Name: Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Erfahren Sie die UPLC-basierte Analyse von IgG N-Glykanen für die Glykobiologie. Diese Methode bietet hohe Sensitivität, Reproduzierbarkeit und kostengünstige Anwendung in der medizinischen Diagnostik.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) und des Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020) unterstützt.

Alle im Protokoll enthaltenen Themen wurden von der Ethikkommission der Capital Medical University, Peking, China12genehmigt. Zu Beginn der Studie wurde von jedem Fach die schriftliche Zustimmung in Kenntnis der Sachlage eingeholt.
1. IgG-Isolierung
<ol><li>Herstellung der Chemikalien inklusive Bindungspuffer (Phosphatgepufferte Saline, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), Neutralisationspuffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), Eluent: 0,1 M Ameisensäure (pH = 2,5), Neutralisationslösung für Eluent: 1 M Ammoniumbicarbonat, gespeicherter Puffer: 20% Ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), Reinigungslösung für Protein G: 0,1 M NaOH + 30% Propan-2-ol. HINWEIS: Der pH-Wert ist in diesem Protokoll von entscheidender Bedeutung. Die Elution von IgG erfordert einen sehr niedrigen pH-Wert, und es besteht die Gefahr des Verlustes von Sialinsäuren durch saure Hydrolyse. Daher erfolgt die Elution innerhalb von Sekunden, und der pH-Wert wird schnell wieder neutralisiert, wodurch die Integrität von IgG und den Sialsäuren erhalten bleibt.</li>
	<li>Bereiten Sie die Proben vor: die gefrorene Plasmaprobe auftauen und dann 10 min bei 80 x g zentrieren und das Protein G monolithische Platte und die oben genannten Chemikalien 30 min bei Raumtemperatur (RT) lassen.</li>
	<li>Übertragen Sie eine 100-L-Probe (die verwendet werden kann, um 2x zu erkennen, um den ersten Ausfall zu verhindern) in eine 2 ml-Sammelplatte (hier wurden insgesamt sechs Standardproben, eine Kontrollprobe [ultrareines Wasser] und 89 Plasmaproben für 96 Bohrscheiben ausgelegt und nach dem Zufallsprinzip zugewiesen. auf die Platte).</li>
	<li>Die Proben mit 1x PBS mit 1:7 (v/v) verdünnen.</li>
	<li>Reinigen Sie eine 0,45 m hydrophile Polypropylen -Filterplatte (GHP) mit 200 l reinem Reinstwasser (Wiederholung 2x).</li>
	<li>Die verdünnten Proben in die Filterplatte geben und die Proben mit einer Vakuumpumpe in die Entnahmeplatte filtern (Vakuumdruck bei 266.6-399.9 Pa).</li>
	<li>Herstellung des Proteins G monolithische Platten<ol>
<li>Verwerfen Sie den Speicherpuffer.</li>
		<li>Reinigen Sie die monolithischen Platten mit 2 ml reinem Wasser, 2 ml 1x PBS, 1 ml 0,1 M Ameisensäure, 2 ml 10x PBS, 2 ml 1x 1x PBS (sequentiell) und entfernen Sie fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.</li>
	</ol></li>
	<li>Die gefilterten Proben zur IgG-Bindung und -Reinigung auf die monolithische Protein-G-Platte geben und anschließend die monolithischen Platten mit 2 ml 1x PBS reinigen (Reinigung 2x wiederholen).</li>
	<li>Elute IgG mit 1 ml 0,1 M Ameisensäure und Filtern Sie die Proben per Vakuumpumpe in die Sammelplatte, und fügen Sie dann 170 l 1 M Ammoniumbicarbonat in die Sammelplatte ein.</li>
	<li>IgG-Konzentration mit einem Absorptionsspektrophotometer (optimale Wellenlänge = 280 nm) erkennen.<ol>
<li>Öffnen Sie die Software und wählen Sie den Protein-CY3-Modus aus.</li>
		<li>Zeichnen Sie 2 l ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Leer, um den Bildschirm zu löschen (wiederholen Sie 1x).</li>
		<li>Zeichnen Sie 2 l ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Probe, um das reine Wasser zu erkennen.</li>
		<li>Zeichnen Sie 2 L igG-Probe und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Sample, um das Sample zu erkennen.</li>
		<li>Zeichnen Sie 2 L ultrareines Wasser und laden Sie es in den Bildschirm, und klicken Sie dann in der Software auf Leer, um den Bildschirm zu löschen.</li>
		<li>Schließen Sie die Software. ANMERKUNG: Die Formel für die Berechnung der IgG-Konzentration lautet wie folgt: CIgG = Absorption x Aussterbekoeffizient (13,7) x 1.000 g/ml</li>
	</ol></li>
	<li>Das extrahierte IgG in einem Ofen bei 60 °C trocknen und das extrahierte IgG (300 l extrahiertes IgG für 4 h) aufbewahren.<ol>
<li>Entfernen Sie 300 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration größer als 1.000 g/ml ist.</li>
		<li>Entfernen Sie 350 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration zwischen 500-1.000 g/ml liegt.</li>
		<li>Entfernen Sie 400 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration zwischen 200-500 g/ml liegt.</li>
		<li>Entfernen Sie 600 l extrahiertes IgG, wenn die Konzentration kleiner als 200 g/ml ist. ANMERKUNG: Die Konzentration von IgG sollte vorzugsweise >200 g/ml für die nachfolgende Detektion betragen. Die durchschnittliche IgG-Menge sollte vorzugsweise >1.200 g betragen, was bei einem Fehlschlagen des ersten Tests 2x getestet werden kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung der monolithischen Proteinplatte zur Wiederverwendung<ol>
