaucht in das Messer Boot anhängen und das Array abrufen, indem Sie nach und nach Senkung des Wasserspiegels bis die Bänder auf dem Substrat sitzen. Jedoch in der nach unserer Erfahrung gibt es eine Tendenz zur Bildung zu zerbrechen, wenn das Substrat Teil des Bootes Messer (vgl. Note 1.3.2 im Protokoll) berührt. Darüber hinaus ist dieses Verfahren sehr viel schwieriger mit ITO-beschichtete Substrate: (1) aufgrund der Transparenz der ITO-Glas, ist es schwierig, den Rand des Wassers zu sehen, wo die Enden der Bänder müssen befestigt sein; (2) da die ITO-beschichtete Oberfläche viel rauer als die Hochglanz polierte Siliziumwafer ist, die Bänder sind in der Regel, während Lift-out- und kleinere Fragmente, bestehend aus ein paar teilen können schweben, so zerstören die Reihenfolge der Abschnitte zu brechen.
Der gesamte Workflow ist auch möglich ohne Korrelation zur FLM Daten. In diesem Fall möglicherweise Datenerhebung im SEM in mehreren Sitzungen durchgeführt werden. Eine erste 3D Rekonstruktion oder zumindest Auswertung der Daten mit geringer oder mittlerer Auflösung kann erforderlich sein, Ziele zu identifizieren. Darüber hinaus können konventionelle histologische Flecken für Hellfeld LM (nicht erfordern FLM) angewendet werden. Natürlich sind andere Optionen6,7,8 Antikörper Kennzeichnung in den Arrays, wie bereits in dem ersten Dokument über18, oder genetisch codiert fluoreszierende Proteine (XFPs) oder Pre-einbetten Kennzeichnung mit der Erhaltung der Fluoreszenz während der Probenvorbereitung.
Eine allgemeine Einschränkung der diskutierte Methode ist die Verwendung von Abschnitten einer bestimmten Dicke und die daraus resultierende diskrete Probenahme das 3D-Volumen: Auflösung in Z kann nur so gut sein wie die Dicke der Abschnitte sein, da das SEM nur Daten aus der Abschnitt Oberfläche (d sammelt Epending auf die primäre Energie/Landung Energie ausgewählt). Dies bedeutet, dass die daraus resultierenden 3D-Volumen anisotropen Voxel, zB., 5 x 5 x 100 nm3 wenn 100 nm Abschnitte und eine Bild-Pixel-Größe von 5 nm verwendet. Für sehr kleine Unternehmen in einem Größenbereich unter 1 µm kann dies nicht für eine wahre Ultrastrukturforschung Beschreibung ausreichen. Eine weitere technische Einschränkung ist die Genauigkeit der Bühne verwendet im SEM für automatisierte imaging. Aus diesem Grund ist es notwendig, wählen einen ROI größer als die Spezifikationen der Bühne Genauigkeit zu gewährleisten, dass das gesamte Zielgebiet abgebildet wird.
Im Vergleich zum SBF-SEM und FIB-SEM als Block-Gesicht bildgebenden Verfahren, hat korrelative AT den endgültigen Nachteil anisotropen Voxel, wie oben beschrieben. Mit FIB-REM isotrope Voxel von 5 x 5 x 5 nm3 erhalten Sie bei eine richtigen Drift-Korrektur.
Lücken in der rekonstruierten Volumen durch den Verlust der Abschnitte während der Vorbereitung des Arrays könnten auch ein Anliegen, die nicht mit SBF-SEM oder FIB-SEM begegnet ist Mit einer guten Band Stabilisierung durch Kleber, ist dies in der Regel nur ein Problem für den letzten Abschnitt eines Bandes: beschädigt werden, wenn es aus der Messers Schneide mit der Wimper zu veröffentlichen. Allerdings beeinflusst der Verlust eines Abschnitts in jeder 20 – 50 Abschnitten nach unserer Erfahrung nicht Bild-Registrierung.
Auf der anderen Seite verleiht die Möglichkeit, Arrays nach dem Färben gutes Signal und Kontrast für SEM Bildgebung auch auf schwach metallisierte Proben wie der Hochdruck Wurzelspitzen, die hier gezeigte eingefroren. Daher ist es nicht optimale Ultrastrukturforschung Konservierung durch zahlreiche chemische Fixierung und Metallisierung Schritte Kompromisse notwendig. Darüber hinaus liefern Routineproben aus der Pathologie-Labor mit einem mittleren Grad an Metallisierung hervorragende Daten10. Ein Post-Einbettung Kontrastverstärkung ist generell nicht möglich für SBF-SEM und FIB-SEM. Außerdem, da diese Methoden destruktiv sind, ist d.h., verbrauchen die Probe während der Bildgebung, hierarchische imaging bei verschiedenen Auflösungen und Websites oder wiederholte Bildgebung zu späteren Zeitpunkten in der Zeit unmöglich. Im Prinzip unbegrenzte Mengen, bestehend aus großen FOVs (z. B.bis zu mehreren Millimetern für ganze Mäusegehirnen in Connectomics) erstellt durch Nähte Mosaiken und eine Vielzahl von Abschnitten von AT, während im FIB-SEM, FOVs über 100 µm X 100 µm erworben werden können sind schwer zu erreichen mit Routine Instrumente.
Weiteren Automatisierung des beschriebenen AT-Workflows wäre ein klarer Vorteil, da die oben genannten Methoden SBF-SEM und FIB-SEM sowohl schneiden und Bildgebung innerhalb desselben Instruments in einer vollständig automatisierten Weise durchführen. Gibt es eine Art der Automatisierung der Schneiden: The ATUMtome12 können generieren und Tausende von Abschnitten zu sammeln, aber die Verwendung von Kapton Klebeband wie ein Substrat solche macht arrays schwierig, Bild in ein FLM. Auf die ITO-beschichtete Deckgläsern hier verwendet sollte auch super-Auflösung möglich sein. Eine weitere, sehr wünschenswerte Ziel für Automatisierung wäre die Aufnahme der FLM-Daten-Stacks. Auf der anderen Seite Automatisierung kann teuer sein und mit Ausnahme des Substrat-Inhabers der hier vorgestellten Workflow hängt (in Bezug auf die Hardware) nur Instrumentierung in der Regel verfügbar in einer Routine EM Labor oder Core Einrichtung, so dass es niedrige Ebene Zugriff.

