Name: Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie das Sialoglycan-Microarray-Verfahren zur Hochdurchsatz-Analyse von Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung glykoimmunologischer Prozesse bei Krebs und chronischer Entzündung.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Career Development Award des Israel Cancer Research Fund unterstützt, ein Stipendium der israelischen Nanotechnologie-Initiative und der Helmsley Charitable Trust für einen Focal Technology Area auf Nanomedicines für personalisierte Theranostics (VP-K) und National Institute der Gesundheit gewähren R01GM076360 (zu XC).

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine erfolgreiche Glycan-Microarray-Fertigung erfordert eine sorgfältige Planung und beinhaltet einige wichtige Schritte im Protokoll. Dazu gehören: (1) Planung der Block- und Plattenlayouts, die alle nachfolgenden Parameter definieren ( zB Distanzen, Abstand, Probenmenge und Druck); (2) Reinigung der Stifte und Sicherstellung der Pin-Integrität, die für die Kontrolle der Spot-Homogenität entscheidend ist; (3) Aufrechterhalten hoher Feuchtigkeit während des Druckens, entscheidend für die Vermeidung von Probenve...

Sias sind saure Zucker, die Glykinketten auf Zelloberflächen-Glykoproteinen und Glykolipiden bei Wirbeltieren abdecken. Sia-Expression wird in Krebszellen 1 modifiziert und korreliert mit Progression und / oder Metastase 2 , 3 . Zwei der großen Sia-Formen bei Säugetieren sind Neu5Ac und seine hydroxylierte Form, Neu5Gc 2 . Menschen können Neu5Gc aufgrund einer spezifischen Inaktivierung des für das CMAH-Enzym kodierenden Gens nicht synthetisieren. Diese nicht-menschliche Sia enthält metabolisch in menschliche Zellen als &quot;Selbst&quot;, die aus diätetischen Neu5Gc-reichen Nahrungsmitteln ( zB rotem Fleisch) 4 , 5 stammen . Neu5Gc ist bei niedrigen Niveaus auf den Zelloberflächen von menschlichen Epithelien und Endothelien vorhanden, aber es sammelt sich besonders bei Karzinomen an. Neu5Gc wird vom humanen humoralen Immunsystem 2 , 6 als fremd anerkannt.Die antigene Komplexität von Neu5Gc-Glykane können auf mehreren Ebenen entstehen, einschließlich Neu5Gc Modifikation, Verknüpfung, zugrunde liegenden Glykane und Gerüste, und ihre Dichte, alle reflektiert durch die Komplexität der anti-Neu5Gc Antikörperantwort beim Menschen 6. Einige dieser Antikörper dienen als Karzinom-Biomarker und potenzielle Immuntherapeutika 7 . Das Aufkommen der chemoenzymatischen Synthese verschiedener Sialoglycane 8 ebnete den Weg für eine eingehendere Analyse solcher Antikörper, erleichtert durch den Einsatz der Glycan-Microarray-Technologie 9 , 10 . So sind mit der erleichterten Vorbereitung und Manipulation von großen Bibliotheken von natürlichen und synthetischen Kohlenhydraten Glycan-Mikroarrays zu einer leistungsfähigen Hochdurchsatz-Technologie geworden, um die Wechselwirkungen von Kohlenhydraten mit einer Vielzahl von Biomolekülen 10 , 11 , </sup&gt; 12 , 13 In einem Array-Format werden minimale Mengen an Materialien verwendet, und diese multivalente Anzeige von biologisch relevanten Glykanen ermöglicht die Untersuchung von Tausenden von Bindungsinteraktionen in einem einzigen Experiment. Wichtig ist, dass diese Technologie auch auf die Biomarker-Entdeckung und die Überwachung von Immunantworten in verschiedenen Proben angewendet werden kann 7 , 12 . Die erfolgreiche Glycan-Microarray-Herstellung erfordert die Berücksichtigung von drei wichtigen Aspekten: der Roboter-Typ, die Glycan-Konjugationschemie und