Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie ist etablierte Technologie für die genaue Analyse von IgG n-Glykin aufgrund seiner Empfindlichkeit scheint zu sein und es hat die Fähigkeit, eine spezifische Informationen von Glycan diese Methode ist einfach zu bedienen und hat eine Anzahl von verschiedenen relativ niedrigen Kosten von Schritten, hohe Reproduzierbarkeit Die Fähigkeit, Glykanisomere. Die Messungen von Protein enthaton im Plasma könnten attraktiv sein. in der Medizin.

auch mit IgG in Glykose-Basis und solche und biologische enthalten die Bevölkerung assoziiert. Sie wissen, dass von unreinem Zustand verwendet wird, um IgG in Glykanen zu testen. Tatsächlich kann es n-Glykane von Protein testen.

Dies ist erforderlich, in einem kreuzgebundenen Protein von zwei reinen Zustand kann auf das Protein angewendet werden Der ODER-Experimentalprozess ist relativ einfach, während der experimentelle Prozess standardisiert werden muss. Der Versuchdauert durchundgehend, und die experimentellen Schritte müssen auswendig gelernt werden, um die experimentellen Fähigkeiten zu beherrschen. Um die Proben vorzubereiten, tauen Sie die gefrorene Plasmaprobe auf.

Dann Zentrifuge bei 80 mal G für 10 Minuten. Lassen Sie das Protein G monolithische Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Übertragen Sie 100 Mikrometer Probe in jeden Brunnen der Zwei-Milliliter-Sammelplatte.

Fügen Sie ultrareines Wasser als eine Kontrollprobe hinzu. Verdünnen Sie die Proben mit einem X PBS um einbis sieben Volumenvolumenverhältnis. Reinigen Sie eine 0,45 Mikron hydrophile Polypropolen-Filterplatte mit 200 Mikroliter reinem Ultrawasser.

Wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. Die verdünnten Proben in die Filterplatte geben und die Proben mit einer Vakuumpumpe mit Einem Druck von 266,6 bis 399,9 Pascal in die Sammelplatte filtern. Um das Protein G monolithische Platten vorzubereiten, entsorgen Sie zuerst den Speicherpuffer.

Reinigen Sie die monolithischen Platten mit zwei Millilitern reinem Reinstwasser, zwei Millilitern eines X PBS, einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure, zwei Millilitern 10 X PBS und zwei Millilitern eines X PBS sequenziell. Entfernen Sie die folgende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe. Übertragen Sie die gefilterten Proben mit einer Mehrkanalpipette zur IgG-Bindung und -Reinigung auf die monolithische Proteinplatte G.

Fügen Sie dann zwei Milliliter eines X PBS hinzu, um die monolithischen Platten zu reinigen. Entfernen Sie die PBS mit einer Vakuumpumpe, und wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. IgG mit einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure illute und filteren die Proben per Vakuumpumpe in die Sammelplatte.

Dann 170 Mikroliter eines molaren Ammoniumbicarbonats in die Sammelplatte geben. Detektieren Sie die IgG-Konzentration mit einem Absorptionsspektropetometer bei der optimalen Wellenlänge von 280 Nanometern. Das extrahierte IgG drei Stunden in einen Ofen stellen, um bei 60 Grad Celsius zu trocknen.

Bestimmen Sie die menge, die gemäß ihrer Konzentration, wie im Manuskript beschrieben, beobachtet werden soll, und bewahren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius auf. Sammeln Sie das getrocknete IgG und speichern Sie Chemikalien wie 1,33% SDS, vier Prozent IgePal und 5% PBS bei Raumtemperatur. Bereiten Sie Indoglycosidase F-Enzym durch Verdünnung von 250 Einheiten Enzym mit 250 Mikroliter reines Ultrawasser.

Zur Denaturierung des IgG 30 Mikroliter 1,33%SDS hinzufügen und durch Wirbelmischen mischen. Die Probe für 10 Minuten in einen 65-Grad-Celsius-Ofen geben. Dann entfernen Sie es aus dem Ofen, und lassen Sie es für 15 Minuten abkühlen.

Fügen Sie 10 Mikroliter von vier Prozent IgePal in die gleiche Probe, und legen Sie es auf einem Schüttel-Inkubator für fünf Minuten. Fügen Sie 20 Mikroliter von fünf X PBS und 30 bis 35 Mikroliter 0,1 Molnatriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert auf 8,0 zu regulieren, und mischen Sie sie durch Wirbeln. Fügen Sie vier Mikroliter Endoglycosidase F Enzym, und mischen durch Wirbeln.