Zur Rekonstruktion großer Mengen von Gewebe bei Ultrastrukturforschung Auflösung wurden eine Reihe von verschiedenen bildgebenden Ansätzen basierend auf SEM verwendet1: umfassende Bewertungen sind erhältlich zB. für SBF-SEM2, FIB-SEM3und Array Tomographie (AT)4. Während das Probenmaterial für die letztere Methode als ein Array von Serienschnitte auf einem Substrat erhalten bleibt, sind SBF-SEM und FIB-SEM destruktiven Methoden auf die probenblock arbeiten und konsumieren sie während der Aufnahme. Durch die Erhebung des Harzes in die SEM hängt auch stark metallisierte Probe Blöcke5.
Auf der anderen Seite profitieren Identifizierung bestimmter Zellen oder Strukturen von Interesse in eine Gewebeprobe vor allem von korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)6,7,8. Mit FLM für targeting schließt die Anwendung von großen Mengen an Schwermetallen da das Fluoreszenz-Signal9stillen würde. Für solche nur leicht metallisierten Proben ist AT die Methode der Wahl, da Arrays nach dem LM Imaging leicht Post-gebeizt mit Heavy Metal sein können. Darüber hinaus fast jede Probenart verwendet werden, für AT, sogar Routineproben aus der Pathologe Schatz Brust10.
Ein weiterer großer Vorteil der AT ist das Potenzial für hierarchische11 oder Multi-Resolution imaging12: Es ist nicht notwendig, alles im hochauflösenden Bild, als Ziele können, in einer anderen Modalität (z.B.FLM) oder in ausgewählt werden SEM-Bilder mit niedriger Auflösung. Nur die interessanten Regionen einer Gewebe- oder Bevölkerung an hochauflösenden Bildgebung digitale Daten-Speicherplatz spart und produziert kleinere Bild-Datensätzen, die einfacher zu handhaben sind. Hier die AT-Workflow zeigt sich mit einer eher schwach metallisierte Stichprobe: Hochdruck eingefroren Pflanzenwurzeln (Arabidopsis Thaliana) in hydrophilen Harz eingebettet.
Wie die Arrays sind vorbereitet, gebeizt und im FLM und SEM abgebildet, und wie die Bild-Stacks registriert sind, werden erläutert. Auch, wie der 3D-Rekonstruktion des FLM Volumes verwendet werden kann, bestimmte Zellen für die Bildgebung in der SEM mit nanoskaligen Auflösung auswählen wird dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Instrumentierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternative: Leica UC7</td></tr><tr><td>Substrathalter</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternative: selbstgebauter</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternativen: Ted Pella Pelco oder andere Tisch-Plasmareiniger Beispielparameter für Diener Zepto mit 40kHz Generator (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (Luft), 10 % Leistung&nbsp;</td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternativen: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter-Set</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>Ordentliche Workstation, die Bilddaten</td><td></td><td></td><td></td>in GB-Größe verarbeiten kann</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternativen: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser zum Trimmen von 45°</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser zum Trimmen von 90°;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Jumbo Diamantmesser zum Trennen</td> von <td></td><td>Kieselalgen</td>- DUJ3530 <td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer (Stücke)</td><td>Si-Mat</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Dotierung: P/Bor, Ausrichtung: < 100>, Dicke: 525 &plusmn; 25 & Mikro; m, spezifischer Widerstand: 1-30 & Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>ITO-beschichtete Deckgläser</td><td>Balzers</td><td>Typ Z</td><td>22 & mal 22 & fach 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Aluminiumträger</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>76 & fach 26 mm</td></tr><tr><td>Waferzange</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Stichzange</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Diamond Ritzer</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Wimpern/sehr weiches Katzenhaar</td><td>Selfmade</td><td></td><td>Alternative:</td></tr><tr><td>Plano Brush</td><td>Selfmade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex Kontaktkleber</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td>Kraftkleber Classic (der Gelbliche)</td></tr><tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>zur Befestigung von Substrat auf</td></tr><tr><td>Träger Klebeband</td><td>3M</td><td>851</td><td>zur Befestigung von Substrat auf Träger</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>Verdünner für Leimmischung</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternativ, Verdünner auf Limonenbasis</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitung</td><td>Open Source</td><td>Fidschi (http://fiji.sc/#download)</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassung</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (Modul für Zeiss SEM)</td><td>Alternative zur automatisierten Bildaufnahme: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name<</td><td>>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Stammlösung: 1,5 mM in 0,1 % Natriumazid</td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Science Services</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Blei(II)-nitrat</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitratdihydrat</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>NaOH-Pellets</td><td>Merck</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M NaOH-Lösung</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Firma<</td><td>strong>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Montage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Pads</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Kupferband</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>doppelseitig klebend, leitfähig</td></tr><tr><td>Silberfarbe</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Lösungen/Mischungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klebstoffmischung für Beschichtungsblöcke</td><td></td><td></td><td>Pattex Kontaktkleber /Xylol als Verdünner, Verhältnis 1:3, (Alternative für Xylol: Rotihistol)</td></tr><tr><td>Reynolds-Bleicitrat</td><td></td><td></td><td>50 mL: 1,33 g Blei(II)-nitrat in 10 mL dH2O. 1,76 g Trinatriumcitrat-Dihydrat in 10 ml dH2O. Mischen Beides und fügen Sie 1 M Natriumhydroxid hinzu, bis die Lösung klar ist. Füllen Sie es mit dH2O auf 50 mL.</td></tr><tr><td>Propidiumiodid-Färbelösung</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie eine Verdünnung im Maßstab 1:1500 ab Lager in dH2O. Vortex vor, um eine angemessene Mischung zu gewährleisten.</td></tr><tr><td>Wässriges Uranylacetat</td><td></td><td></td><td>3 % Uranylacetat in dH2O auflösen (gründlich mischen).</td></tr></tbody></table>