die Detektionsoptik. Für die Druckinstrumentenbetrachtung stehen zwei Techniken zur Verfügung: Kontakt- und berührungslose Drucker. Im Kontaktdruck werden 1-48 Stahlstifte in eine Multi-Well-Quellplatte mit Glycan-Lösung getaucht und auf funktionalisierten Glasrutschen durch direktes Kontaktieren der Glas-Gleitfläche entdeckt. Die Lösungsmenge deAn die Folie geleitet wird, ist eine Funktion der anhaltenden Dauer auf der Gleitfläche. Normalerweise werden die Proben zuerst auf einem Glasblock vorgespannt (um homogene Flecken zu erreichen), bevor sie auf die Gleitfläche gedruckt werden. Bei berührungslosen Druckern ( z. B. dem piezoelektrischen Drucker) werden die Glykane aus einer Glaskapillare mit kontrollierten elektrischen Signalen bedruckt. Das elektrische Signal kann fein kalibriert werden, um ein präziseres Drucken im Verhältnis zum Kontaktdruck zu erreichen. Die Größe und Morphologie der Flecken sind auch relativ homogener. Ein zusätzlicher Vorteil ist das Recycling der Probe nach dem Druck auf die Quellplatte. Trotzdem ist der Hauptnachteil von piezoelektrischen Druckern die Druckspitzenbegrenzung (4 oder 8), was zu einer sehr langen Druckdauer führt, die besondere Aufmerksamkeit auf Gleitstabilität, Temperatur, Feuchtigkeit und Probenverdampfung erfordert. Der berührungslose Tintenstrahldrucker benötigt größere Probenvolumina 14 . <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; Im Gegensatz zu den begrenzten verfügbaren Optionen für Druckmethoden ist die Glycan-Konjugationschemie eine komplexere Betrachtung, mit vielen Möglichkeiten zur Auswahl. Ausgewählte Immobilisierungschemie muss sowohl die aktiven Gruppen auf den Glykanen als auch die Schieberoberflächenreaktivität berücksichtigen. Die Glycane, die auf einer bestimmten Mikroarray-Oberfläche immobilisiert werden sollen, entweder synthetisch synthetisiert oder natürlich isoliert, benötigen alle eine identische reaktive Gruppe. Darüber hinaus müssen die Glykane rein und homogen sein. Auf der anderen Seite sollte die Immobilisierungsoberfläche und die Chemie Reproduzierbarkeit und zuverlässige Befestigungsdichte bieten. Mehrere Immobilisierungsmethoden wurden mit entweder kovalenten oder nicht-kovalenten (physikalischen Absorptions-) Bindungen 10 , 11 , 12 , 13 entwickelt . Für detaillierte Informationen über gedruckte Glycan-Microarray-Technologie für die UninitiativeD Ermittler, beziehen sich auf diese ausgezeichneten Bewertungen 13 , 15 . Wichtig ist, dass die jüngsten Mindestinformationen für eine Glycomics Experiment (MIRAGE) Initiative Leitlinien für die Probenvorbereitung 16 und für die Meldung von Daten aus Glycan-Microarray-Analysen 17 zur Verbesserung der Standards in diesem wachsenden Bereich beschrieben werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Sialoglycan-Mikroarrays mit einem speziellen Kontakt-Nano-Drucker im 16-Well-Format. Jeder der Glycane hat ein primäres Amin, das ihre kovalente Verbindung zu epoxyaktivierten Glasrutschen vermittelt. Wir beschreiben auch die Entwicklung und Analyse einer Folie mit verschiedenen menschlichen Serenproben, Antikörpern und Sia-bindenden Pflanzenlektinen. Sialoglycan Microarray-Assays beinhalten mehrere wichtige Schritte, die Array-Herstellung, Verarbeitung, Entwicklung und Analyse beinhalten. Array-Fertigung erfordert die Planung der arRay-Layout, Vorbereitung der Glykane und Quellplatte, Programmierung der Nano-Drucker, und das Drucken der Folien. Anschließend werden die Folien verarbeitet, entwickelt und analysiert ( Abbildung 1 ).

