Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

Das übergeordnete Ziel dieser Videomikroskopietechnik besteht darin, die funktionellen Eigenschaften isolierter Mikrogefäße als Reaktion auf pharmakologische und physiologische Reize zu untersuchen, um Einblicke in die Pathophysiologie und molekularen Mechanismen zu erhalten, die zur vaskulären Dysfunktion beim Menschen beitragen. Diese Methode eignet sich zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die zur Dysfunktion der lokalen Mikrozirkulation im Fettgewebe beitragen, die mit systemischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurde. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik liegen darin, dass die Blutgefäße nach ihrer Entnahme aus dem menschlichen Körper über einen gewissen Zeitraum hinweg funktionsfähig bleiben und ihre physiologischen Eigenschaften leicht untersucht werden können.

Die klinische Relevanz dieses experimentellen Ansatzes liegt darin, dass er es uns ermöglicht, Signalwege zu identifizieren, die unter Krankheitsbedingungen unterschiedlich verändert sind, und potenziell neue therapeutische Zielstrukturen zu entdecken. Unter einem Gewebedissektionsmikroskop verwenden Sie Mikroscheren und Mikrozangen, um vorsichtig das umgebende Fett- und Bindegewebe von den kleinen Arteriolen innerhalb der Fettgewebeprobe zu entfernen. Es ist entscheidend, die Arteriolen von den Venulen zu unterscheiden.

Arterien weisen typischerweise einen kleineren Durchmesser auf, zeigen einen stärkeren Tonus und reagieren robuster als Venolen. Sobald die Arterie isoliert wurde, verschließen Sie mithilfe von Nylon- oder Seidenlitzen alle Seitenäste. Füllen Sie anschließend langsam das Gefäß mit frischer Krebs-Lösung, indem Sie eine 10-Milliliter-Spritze verwenden.

Danach Gummischläuche an die Druckreservoire und die Glas-Kapillarpipetten innerhalb der Kammer anschließen. Anschließend die präparierte Arterie in die Organkammer überführen und das Gefäß auf die Glas-Kapillarpipetten aufspleißen. Beide Enden der Arterie mit Nylon-Nähten vorsichtig an den Pipetten befestigen.

Wenn das Gefäß sicher befestigt ist, entfernen Sie langsam den Krebs-Puffer aus der Kammer und geben Sie zwei Milliliter frische Krebs-Lösung in die Kammer. Befestigen Sie anschließend die Organkammer auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops, das mit einer Videokamera ausgestattet ist. Schalten Sie die Kanten-Erkennungssoftware mit einer Abtastrate von einem Kilohertz ein.

Verbinden Sie die verbleibende unter Druck stehende Schlauchleitung mit dem zweiten Druckreservoir, das mit Krebs-Lösung gefüllt ist, und anschließend die Druckreservoirs mit dem Druckmessgerät. Sobald alle Schläuche verbunden sind, stellen Sie den Heizblock auf 37 Grad Celsius ein. Erhöhen Sie danach mithilfe der Druckregelungseinheit schrittweise alle fünf Minuten den intraluminalen Druck um fünf Millimeter Quecksilber, um den geeigneten experimentellen Druck im Lumen des isolierten Blutgefäßes zu erreichen.

Lassen Sie das Gefäß 20 bis 30 Minuten lang equilibrieren, sobald der Druck 60 Millimeter Quecksilber erreicht hat, und notieren Sie den Durchmesser der fettigen Arterie in Ruhe. Am Ende der Equilibrierungsphase präkonstriktieren Sie das Blutgefäß auf etwa 55 % des ruhenden Ausgangsdurchmessers, indem Sie alle fünf Minuten einen Mikroliter Endothelin 1 direkt in das Bad geben, bis der Gefäßdurchmesser angemessen verengt ist. Für die flussinduzierte, endothelabhängige Vasodilatation leiten Sie einen kontinuierlichen Fluss in den intraluminalen Raum der Arterie in gleicher und entgegengesetzter Richtung ein, sodass eine Druckdifferenz über das Gefäß hinweg entstehen kann, ohne den mittleren intraluminalen Druck von 60 Millimeter Quecksilber zu verändern.

Nach drei bis fünf Minuten die flussvermittelte Dilatation messen. Den Druckgradienten in Schritten von jeweils 10 Zentimeter Wassersäule alle fünf bis sechs Minuten erhöhen, bis zu einem Maximum von 100 Zentimetern Wassersäule. Nach der Beurteilung der flussvermittelten Gefäßdilatation die Druckreservoirs wieder auf dieselbe Höhe bringen, um die Flussinduktion zu beenden.

Danach sofort, aber vorsichtig die Kammerlösung durch frische Krebs-Lösung ersetzen, wobei die aufgehängte Arterie nicht gestört werden darf, und dem Gefäß ermöglichen, innerhalb von 20 bis 30 Minuten wieder auf den Ausgangsdurchmesser zurückzukehren. Sobald die Arterie den ruhenden Ausgangsdurchmesser wieder erreicht hat, kann eine geringfügige, cholinvermittelte, endothelabhängige Vasodilatation untersucht werden. Dies beginnt damit, dass das Gefäß mit Endothelin 1, wie zuvor gezeigt, vorverengt wird, bis etwa 55 % des Ruheausgangsdurchmessers erreicht sind.

Nach Erreichen der Vorverengung zwei Mikroliter steigender Dosen von Acetylcholin direkt in das Bad geben. Die Änderung des arteriellen Durchmessers fünf Minuten nach der Gabe jeder Dosis aufzeichnen. Nach Abschluss der Dosis-Wirkungs-Kurve für Acetylcholin die endothelunabhängige Vasodilatation und die Gefäßviabilität durch die sequenzielle Gabe von Papaverin und einem endothelunabhängigen Vasodilatator direkt in das Bad überprüfen.

Die endothelabhängigen vasodilatatorischen Reaktionen auf erhöhten Fluss und Scherstress oder auf Acetylcholin sind bei menschlicher Adipositas in viszeralen im Vergleich zu subkutanen Fettgefäßen signifikant vermindert. Die endothelunabhängige Vasodilatation als Reaktion auf Papaverin hingegen unterscheidet sich zwischen den beiden Fettgewebetypen nicht, was darauf hindeutet, dass die vaskuläre Dysfunktion in viszeralen Arealen zumindest in den frühen Krankheitsstadien hauptsächlich auf einer Dysfunktion der Endothelzelle beruht. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in drei bis fünf Stunden abgeschlossen werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sorgfältig vorzugehen, da bereits geringfügige Schäden an den Blutgefäßen die Ergebnisse verfälschen können. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die siRNA-Transfektion der Blutgefäße durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Einflusses spezifischer Gene auf die vasomotorische Funktion bei menschlichen Erkrankungen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Fettgewebsbiologie und Mikrozirkulation den Weg, um den Einfluss des mikrobiellen Umfelds des Fettgewebes auf die lokale Gefäßgesundheit bei menschlicher Adipositas zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Pathophysiologie ganzer, intakter Segmente menschlicher Blutgefäße direkt untersuchen kann, die von lebenden Probanden entfernt wurden – ein Vorgang, der durch nichtinvasive Bildgebung nicht reproduziert werden kann.