multimodale hierarchische darstellung der schnittserien für die suche nach spezifischen zellulären ziele innerhalb großer mengen

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Ausrichtung auf bestimmte Zellen in Ultrastrukturforschung Auflösung innerhalb einer gemischten Zellpopulation oder ein Gewebe kann durch hierarchische Bildgebung mit einer Kombination aus Licht- und Elektronenmikroskopie erreicht werden. Proben in Harz eingebettet sind in Arrays bestehend aus Bändern von Hunderten von ultradünnen Abschnitte geschnitten und auf Silizium-Wafer oder leitend beschichtetes Deckgläsern hinterlegt. Arrays werden mit einer niedrigen Auflösung mit einem digitalen Verbraucher wie Smartphone-Kamera oder Lichtmikroskop (LM) für eine rasche großflächige Übersicht oder ein weites Feld Fluoreszenzmikroskop (Fluoreszenz Lichtmikroskopie (FLM)) nach Markierung mit Fluorophore abgebildet. Nach der Post-Färbung mit Schwermetallen, werden Arrays in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) abgebildet. Auswahl der Ziele ist möglich von 3D-Rekonstruktionen von FLM generiert oder von 3D-Rekonstruktionen von den SEM Bild Stapeln mit mittlerer Auflösung gemacht, wenn keine fluoreszierenden Marker zur Verfügung stehen. Für Ultrastrukturforschung Analyse ausgewählten Ziele sind schließlich im SEM bei hoher Auflösung aufgezeichnet (wenige Nanometer Bildpixel). Ein Band-Umgang mit Werkzeug, das bei jedem regungsloses nachgerüstet werden kann beweist. Es hilft bei Array-Produktion und Substrat Entfernung vom Boot aus speziellen Messer. Eine Softwareplattform, die ermöglicht die automatisierte Bildverarbeitung von Arrays in die SEM wird diskutiert. Im Vergleich zu anderen großvolumigen EM Datengenerierung, wie z. B. serielle Block-Gesicht SEM (SBF-SEM) oder fokussierten Ionenstrahl SEM (FIB-SEM), dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile: (1) die Harz eingebettet Probe konserviert, wenn auch in einer in Scheiben geschnittenen Up-Version. Es kann auf unterschiedliche Weise eingefärbt und mit unterschiedlichen Auflösungen abgebildet. (2) wie in den Abschnitten Post-befleckt werden können, ist es nicht notwendig, Proben stark Block befleckt mit Schwermetallen einzuführen Kontrast für SEM Bildgebung oder machen das Gewebe Blöcke leitfähigen zu verwenden. Dies macht die Methode für eine Vielzahl von Materialien und biologische Fragestellungen. Besonders vorangestellten Materialien z.B.aus Biopsie Banken und Pathologie Labs können direkt eingebettet und in 3D rekonstruiert.

