Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

Das übergeordnete Ziel dieser Videomikroskopietechnik ist es, die funktionellen Eigenschaften isolierter Mikrogefäße als Reaktion auf pharmakologische und physiologische Reize zu untersuchen und Einblicke in die Pathophysiologie und molekularen Mechanismen zu geben, die zur vaskulären Dysfunktion beim Menschen beitragen. Diese Methode ist nützlich, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die zur Funktionsstörung der lokalen Mikrogefäße im Fett beitragen, die mit systemischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Blutgefäße nach der Entnahme aus dem menschlichen Körper für einen bestimmten Zeitraum funktionsfähig bleiben und leicht auf ihre physiologischen Eigenschaften untersucht werden können.

Die klinische Relevanz dieses experimentellen Ansatzes besteht darin, dass er es uns ermöglicht, Signalwege zu identifizieren, die bei Krankheitszuständen unterschiedlich verändert sind, und möglicherweise neue therapeutische Ziele zu entdecken. Unter einem Gewebepräpariermikroskop wird mit einer Mikroschere und einer Mikrozange vorsichtig das umgebende Fett und Bindegewebe aus den kleinen Arterien innerhalb der Fettprobe entfernt. Es ist wichtig, die Arterien von den Venolen zu unterscheiden.

Arterien haben in der Regel einen kleineren Durchmesser, zeigen einen größeren Tonus und reagieren robuster als Venolen. Wenn die Arterie isoliert wurde, verwenden Sie Nylon- oder Seidennähte, um alle Äste abzubinden. Verwenden Sie anschließend eine 10-Milliliter-Spritze, um den Schlauch langsam mit frischer Krebslösung zu füllen.

Befestigen Sie dann Gummischläuche an den Druckbehältern und Glaskapillarpipetten in der Kammer. Bewegen Sie anschließend die präparierte Arterie in die Organkammer und kanülieren Sie das Gefäß auf die Glaskapillarpipetten. Befestigen Sie vorsichtig beide Enden der Arterie mit Nylonfäden auf den Pipetten.

Sobald das Gefäß fest sitzt, entfernen Sie langsam den Krebs-Puffer aus der Kammer und geben Sie zwei Milliliter frische Krebslösung in die Kammer. Befestigen Sie anschließend die Organkammer an dem Tisch eines inversen Mikroskops, das mit einer Videokamera ausgestattet ist. Schalten Sie die Kantenerkennungssoftware mit einer Abtastrate von einem Kilohertz ein.

Verbinden Sie den restlichen Druckschlauch mit dem zweiten mit Lösung gefüllten Druckbehälter von Krebs und verbinden Sie dann die Druckbehälter mit dem Druckmessumformer. Wenn alle Schläuche angeschlossen sind, stellen Sie den Heizblock auf 37 Grad Celsius ein. Als nächstes wird mit dem Druckregler der intraluminale Druck alle fünf Minuten schrittweise auf fünf Milliliter Quecksilber erhöht, um den entsprechenden experimentellen Druck innerhalb des Lumens des isolierten Blutgefäßes zu erreichen.

Lassen Sie das Gefäß 20 bis 30 Minuten lang ausgleichen, sobald der Druck 60 Milliliter Quecksilber erreicht, und notieren Sie den Durchmesser der Fettarterie im Ruhezustand. Am Ende der Gleichgewichtsperiode verengen Sie das Blutgefäß auf etwa 55 % des Ruhe-Ausgangsdurchmessers, indem Sie alle fünf Minuten einen Mikroliter Endothelin 1 direkt in das Bad geben, bis der Gefäßdurchmesser angemessen verengt ist. Für die strömungsinduzierte endothelabhängige Vasodilatation wird ein kontinuierlicher Fluss in den intraluminalen Raum der Arterie in gleiche und entgegengesetzte Richtungen induziert, so dass eine Druckdifferenz über das Gefäß entwickelt werden kann, ohne den mittleren intraluminalen Druck von 60 Millimeter Quecksilbersäule zu verändern.

Messen Sie nach drei bis fünf Minuten die flussvermittelte Dilatation. Erhöhen Sie jeden Schritt des Druckgradienten alle fünf bis sechs Minuten um 10 Zentimeter Wasserwechsel bis zu einem Maximum von 100 Zentimetern Wasser. Nachdem Sie die strömungsvermittelte Gefäßerweiterung beurteilt haben, bringen Sie die Druckbehälter wieder auf die gleiche Höhe, um die Induktion der Strömung zu stoppen.

Ersetzen Sie dann die Kammerlösung sofort, aber vorsichtig durch frische Krebslösung, ohne die suspendierte Arterie zu stören, und lassen Sie das Gefäß für 20 bis 30 Minuten auf den Ausgangsdurchmesser zurückkehren. Sobald die Arterie wieder den Ruhedurchmesser erreicht hat, kann eine subtile cholinvermittelte endothelialabhängige Vasodilatation beurteilt werden. Dies beginnt mit der Vorverengung des Gefäßes auf etwa 55 % seines Ruhedurchmessers mit Endothelin 1, wie zuvor gezeigt.

Sobald die Vorverengung erreicht ist, geben Sie zwei Mikroliter mit steigenden Dosen Acetylcholin direkt in das Bad. Notieren Sie die Veränderung des arteriellen Durchmessers fünf Minuten nach Verabreichung jeder Dosis. Nach Abschluss des Acetylcholin-Dosis-Wirkungsverhältnisses beurteilen Sie die endothelunabhängige Vasodilatation und die Lebensfähigkeit des Gefäßes durch sequentielle Verabreichung von Papaverin und endothelunabhängigem Vasodilatator direkt in das Bad.

Endothelabhängige Vasodilatationsreaktionen auf erhöhten Fluss und schiere Belastung oder Acetylcholin sind bei der menschlichen Adipositas in viszeralen und subkutanen Fettarterien signifikant abgestumpft. Die endothelunabhängige Vasodilatation als Reaktion auf Papaverin ist jedoch nicht differentiell zwischen den beiden Diposen verändert, was darauf hindeutet, dass die vaskuläre Dysfunktion in viszeralen Domänen weitgehend eine Folge einer Dysfunktion auf der Ebene des Endothels ist, zumindest in den frühen Stadien der Krankheit. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und fleißig zu sein, da selbst geringfügige Schäden an den Blutgefäßen die Ergebnisse verzerren können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die siRNA-Transfektion der Blutgefäße durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Einfluss bestimmter Gene auf die vasomotorische Funktion bei menschlichen Krankheiten zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Fettgewebsbiologie und Mikrozirkulation, um den Einfluss der Mikroumgebung des Fettgewebes auf die lokale Gefäßgesundheit bei menschlicher Fettleibigkeit zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Pathophysiologie ganzer intakter Segmente menschlicher Blutgefäße, die lebenden Probanden entnommen werden, direkt untersuchen können, ein Prozess, der durch nicht-invasive Bildgebung nicht repliziert werden kann.