Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Das übergeordnete Ziel des Sialglykan-Microarray-Assays ist es, Anti-Neu5Gc-IgG in humanen Seren im Hochdurchsatz gegen eine Vielzahl von Sialglykanen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Glykoimmunologie zu beantworten, z. B. wie Anti-Neu5Gc-Antikörper an verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Krebs, Herzerkrankungen und Xenotransplantation beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Hochdurchsatz-Profiling von Anti-Neu5Gc-Antikörpern gegen eine Vielzahl von Sialglykan-Antigenen ermöglicht.

Das Verfahren wird von Sharon Yehuda, einer Meisterschülerin aus meinem Labor, vorgeführt. Eine sorgfältige und detaillierte Planung der Array-Herstellung und des Layouts ist wichtig, um den Erfolg zu gewährleisten. Dieser Vorgang ist im Textprotokoll und in den ergänzenden Informationen detailliert beschrieben.

Verdünnen Sie jedes Glykan auf 100 Mikromolar in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern Glykan-Druckpuffer in Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes bereiten Sie primäres Amin mit Fluoreszenzfarbstoff auf ein Milligramm pro Millimeter mit Markerpuffer vor. Dann auf ein Mikrogramm pro Milliliter in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter verdünnen.

Bereiten Sie humane IgG-Standardkurvenverdünnungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die 384-Well-Platte auf Eis. Mit einer elektronischen Multipipette aliquotieren Sie sieben Mikroliter jedes Glykan-, Marker- und Standardkurven-IgG gemäß dem im Textprotokoll gefundenen Plattenlayout.

Den Teller mit Parafilm abdecken und zwei Minuten bei 250 mal g und 12 Grad Celsius herunterschleudern. Der Druck muss in einem staubfreien Bereich mit einer Luftfeuchtigkeit von 60 bis 70 % durchgeführt werdenHier werden alle Schritte in einem Reinraum mit entsprechenden Handschuhen und Kleidung zum Schutz durchgeführt. Schalten Sie den Nanodrucker und den Luftbefeuchter ein.

Nachdem Sie die Druckmaschine wie im Textprotokoll beschrieben programmiert haben, positionieren Sie die 384-Well-Platte mit aliquotierten Proben an ihrem Platz auf dem Arrayer-Deck und entfernen Sie die Parafilm-Abdeckung. Beginnen Sie an dieser Stelle mit dem Drucken. Nummerieren Sie die Objektträger mit einem alkoholhaltigen, lösungsmittelbeständigen Markierungsstift und bewahren Sie sie in einer vakuumversiegelten Schachtel im Dunkeln auf.

Um die Arrays zu verarbeiten, nehmen Sie zunächst einen Objektträger aus der vakuumversiegelten Box und legen Sie ihn fünf Minuten lang mit dem Array nach oben in eine chemische Haube, um die überschüssige Flüssigkeit zu verdampfen. Als nächstes hydratisieren Sie den Objektträger, indem Sie ihn in ein mit deionisiertem Wasser gefülltes Färberöhrchen legen. Decken Sie das Röhrchen mit Folie ab und inkubieren Sie es fünf Minuten lang unter langsamem und sanftem Schütteln bei Raumtemperatur.

Um die reaktiven Epoxidgruppen auf dem Objektträger zu blockieren, tauchen Sie den Objektträger in das 50-Milliliter-Färberöhrchen, das mit vorgewärmter Ethanolamin-Blockierungslösung gefüllt ist. Decken Sie das Röhrchen mit Folie ab und inkubieren Sie es 30 Minuten lang unter langsamem und sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Ethanolamin-Blockierungslösung in den entsprechenden Müllbehälter für biologische Gefahren.

Legen Sie dann den Objektträger in ein neues, sauberes Färberöhrchen, das mit 50 Grad Celsius deionisiertem Wasser gefüllt ist. Decken Sie das Röhrchen mit Folie ab und inkubieren Sie es 10 Minuten lang unter langsamem und sanftem Schütteln bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Wasser und geben Sie die Objektträger in einen Glasfärbehalter.

Stellen Sie das Gerät in einen schwingbaren Plattenhalter und zentrifugieren Sie den Objektträger trocken. Legen Sie als Nächstes die Folie auf einen 16-Well-Teiler. Nachdem Sie die Vertiefungen vorbenetzt haben, verwenden Sie eine Mehrfachpipette, um 200 Mikroliter PBST in die Slide Wells zu aliquotieren.