Der Workflow beschrieben hier (Abbildung 1) startet mit einer Probe in einem Block Harz eingebettet. Während der Probenvorbereitung einige Schwermetalle in das Gewebe eingeführt werden sollten, aber es ist nicht notwendig, optimiert für ziemlich starke Metallisierung Protokolle zu verwenden. Abbildung 1A zeigt eine Pflanzenwurzel (Kresse) Block-gefärbten konventionell mit 1 % OsO4 und 1 % Uranyl Acetat, während die Arabidopsis Wurzel in Figur 1 b nur schwach ist metallisiert mit 0,5 % Uranyl Acetat. Die letzteren Probentyp eignet sich am besten für korrelative Ansätze wie einige Schwermetalle sind in der Regel Fluoreszenz zu stillen. Mit einem speziellen Substrat Halter (Abbildung 2), können Arrays von mehreren hundert Abschnitte werden hergestellt (Abbildung 1). Nach fluoreszierende Kennzeichnung, sind solche Arrays abgebildet in einem standard Weitfeld-FLM (Abbildung 1), dann gefärbt mit Heavy-Metal-Lösungen und abgebildet in einem SEM in verschiedenen Auflösungen (Abb. 1E–G).
Wichtige Werkzeuge für die reproduzierbare Erzeugung von Arrays, sind vor allem, wenn mehrere Bänder aus dem Mikrotom Messer Boot auf einem Substrat, Platzierung der Substrat-Halter (Abb. 2A, speziell in der Autoren-Labor) und ein Jumbo-Diamant Messer mit einem Boot groß genug für Objektträger (Abbildung 2 b). Eine flache Meniskus, so dass gute Beobachtung der Bänder, ist notwendig und kann durch Plasmareinigung des Substrats erreicht werden: ein kleiner Tropfen destilliertes Wasser sollte keine Objektiv-artige Struktur bilden, auf dem Substrat wie in Abbildung 2 (unbehandeltes Substrat), aber eine dünne Folie (Abbildung 2D, Plasma aktiviert Substrat). Unter diesen Bedingungen Bänder befestigt auf den trockenen Teil des eine ITO-beschichtete Deckglas sind leicht (Abb. 2E) visualisiert und können beobachtet und kontrolliert während der Lift-out-das Substrat aus dem Wasser.
Als Beispiel wurden Arrays mit Propidium Jodid, beschriften Sie die pflanzlichen Zellwände befleckt mit einem breiten Standardfeld FLM (Abbildung 3A) abgebildet. Da die Abschnitte nur 100 sind nm dick, noch übermäßig Färbung, wie hier gezeigt führt wenig verwischen. Nach der Registrierung wurden die beiden Zellen vollständig umschlossen in der rekonstruierten Volumen aus den Bildstapel (Abb. 3 b) für die hochauflösende Bildgebung in 3D ausgewählt (siehe auch Ergänzende Film S1). Im Anschluss an weitere Färbung mit Uranyl-Acetat und Lead-Citrat, wurden die Arrays abgebildet im SEM Abbildung 3 C zeigt eine Übersicht, aufgenommen mit 60 nm Bildpixel; Das dunkle Quadrat in der Mitte des Bildes zeigt die Position, wo die Autofokus-Funktionen wurden hingerichtet, und die zusätzliche Dosis führte zu leichten Verschmutzungen. Geeignete ROIs in diesen Serienschnitte (Scheiben 51 bis 248 435 Scheiben insgesamt) mit den zwei Zielzellen im FLM Stapel ausgewählt wurden dann mit einer 5 nm Bildgröße Pixel aufgezeichnet (Abbildung 3D; siehe auch Ergänzende Film S2).
Automatisierte hierarchische Darstellung der Arrays im hier beschriebenen SEM erfolgte mit der Software/Hardware-Plattform-Lösung ZEISS Atlas 5. Zuerst ein Überblick über das gesamte Array wurde erstellt mit der SE-Detektor mit sehr großen (1.000 nm) Bild Pixel und sehr geringe Verweilzeit (Abb. 4A). Ein ROI umreißen nur das Gewebe wurde in der ersten Sektion und vermehrt auf andere Abschnitte des Arrays. Dieser Abschnitt Satz wurde dann mit 60 nm Bildpixel über eine längere Verweilzeit (Abbildung 4 b) aufgenommen. Schließlich wurde ein Website-Set, mit den zwei Zielzellen plus eins "Schicht" der umgebenden Zellen für Bühne Ungenauigkeit, Konto mit den folgenden Parametern eingerichtet: ESB (Energie selektiv Backscatter) Detektor, 5 nm Bild Pixel, sehr lang (40 µs) wohnen ( Zeit Abbildung 4). Einzoomen auf solch ein Bild zeigt subzelluläre Detail (Abbildung 4) z. B. Mitochondrien (M), Vakuolen (V), Kern (N) und endoplasmatische Retikulum (Pfeile). Siehe auch Ergänzende Film S3 für Zoomen aus einen Überblick über das gesamte Array auf der subzellulären Detail einer Zielzelle.
Das Array abgebildet (200 Teile) plus eine zusätzliche nahm einer der 250 Abschnitte etwa 8 h zu produzieren, eine Nacht, für LM, und eines Tages (manuell) auf die FLM aufzeichnen zu beflecken. Post-Färbung dauert ca. 1-2 h insgesamt, abhängig von der Anzahl der einzelnen Arrays. Für SEM-Aufnahme, ein paar Stunden sind erforderlich, um den Atlas-Lauf einzurichten, und automatisierte Aufnahme war 3 – 4 h für die mittlere Auflösung (60 nm Pixelgröße) Abschnitt Set (200 Abschnitte, 450 x 200 µm2) und etwa 5 Tage für die hochauflösende (5 nm Pixelgröße) ROI enthält die beiden Zielzellen (200 Abschnitte, 55 x 30 µm2). Beachten Sie, dass eine sehr langsame Scan-Geschwindigkeit wegen der geringen Metallgehalt des hier gezeigten Beispiels verwendet werden musste, um ein gutes Signal-Rausch-Erkennung, die (für den derzeit verfügbaren Detektor) eine Verweilzeit von 40 µs für die hochauflösende ROI impliziert zu erreichen.
Anfällig für Fallstricke im gesamten Workflow gibt es mehrere Schritte: im Idealfall sollte die Bänder werden mehr oder weniger gerade und in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 5A). Allerdings sind oft gebogen (Abb. 5 b), gebogene (Abbildung 5) oder sogar gebrochen Bänder produziert. Dies kann durch falsche trimmen (führenden und Hinterkanten nicht genau parallel) oder ungleichmäßig angewandten Klebstoff, sondern auch aus einer asymmetrischen oder ungleichmäßig infiltrierten Probe führen. Besonders lästig sind Proben, weiche und sehr harte Komponenten enthält. Die letztgenannten Komponenten möglicherweise schwer, wie die Zellwand der Pflanzenwurzeln hier gezeigt (Abbildung 5) zu infiltrieren. In diesem Fall können Falten (Pfeilspitzen) durch Variable Kompression und Entspannung beim Schneiden leicht verursacht werden. Für die automatisierte Bildverarbeitung in der SEM, sind geschwungene Bänder kein großes Problem, da ROIs gedreht werden können, um die Krümmung des Menübands unterzubringen.
Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll Färbung: unzureichende waschen kann Rückstände auf dem Abschnitt (Abb. 5E, F) führen und im schlimmsten Fall, decken die interessanteste Gegend (Kreis auf eines der beiden Zielzellen in Abbildung 5F). Auch Staub (Abbildung 5, stark Licht streuenden Partikeln) eingeführt in das Messer Schiff, z.B.mit einem schmutzigen Substrat Träger, kann schwerwiegende Probleme verursachen: In der FLM Staub stark fluoreszierende werden kann (vgl. einige Scheiben in ergänzende Film S1) zu einem Ausmaß, die einige Registrierung Algorithmen nicht funktionieren. Die "align" Funktion in TrakEM17 verträgt jedoch solche Stapel wie in Ergänzenden Film S1gezeigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow für die korrelative hierarchische Darstellung. Ausgehend von einer Stichprobe in einem Harz-Block (A, stark metallisierte Probe) eingebettet, die Probe zuerst getrimmt (B, schwach metallisierte Probe) und dann arrays bestehend aus mehreren Bändern von Schnittserien (C), hier platziert auf einer ITO-beschichtete Deckglas ein regungsloses hergestellt werden. Nach der Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden Stapel von Bildern in einer Weitfeld-FLM (D) aufgezeichnet. Nachdem weitere Färbung Runden mit Heavy Metal Salze, werden Stapel in einem SEM (E–G) in verschiedenen Auflösungen (Bild Pixelgrößen) abgebildet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Abbildung 2: Werkzeuge für die Erstellung des Arrays. Substrat-Halter montiert von Mikromanipulatoren mit sieben Achsen der Bewegung mit einem standard regungsloses (A) verbunden: die Schrauben, mit Kreisen hervorgehoben sind für vertikale (1) und (2) Horizontalbewegung und zum Kippen (3) des Substratträgers . Das Jumbo Diamant Messer mit einem übergroßen Boot, großer Substrate (Pfeil), hier mit einem Stück Plasma aktiviert Silizium-Wafer, montiert auf einer Folie Größe Aluminium-Träger (B) unterzubringen. 20 µL Tropfen destilliertes Wasser platziert auf einer unbehandelten Silizium-Wafer-Substrat (C) oder auf einem Plasma aktiviert Substrat (D). Vier Bänder schweben in der Messer-Boot, ein Deckglas ITO beschichtet mit ihren unteren Enden befestigt. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Abbildung 3: Korrelation der LM-Daten mit SEM. Übersichten (A, C) und Zielzellen (B, D) erfasst mit FLM (A, B) und SEM (C, D). (B) ist ein Software-Zoom, und die ursprünglichen Daten wurden aufgenommen mit einem 40 X Objektiv auf einem 1.388 x 1.040 Pixel-Kamera-Chip, während (C) mit 60 nm Pixel Bildgröße und (D) aufgezeichnet wird mit 5 nm Pixel Bildgröße, illustrieren die wahre Erhöhung der Auflösung im SEM <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Abbildung 4: hierarchische imaging im SEM mit ZEISS Atlas 5 at Überblick über ein Array mit 1.000 nm Bildpixel mit der SE-Detektor (A) aufgenommen. Abschnitt enthält mit den ROI auf Gewebe in jedem Abschnitt gelegt und mit 60 nm Bildpixel (B) aufgenommen. Seite setzt mit einem seriellen ROI auf Zielzellen platziert und mit 5 nm Bildpixel (C) aufgenommen. Beim Zoomen in solchen hochauflösende Bilder (D) sichtbar intrazellulären Membran Fächer wie Vakuolen (V), Kern (N) und Mitochondrien (M) endoplasmatische Retikulum (Pfeile). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Abbildung 5: typische Probleme. (1) die aus den speziellen Prozess: Bänder gelegt auf die ITO-beschichtete Deckgläsern sind im Idealfall gerade (A), aber unregelmäßig Kompression beim Schneiden verursachen Bent (B) oder gekrümmte Bänder (D) oder sogar Falten (C). (2) verursacht durch den Umgang mit Substrat und Bändern in Wasser, z.B.beim Schneiden und färben: Lichtstreuung Partikel auf Substrat (D), Rand der Tröpfchen auf Abschnitt (Kreis in E) oder Schmutz heraus über Gewebe aufgrund unzureichender verschmiert Waschen nach der Färbung (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Film S1: FLM Bildstapel. 435 Bilder in Fidschi16 mit TrakEM17 ausgerichtet und als Filmdatei (.avi) gespeichert. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film S2: SEM Bildstapel. 210 Bilder ausgerichtet in Fidschi16 mit TrakEM17. Der ursprüngliche Stapel (300 Bilder) dieses Datensatzes wurde 15 GB. Um den Stapel von 3,3 GB (nach Ausrichtung und beschneiden auf nur zwei Zellen gezielt) zu verkleinern, wurde es so skaliert, in x und y um den Faktor 0,2 mit Fidschi und dann als AVI-Film gespeichert. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Film S3: Zoomen mit verschiedenen Auflösungsstufen im SEM Film erstellt und von der Atlas 5-Software im MP4-Format exportiert. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Workflows ist es, bestimmte Ziele für die ultrastrukturelle Bildgebung innerhalb eines Gewebes mittels Lichtmikroskopie zu identifizieren, gefolgt von 3D-Bildgebung in einem REM mit sehr hoher Auflösung. Der hier vorgestellte Bildgebungs-Workflow kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Zell- oder Gewebe-Ultrastruktur in einer Reihe von Bereichen zu beantworten, wie z. B. Zellbiologie, Entwicklungsbiologie, Neurowissenschaften oder sogar Pathologie. Der Hauptvorteil der Technik, die eigentlich auf der Array-Tomographie basiert, besteht darin, dass das Aufteilen von Gewebe in Arrays von seriellen Schnitten die Identifizierung von Zielstrukturen erleichtert, selbst wenn sie zunächst im ursprünglichen Probenvolumen vergraben sind.Die Array-Tomographie wurde ursprünglich im neurowissenschaftlichen Kontext eingeführt, kann aber auch auf eine Vielzahl anderer Systeme angewendet werden, darunter Bakterien, Pflanzen, Tiere und sogar Patientenproben in der Pathologie. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden Schwierigkeiten haben, da das Sammeln vieler Serienabschnitte sehr schwierig ist. Das Arbeiten ohne zusätzliche Unterstützung kann zum Verlust von Abschnitten oder zur Unordnung der Bänder führen.Beschichten Sie mit einem winzigen Pinsel, der aus ein paar Haaren besteht, die an einem Zahnstocher befestigt sind, vorsichtig die Vorder- und Hinterseite eines vorgeschnittenen Blocks mit einer Klebemischung. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, da das Lösungsmittel dieser Mischung innerhalb von Sekunden verdampft. Während die Proben trocknen, schneiden Sie Stücke von Siliziumwafern auf eine Größe zu, die in das Messerschiffchen passt, und markieren Sie sie mit einem Diamantritzer.Reinigen Sie dann den Siliziumwafer manuell mit Isopropanol und fusselfreiem Gewebe. Befestigen Sie das Substrat mit einem ablösbaren Kleber an einem Ende der Trägerplatte. Nach dem Abbinden aktiviert das Plasma das Substrat durch Glimmentladung mit Luft, um eine hydrophile Oberfläche zu erhalten.Halten Sie das montierte Substrat näher an der Messerkante und setzen Sie den Träger in die Klemme des Substrathalters ein. Führen Sie anschließend ein Jumbo-Diamantmesser in den Messerhalter ein und stellen Sie den Freiwinkel auf null Grad ein. Füllen Sie dann das Messerschiffchen mit destilliertem Wasser.Nähern Sie sich dem Messer so, dass es ein bis zwei Millimeter von der Probe entfernt ist. Senken Sie dann das Substrat mit den Schrauben eins bis drei des Substrathalters ins Wasser. Prüfen Sie, ob sich die Wasserleitung im oberen Drittel des Untergrundes befindet.Da es bei der Verwendung eines Siliziumwafers schwierig ist, die Bodenfreiheit zu erkennen, senken Sie das Substrat ab, bis Sie das Gefühl haben, dass es den Boden berührt. Heben Sie dann das Substrat ein wenig an. Achten Sie darauf, dass weder das Substrat noch der Träger das Messerschiffchen beim Schneiden berühren.Verwenden Sie anschließend eine Spritze oder Pipette, um den Wasserstand im Boot einzustellen. Während Sie durch das Fernglas beobachten, fügen Sie Wasser hinzu oder entfernen Sie es, bis die gesamte Wasseroberfläche eine homogene Reflexion der oberen Lichtbeleuchtung des Ultramikrotoms zeigt. Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe.Wenn mehrere Abschnitte geschnitten wurden, stoppen Sie den Trennvorgang und lösen Sie das Band von der Messerkante, indem Sie mit einer Wimper oder einem sehr weichen Katzenhaar sanft über die Messerkante streichen. Bewegen Sie das Farbband in Richtung des Substrats und schieben Sie vorsichtig den ersten Abschnitt des Farbbandes, um es am trockenen Teil des Substrats zu befestigen. Fahren Sie mit dem Schneiden der Probe fort und befestigen Sie die Bänder an dem Substrat.Beginnen Sie auf einer Seite des Substrats und bewegen Sie sich mit jedem neuen Farbband allmählich zur anderen Seite. Wenn das Substrat vollständig mit Bändern bedeckt ist, heben Sie das Substrat vorsichtig mit den Mikromanipulatorschrauben des Substrathalters aus dem Messerschiffchen heraus. Lassen Sie das Farbband-Array trocknen, und lagern Sie es dann in einer staubfreien Umgebung.Entfernen Sie nach dem Trocknen den mit Klebstoff aufgezogenen Untergrund so schnell wie möglich vom Träger. Färben Sie dann Ihre Probe für die Lichtmikroskopie, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, und führen Sie eine Bildgebung durch. Als nächstes färben Sie die Probe für die Elektronenmikroskopie und montieren sie mit einem klebrigen Kohlepad auf Aluminiumstummel.Bilden Sie nun diese Arrays im Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop ab. Um eine Aufladung zu vermeiden, verwenden Sie Primärelektronenenergien von drei kV oder weniger und einen Strahlstrom zwischen 50 und 800 Pikoampere. Bei Verwendung von ITO-beschichteten Glasabdeckgläsern verbinden Sie die leitende Oberfläche mit Kupferband und silberner Farbe mit dem Mikroskopträger.Der erste Schritt in der hierarchisch abbildenden Kaskade besteht darin, eine Übersicht über das Array so zu generieren, dass die einzelnen Abschnitte erkannt werden können. Definieren Sie zunächst die vier Ecken Ihres Arrays, indem Sie ein Bild jeder Ecke bei geringer Vergrößerung, etwa 100x, grafisch darstellen, und erstellen Sie dann einen ROI, der das gesamte Array umschließt. Weisen Sie diesem ROI ein Imaging-Protokoll mit den folgenden Parametern zu.Verwenden Sie den Sekundärelektronendetektor für die Hochgeschwindigkeitsbildgebung mit einer kurzen Verweilzeit von etwa 0,2 Mikrosekunden. Wählen Sie eine große Bildpixelgröße und eine Kachelgröße von 2000 x 2000 Pixeln. Das Ergebnis ist ein sehr verrauschtes Bild, aber auch hier ist das Gewebe innerhalb des Schnitts sichtbar.Generieren Sie dann einen Abschnittssatz, indem Sie einen Interessenbereich erstellen und nur das Gewebe im ersten Abschnitt umreißen. Klonen Sie es mit dem Stempelwerkzeug in alle nachfolgenden Abschnitte. Drehen Sie die interessierenden Bereiche bei Bedarf, um gebogene Farbbänder aufzunehmen.Weisen Sie dem Schnitt, der die Substruktur des Gewebes am besten darstellt, ein Protokoll zu. Hier wurde eine mittlere Pixelgröße von 60 Nanometern, eine Kachelgröße von 12000 x 12000 Pixeln und eine Verweilzeit von 3,2 Mikrosekunden verwendet. Aufgrund der schlechten Qualität wurde ein zweiter Abschnitt mit einigen ausgewählten Zellen mit einer kleineren Pixelgröße und einem empfindlicheren Detektor erstellt.Nun ist es möglich, die beiden Zielzellen sehr gut zu erkennen. Erstellen Sie ein Site-Set innerhalb des Abschnittssatzes, der die Zielstruktur für REM-Imaging mit höherer Auflösung enthält. Machen Sie den interessierenden Bereich groß genug, um die gestaffelte Präzision zu berücksichtigen.