Dann für 18 bis 20 Stunden in einem 37 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Am nächsten Tag die freigesetzten Gylkane bei 60 Grad Celsius in einen Ofen stellen, um zweieinhalb bis drei Stunden zu trocknen. Sparen Sie die Freisetzungglycans bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung.

Bereiten Sie die beiden Aminobenzimid-Etikettierungsreagenz mit 24,5 Mikroliter DMSO, 10,5 Mikroliter Essigsäure, 0,7 Milligramm zweiaminobenzimid und sechs Milligramm Natriumcyanoborohydrid vor. Als nächstes beschriften Sie die Glykane in einem dunklen Raum, indem Sie 35 Mikroliter zweiaminobenzimid-Etikettierungsreagenz hinzufügen. Die beschrifteten Glcans für fünf Minuten auf einen Oszillator übertragen und dann drei Stunden bei 65 Grad Celsius in den Ofen geben.

Danach auf Raumtemperatur für 30 Minuten übertragen. Die IgG n-Glykase, mit der wir sie kennzeichnen, um durch den fluoreszierenden Detektion von unreinem Zustand nachgewiesen zu werden. Pretreat eine 0,2 Mikron GHP Filterplatte mit 200 Mikroliter 70%Ethanol, 200 Mikroliter ultrareinem Wasser und 200 Mikroliter 96%aceto Nitril bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie dann den Abfall mit einer Vakuumpumpe. Um die beiden Aminobenzimid-markierten Glykane zu reinigen, fügen Sie der Probe 700 Mikroliter 100% Acetonitril hinzu und übertragen Sie sie für fünf Minuten in einen Schüttelinkubator. Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie den Überstand für zwei Minuten auf eine 0,2 Mikrometer GHP-Filterplatte und entfernen Sie das Filtrat mit dem Vakuum. Waschen Sie die beiden Aminobenzimid-beschrifteten Glykin mit 200 Mikroliter n96%Acetonitril bei vier Grad Celsius, und entfernen Sie das Filtrat mit einer Vakuumpumpe fünf- bis sechsmal. Erleuchten Sie zwei Aminobenzimid markiert Glykan mit 100 Mikroliter ultra reinem Wasser dreimal.

Die beiden mit Aminobenzimid bezeichneten Glykane in einen Ofen geben, um bei 60 Grad Celsius dreieinhalb Stunden zu trocknen. Die beschrifteten n-Glykane bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung speichern. Öffnen Sie zunächst die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.

Waschen Sie UPLC-Instrumente mit 50% Lösungsmittel B und 50% Lösungsmittel C bei einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 30 Minuten. Dann mit 25% Lösungsmittel A und 75%Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 20 Minuten waschen. Fügen Sie dann eine Durchflussrate von 0,4 Milliliter pro Minute hinzu.

Lösen Sie die beschrifteten n-Glykane mit 25 Mikrolitern einer Mischung aus 100%Acetonitril und ultrareinem Wasser bei einem Volumenverhältnis von zwei bis eins auf. Dann Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, und verwenden Sie ein Trockenerohr, um 10 Mikroliter des Überstandes in die UPLC-Instrumente zu laden. Trennen Sie die beschrifteten n-Glykane mit einer Durchflussrate von 0,4 Millilitern pro Minute mit einem linearen Gradienten von 75% bis 62%Acetonitril für 25 Minuten.

Führen Sie dann einen analytischen Lauf von Dexteran Kalibrierleiter Glykopeptid-Säule auf einem UPLC bei 60 Grad Celsius. Detektieren Sie n-glykanische Leuchtstoffröhren bei X-Zitatund-Emissionswellenlängen von 330 Nanometern bzw. 420 Nanometern. Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurden IgG n-Glykane in 24 anfänglicheN IgG-Glykanspitzen basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert.

Die n-glykanischen Strukturen sind in 24 Arten durch Massenspektrometriedede verfügbar. Um die Wiederholbarkeit und Stabilität des Verfahrens zu beschwichtigen, wurde die Standardprobe sechsmal parallel getestet. Die Glyzinpeaks mit relativ geringen Anteilen wiesen hohe Messfehler von mehr als 10 % des Variationskoeffizienten auf.

In dem Stück und wichtig für die Bildung zu einer etablierten IgG n-glykanische Struktur, insbesondere für die Einrichtung von Terminal Daher ist anstelle von 3.3 IgG n-Glyse in gefunden e.V. die Bedeutung von IgG entscheidend. Glycane von sind dafür bekannt, anders zu sein. Mit den Entwicklungen in der Glykan-Prototomik, kombiniert in Glykanen, um Informationen zu diesem zu erkunden, so dass es als Potenzial für die heutige Diagnose verwendet werden kann.

Nach dieser Technikentwicklung bietet es eine neue Möglichkeit, die