<table><tbody><tr><td>Primäraminhaltige Sialoglykane</td><td>Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)</td><td>Kontaktieren Sie info@glycohubusa.com für Verbindungsanfragen</td><td>Gedruckte Glykane</td></tr><tr><td>Mononatriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Druckpufferkomponente</td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat-Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>Druckpufferkomponente</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Hy-Labs</td><td>BP-507/500D</td><td>Druckpuffer / Inkubations-/Waschpuffer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Objektträgerblocker</td></tr><tr><td>Reagenz Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G-7893</td><td>Druckpufferkomponente</td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>0700/08</td><td>Objektträgerblocker Reagenz</td></tr><tr><td>Ovalbumin (Grade V)</td> <td>Sigma</td><td>A5503</td><td>Objektträger-Blockierungsprotein</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Objektträgerwaschmittel</td></tr><tr><td>Alexa 555-Hydrazid</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>A20501MP</td><td>Marker auf dem Array</td></tr><tr><td>ChromReines humanes IgG, ganzes Molekül</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>009-000-003</td><td>Druckkomponente</td></tr><tr><td>Biotinyliert - SNA</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1305</td><td>Pflanzenlektin &ndash; Bindung Sia-alpha2&ndash; 6-linked</td></tr><tr><td>Biotinylated-MALII</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1265</td><td>Pflanzliches Lektin &ndash; Bindung von Sia-alpha2&ndash; 3-linked</td></tr><tr><td>Chicken-anti Neu5Gc IgY</td><td>BioLegend</td><td>146903</td><td>Primärnachweis</td></tr><tr><td>Cy3-Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-0848</td><td>Biotin-Bindung</td></tr><tr><td>Cy3-anti Human IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109-165-088</td><td>Sekundärnachweis gegen humanes IgG</td></tr><tr><td>Cy3-anti Chicken IgY</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-165-155</td><td>Sekundär Nachweis gegen Hühnerfleisch IgY</td></tr><tr><td>Humane Serenproben</td><td>Israelische Blutbank</td><td></td><td>Primärnachweis</td></tr><tr><td>Komprimierter Stickstoff (Klasse 5)</td><td></td><td></td><td>Allgemeines Staub-/Trocknungswerkzeug</td></tr><tr><td>Epoxidbeschichtete Objektträger</td><td>Corning</td><td>40044</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Epoxidbeschichtete Objektträger</td><td>PolyAn</td><td>2D 104-00-221</td><td>Diapositive. Bei dieser Art von Objektträgern ist die Oberfläche hydrophober (im Vergleich zu Kernobjektträgern), daher müssten die Glykane Print Buffer mit 0,005% Tween-20 ergänzt werden, um 100 & Mikro zu erhalten; M große Flecken.</td></tr><tr><td>384-Well-Mikrotiterplatte</td><td>Genetix</td><td>2070</td><td>Druckplatte</td></tr><tr><td>VWR Labormarker</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td>Objektträgerbeschriftung</td></tr><tr><td>Färberöhrchen</td><td>ArrayIt</td><td>MST</td><td>Objektträgerentwicklungswerkzeug</td></tr><tr><td>Färbebad</td><td>VWR</td><td>25608-904</td><td>Objektträgerentwicklungswerkzeug</td></tr><tr><td>Objektträger Glashalter</td><td>VWR</td><td>631-9321</td><td>Objektträgerentwicklungswerkzeug</td></tr><tr><td>GenePix Scanner</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>4000B</td><td>Diascanner</td></tr><tr><td>LM-60 Nanoprinter</td><td>ArrayIt</td><td>LM-60 Array-Drucker</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>ArrayIt</td><td>946MP3</td><td>Druckpins</td></tr><tr><td>ProPlate Modul</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>P37004</td><td>Dia-Entwicklungsmodul</td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Bio-Lab</td><td>2321020500</td><td>Erforderlich für Arrayer und Luftbefeuchter</td></tr><tr><td>Elektronische Multi-Pippete, 8 Kanal, Lautstärkebereich 2-125 &mu; L</td><td>Thermo-Fisher Scientific (Matrix)</td><td>MA-2131 Impact2 Equalizer 384</td><td>Multi-Pippete für die Probenverteilung in eine 384-Well-Platte</td></tr></tbody></table>

profiling anti-neu5gc igg in menschlichen seren mit einem sialoglycan-microarray-assay

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera with a Sialoglycan Microarray Assay 