Überprüfen und passen Sie die Positionen der Websites an. Die automatische Optimierung ist erforderlich, wenn viele Abschnitte abgebildet werden. Es ist wichtig, die interessierenden Bereiche so zu platzieren, dass das Zentrum nicht auf leerem Material ohne strukturelle Details, z. B. Vakuolen, sitzt.Definieren Sie als Nächstes die Einstellungen für den Autofokus, und überprüfen Sie die Bildgebungsleistung über die Länge eines Farbbands in einem kleinen Interessenbereich, der sich in der Nähe der Stelle befindet, die abgebildet werden soll. Definieren Sie dann ein Bildgebungsprotokoll für die hochauflösende REM-Aufnahme. Um Membrankompartimente zu sehen, wählen Sie eine Bildpixelgröße zwischen drei und fünf Nanometern.Wählen Sie je nach Detektor eine Verweilzeit, damit das Bild nicht zu verrauscht wird. Da die Bühne eine große Distanz zwischen der Aufnahme dieses und dieses Abschnitts zurücklegen muss, definieren Sie die Fokuswerte mindestens für den ersten Abschnitt jedes Menübands mit der Option Protokoll prüfen. Starten Sie dann die automatisierte REM-Bildgebung über die gesamte Reihe von Zielregionen.Wenn Sie fertig sind, exportieren Sie die erfassten Daten als Bildserie, vorzugsweise im TIF-Format. Importieren Sie Bildserien als virtuellen Stapel nach Fidschi. Schneiden Sie anschließend den Stapel für die weitere Verarbeitung zu, indem Sie den Bereich so nah wie möglich an der gewünschten Struktur zuschneiden.Passen Sie außerdem die Helligkeit und den Kontrast an und speichern Sie den Stapel. Öffnen Sie nach dem Zuschneiden und Optimieren ein neues TrakEM aus dem Menü Datei. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Bildfeld und importieren Sie den Stapel in TrakEM als ein Slice pro Layer.Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ebenen ausrichten. Wählen Sie als Modus die kleinsten Quadrate, legen Sie den Bereich vom ersten bis zum letzten fest und wählen Sie keine als Referenz aus. Wählen Sie als Nächstes die Standardeinstellungswerte aus, und wählen Sie als gewünschte Transformation Starr aus.Wenn die Registrierung abgeschlossen und zufriedenstellend ist, speichern Sie den ausgerichteten Datensatz, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und Exportieren auswählen. Erstellen Sie ein flaches Bild, legen Sie den Bereich vom ersten bis zum letzten Bild fest und lassen Sie die Software den resultierenden Stapel anzeigen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie den Stapel im TIF-Format.Nach der Vorbereitung erscheint das Schnittarray als ein Array, das aus mehreren Bändern mit seriellen Schnitten besteht. Dieser Abschnitt zeigt einen Überblick über eine mit Propidiumiodid gefärbte Arabidopsis-Wurzelspitze. Die sequenziellen Abschnitte dieser Probe wurden wie im Protokoll beschrieben ausgerichtet und kombiniert, um die Probe in 3D als eine einzige Filmdatei darzustellen.Hier sieht man die beiden Zielzellen, die später im REM mit Nanometerauflösung abgebildet werden sollen. Nach zusätzlicher Färbung mit Uranylacetat und Blutcitrat wurden die Arrays im Elektronenmikroskop abgebildet. Dieses statische Bild zeigt den Probenschnitt, der zuerst mit einer Auflösung von 20 Nanometern und in der zweiten Bildgebungsrunde mit einer Auflösung von fünf Nanometern abgebildet wurde.Hier wurden 210 sequenzielle Bilder aus dem Elektronenmikroskop ausgerichtet und beschnitten, wie im Protokoll beschrieben. Das Video zielt nur auf zwei Zellen ab und zeigt in 3D, wie die Vakuolen innerhalb der Zellen angeordnet und manchmal auch verbunden sind. Die automatisierte hierarchische Abbildung der Arrays im REM, die hier gezeigt wird, kann eine nahtlose Kartierung auf verschiedenen Auflösungsstufen ermöglichen, von einem Überblick über das gesamte Array bis hin zu subzellulären Details.Bei höchster Vergrößerung sind Vakuolen, Mitochondrien, der Zellkern und das endoplasmatische Retikulum erkennbar. Einmal gemeistert, kann das Platzieren von Abschnittsbändern nebeneinander auf einem typischen Substrat in wenigen Stunden erledigt werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Dadurch können Hunderte von Schnitten auf einem Substrat für die Bildgebung bereitgestellt werden.Die Bildgebungszeit für eine so große Anzahl von Schnitten kann von Mikroskop zu Mikroskop variieren, umso mehr, wenn Ihre bevorzugten Bildgebungsinstrumente unterschiedliche Automatisierungsgrade haben. Interessant ist, dass der allgemeine Arbeitsablauf problemlos mit anderen bildgebenden Verfahren kombiniert werden kann, wie z. B. der Standard-Histo-Färbung oder sogar der Candolumineszenz, oder er kann einfach als eigenständiges Werkzeug für die arthostrukturelle Bildgebung großer Volumina verwendet werden. Ein weiterer Aspekt dieses Workflows ist die einfache Zugänglichkeit.Erste Studien sind ohne zusätzliche Tools oder Automatisierung, d.h. ohne große Investitionen, durchführbar. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung vom Arbeitsablauf haben und wissen, wie multimodale sowie hierarchische Bildgebung verwendet werden können, um interessante Strukturen in einem großen 3D-Volumen in verschiedenen Auflösungsstufen anzuvisieren und abzubilden.