Legen Sie sie dann in eine abgedeckte, feuchte Kammer und schütteln Sie sie fünf Minuten lang. Entfernen Sie den PBST, indem Sie vorsichtig auf ein sauberes Papiertuch schnippen und klopfen. Aliquotieren Sie dann 200 Mikroliter PBS-Ovalbumin-Blockierungspuffer in jede Vertiefung.

Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie als Nächstes den primären Nachweis vor, verdünnt in PBS-OVA-Blockierungspuffer, wie im Textprotokoll beschrieben. Schieben Sie den PBS-OVA-Blockierungspuffer vom Objektträger ab und fügen Sie 200 Mikroliter primären Antikörper pro Vertiefung hinzu.

Inkubieren Sie die Objektträger zwei Stunden lang in einer feuchten Kammer. Schieben Sie dann die primäre Erkennung vom Objektträger ab und waschen Sie sie dreimal mit PBST. Inkubieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in einer feuchten Kammer in PBST, bevor Sie ihn ein letztes Mal mit PBST waschen.

Dann einmal mit PBS waschen. Bereiten Sie anschließend den Sekundärantikörper in PBS vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Schieben Sie das PBS vom Objektträger ab und fügen Sie 200 Mikroliter Sekundärantikörper hinzu.

Schieben Sie den Sekundärantikörper vom Objektträger ab und waschen Sie ihn wie zuvor viermal mit PBST. Entfernen Sie vorsichtig den Rahmen, legen Sie die Objektträger in ein mit PBS gefülltes 50-Milliliter-Objektträgerfärberöhrchen und schütteln Sie es fünf Minuten lang. Füllen Sie anschließend zwei Objektträger-Färbebäder mit entionisiertem Wasser.

Setzen Sie die Rutsche in den Objektträgerhalter ein und tauchen Sie die Rutsche in die erste Badewanne. Tauchen Sie die Rutsche schnell zehnmal ein. Übertragen Sie dann die Rutsche in das zweite Bad und tauchen Sie noch zehnmal ein.

Nach dem Eintauchen den Objektträger zehn Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren. Entsorgen Sie nach der Inkubation das Wasser und geben Sie den Objektträger in einen Glasfärbehalter. Legen Sie den Glasfärbehalter in einen schwingbaren Plattenhalter und zentrifugieren Sie den Objektträger trocken.

Öffnen Sie die Scannerklappe, und legen Sie die Folie mit dem Array nach unten hinein. Starten Sie an dieser Stelle den Scanvorgang. Speichern Sie die gescannten Dias als TIFF-Datei.

Um eine Folie für die Analyse vorzubereiten, wählen Sie "Array-Liste laden" aus, und laden Sie die entsprechende GAL-Datei hoch, die die Arrays in jedem Block auf der Folie abbildet. Es wurden Objektträger mit 16 verschiedenen primären Nachweiseinheiten entwickelt, einer in jedem Block. Die Pflanze Lectin SNA bindet a2-6 gebundene Sialinsäure.

Während die Pflanze Lectin MALII a2-3 gebundene Sialinsäure bindet. Polyklonales Anti-Neu5Gc IgY bindet Neu5Gc-haltige Sialglykane, aber keine Neu5Ac-haltigen Sialglykane. Um das Anti-Neu5Gc-IgG zu profilieren, wurden 12 Seren von gesunden humanen Spendern auf dem gedruckten Sialglykan-Microarray analysiert und unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem anti-humanem IgG in Nanogramm pro Mikroliter normiertem Anti-Human-IgG entwickelt.

Alle getesteten humanen Seren enthielten unterschiedliche Konzentrationen von Anti-Neu5Gc-IgG, wobei die übereinstimmenden Paare von Neu5Ac-haltigen Sialglykanen fast nicht erkannt wurden. Darüber hinaus sind die Anti-Neu5Gc-IgG-Erkennungsmuster zwischen diesen 12 verschiedenen Seren sehr unterschiedlich, sowohl in Bezug auf die Intensität als auch auf die Diversität. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit einem Glykan-Microarray-System in verschiedenen menschlichen Proben im Hochdurchsatz ein Profil von Anti-Neu5Gc-Antikörpern erstellen können.