Die Zellen werden mit einem Mantel von Kohlenhydrat-Ketten (Glykane) bedeckt, der gewöhnlich bei Krebs verändert wird und der Variationen in der Sialinsäure (Sia) -Expression beinhaltet. Dies sind saure Zucker, die ein 9-Kohlenstoff-Grundgerüst haben und diese Kappe Wirbeltiere Glykane auf Zelloberflächen. Zwei der wichtigsten Sia-Formen bei Säugetieren sind N- Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und ihre hydroxylierte Form, N- Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc). Menschen können keine endogenen Neu5Gc aufgrund der Inaktivierung des Gens, das für Cytidin 5&#39;monophosphat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) Hydroxylase (CMAH) kodiert, produzieren. Ausländische Neu5Gc wird von menschlichen Zellen durch den diätetischen Verzehr von rotem Fleisch und Molkerei erworben und erscheint anschließend auf diversen Glykanen auf der Zelloberfläche, die sich hauptsächlich auf Karzinomen ansammeln. Folglich haben die Menschen zirkulierende Anti-Neu5Gc-Antikörper, die vielfältige Rollen bei Krebs und anderen chronischen Entzündungs-vermittelten Erkrankungen spielen und potenzielle diagnostische und therapeutische Medikamente werdenRgets Hier beschreiben wir einen Hochdurchsatz-Sialoglycan-Microarray-Assay, um solche Anti-Neu5Gc-Antikörper in den menschlichen Seren zu beurteilen. Neu5Gc-haltige Glykane und deren abgestimmte Kontrollpaare (Neu5Ac-haltige Glykane) mit jeweils einem primären Amin-Amin sind kovalent an epoxidbeschichtete Glasscheiben gebunden. Wir veranschaulichen das Drucken von 56 Folien im 16-Well-Format mit einem speziellen Nano-Drucker, der bis zu 896 Arrays pro Druck erzeugen kann. Jede Folie kann verwendet werden, um 16 verschiedene menschliche Serenproben für die Bewertung von Anti-Neu5Gc-Antikörperspezifität, Intensität und Diversität zu screenen. Das Protokoll beschreibt die Komplexität dieses robusten Tools und bietet eine grundlegende Leitlinie für diejenigen, die die Reaktion auf Neu5Gc diätetische Kohlenhydrat-Antigen in verschiedenen klinischen Proben in einem Array-Format zu untersuchen.

Array Drucken, Entwicklung und Analyse: Das Drucken eines Sialoglycan-Mikroarrays mit mehreren Glycan-Proben und menschlichen IgG-STD-Kurven in 16 verschiedenen Blöcken erfordert eine sorgfältige Kalibrierung, um sicherzustellen, dass alle Proben in allen 16 Blöcken pro Folie und allen Folien im gleichen Drucklauf gleichmäßig wie möglich gedruckt werden. Daher sind mehrere Kalibrierungsexperimente erforderlich, bevor die spezifis...

Ein Sialoglycan-Mikroarray-Assay kann verwendet werden, um Anti-Neu5Gc-Antikörper in menschlichen Seren zu bewerten, was es zu einem potentiellen Hochdurchsatz-Diagnosetest für Krebs und andere chronisch entzündungsvermittelte menschliche Krankheiten macht.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Cells are covered with a cloak of carbohydrate chains (glycans) that is commonly altered in cancer and that includes variations in sialic acid (Sia) ...

Das übergeordnete Ziel des Sialglykan-Microarray-Assays ist es, Anti-Neu5Gc-IgG in humanen Seren im Hochdurchsatz gegen eine Vielzahl von Sialglykanen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Glykoimmunologie zu beantworten, z. B. wie Anti-Neu5Gc-Antikörper an verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Krebs, Herzerkrankungen und Xenotransplantation beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Hochdurchsatz-Profiling von Anti-Neu5Gc-Antikörpern gegen eine Vielzahl von Sialglykan-Antigenen ermöglicht.Das Verfahren wird von Sharon Yehuda, einer Meisterschülerin aus meinem Labor, vorgeführt. Eine sorgfältige und detaillierte Planung der Array-Herstellung und des Layouts ist wichtig, um den Erfolg zu gewährleisten. Dieser Vorgang ist im Textprotokoll und in den ergänzenden Informationen detailliert beschrieben.Verdünnen Sie jedes Glykan auf 100 Mikromolar in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern Glykan-Druckpuffer in Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes bereiten Sie primäres Amin mit Fluoreszenzfarbstoff auf ein Milligramm pro Millimeter mit Markerpuffer vor. Dann auf ein Mikrogramm pro Milliliter in einem Gesamtv

profiling-anti-neu5gc-igg-human-sera-with-sialoglycan-microarray

Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Video demonstriert die gedruckte Glykan-Array-Technologie zur Analyse von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern in Mausserum. Die Antikörper im Serum interagieren mit spezifischen Glykanen auf dem Chip, was durch Immunfärbung und anschließende Fluoreszenzuntersuchung bestätigt wird.

Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Diese Arbeit zeigt das Potenzial der gedruckten Glycan Array (PGA) Technologie für die Analyse von zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat bei Kleintieren.

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Das Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) ist eine Hochdurchsatztechnik für die Analyse der Zusammensetzung von Glykanen in biologischen Proben.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Lernen Sie das Sialoglycan-Microarray-Verfahren zur Hochdurchsatz-Analyse von Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung glykoimmunologischer Prozesse bei Krebs und chronischer Entzündung.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

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