multimodal-hierarchical-imaging-serial-sections-for-finding-specific

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

Wir beschreiben die Vorbereitung von Bändern serieller Schnitte und deren Sammlung auf großen Transferträgern für den Einsatz als Array-Tomographie-Proben sowie automatisierte Bildgebungsverfahren in einem Rasterelektronenmikroskop. Das Protokoll ermöglicht das Screening, den Abruf und die gezielte Bildgebung lokaler, seltener Ereignisse und die Erfassung großer Datenmengen.

Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH  - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.

Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz, das optimiert wurde, um die dreidimensionale Architektur von Peritonealmetastasen zu charakterisieren.

Dreidimensionale Bildgebung von tumortragendem Gewebe mit dem iterativen Bleaching erweitert den Multiplexitätsansatz

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Dieses Protokoll stellt einen multimodalen Ansatz dar, der Raman-Spektroskopie und tomographische Phasenmikroskopie für eine markierungsfreie, nicht-invasive Phänotypisierung lebender menschlicher Brustkrebszellen kombiniert. Es umfasst eine benutzerfreundliche, human-bias-freie Analysepipeline für eine schnelle, quantitative morphochemische Analyse, die detaillierte molekulare und strukturelle Einblicke mit Anwendungen in der Krebsforschung und Zellbiologie liefert.

Ein multimodales Bildgebungs-Framework zur Verbesserung der Phänotypisierung von lebenden markierungsfreien Brustkrebszellen

Wir führten eine neuartige Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine unvoreingenommene Bildgebung aller Zellen in Hirnproben auf Mesoskala ermöglicht und nahtlos in den Bildablauf der bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie an derselben Probe integriert werden kann.

Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

Erfahren Sie Array-Tomographie für die ultrastrukturelle Bildgebung von Geweben mittels Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Identifizierung zellulärer Zielstrukturen in großen 3D-Volumina.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen (Video) | JoVE Journal

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Weitere Videos entdecken