<li>Waschen Sie die Platte mit 2 ml reinem Wasser, 1 ml 0,1 M NaOH (zur Entfernung von gefällten Proteinen), 4 ml reinem Wasser und 4 ml 1x PBS (sequentiell), und entfernen Sie dann fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte mit 2 ml reinem Wasser, 2 ml 30% Propan-2-ol (zur Entfernung gebundener hydrophober Proteine), 2 ml reinem Wasser und 4 ml 1x PBS (sequenziell), und entfernen Sie dann fließende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte mit 1 ml Puffer (20% Ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) und fügen Sie 1 ml Puffer (20% Ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) auf die Platte, dann lassen Sie die Platte bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Glycan-Freisetzung
<ol><li>Bereiten Sie das getrocknete IgG vor und lagern Sie die Chemikalien einschließlich 1,33% SDS, 4% Igepal (vom Licht weg lagern) und 5x PBS bei RT.</li>
	<li>Bereiten Sie das Enzym PNGase F vor, indem Sie das 250-U-Enzym mit 250 l reinem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Denaturierung von IgG<ol>
<li>Fügen Sie 30 l von 1,33% SDS hinzu und mischen Sie sie durch Wirbeln, übertragen Sie die Probe 10 min in einen 65 °C-Ofen, dann entfernen Sie sie aus dem Ofen und lassen Sie sie 15 min ruhen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 l von 4% Igepal hinzu und legen Sie es 5 min auf den Schüttelinkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung und Freisetzung von Glykanen<ol>
<li>Fügen Sie 20 l 5x PBS und 30-35 l 0,1 mol/L NaOH hinzu, um einen pH-Wert von 8,0 zu regulieren, und mischen Sie sie durch Wirbeln. Fügen Sie 4 L PNGase F-Enzym hinzu und mischen Sie sie durch Wirbeln. Dann für 18-20 h in einem 37 °C Wasserbad inkubieren.</li>
		<li>Die freigesetzten Glykane in einem Ofen bei 60 °C für 2,5-3,0 h trocknen.</li>
		<li>Die freigesetzten Glykane bis zur weiteren Messung bei -80 °C speichern. HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung. Der Schlüssel zur Glykanfreisetzung ist die Verbesserung der Aktivität des Enzyms PNGase F, um seine Effizienz zu maximieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Glycan-Etikettierung und -Reinigung
<ol><li>Bereiten Sie das 2-Aminobenzamid (2-AB) Etikettierungsreagenz mit 0,70 mg 2-AB, 10,50 l Essigsäure, 6 mg Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN) und 24,50 l Dimethylsulfoxid (DMSO) (Gesamtvolumen = 35 l) vor. Fügen Sie dann Essigsäure, 2-AB und NaBH3CN in die DMSO ein.</li>
	<li>Die Glykane mit 35 l 2-AB-Etikettierungsreagenz beschriften, die markierten Glykane 5 min auf den Oszillator übertragen, 3 h bei 65 °C in den Ofen geben und dann 30 min auf RT übertragen. HINWEIS: Der gesamte Glykan-Etikettierungsschritt muss unter Lichtschutz durchgeführt werden.</li>
	<li>Eine 0,2-mm-GHP-Filterplatte mit 200 l 70 % Ethanol, 200 l reinem Reinstwasser und 200 l 96 % Acetonitril (4 °C) pausieren und abfallen anschließend mit einer Vakuumpumpe.</li>
	<li>Reinigung von 2-AB-markiertem Glycan<ol>
<li>Fügen Sie dem 2-AB-markierten Glycan 700 l 100 % Acetonril hinzu und überweisen Sie es 5 min in einen Schüttelinkubator.</li>
		<li>Zentrifuge bei 134 x g für 5 min (4 °C).</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe für 2 min auf eine 0,2 m GHP-Filterplatte und entfernen Sie das Filtrat (fließende Flüssigkeit) mit einer Vakuumpumpe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-AB-markiertes Glycan mit 200 l 96% Acetonitril (4 °C) waschen und das Filtrat (fließende Flüssigkeit) mit einer Vakuumpumpe 5x-6x entfernen.</li>
	<li>Elute 2-AB beschriftetes Glycan mit 100 l reinem Wasser 3x.</li>
	<li>Das 2-AB-markierte Glycan in einen Ofen geben, um bei 60 °C für 3,5 h zu trocknen.</li>
	<li>Bewahren Sie die beschrifteten N-Glykane bis zur weiteren Messung bei -80 °C auf.</li>
</ol>4. Hydrophile Wechselwirkungschromatographie und Analyse von Glykanen
<ol><li>Konditionierung von UPLC-Instrumenten und Vorbereitung mobiler Phasen<ol>
<li>Bereiten Sie mobile Phasen mit Lösungsmittel A vor: 100 mM Ammoniumformat (pH = 4,4), Lösungsmittel B: 100% Acetonitril, Lösungsmittel C: 90% reines Reinstwasser (10% Methanol) und Lösungsmittel D: 50% Methanol (ultrareines Wasser).</li>
		<li>Öffnen Sie die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.</li>
		<li>WASCHEN Sie UPLC-Instrumente mit einer Durchflussrate von 0,2 ml/min (50% Lösungsmittel B und 50% Lösungsmittel C) für 30 min, dann bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/min (25% Lösungsmittel A und 75% Lösungsmittel B) für 20 min, dann eine Durchflussrate von 0,4 ml/min Ausgleich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösen Sie die beschrifteten N-Glykane mit 25 l einer Mischung aus 100% Acetonitril und ultrareinem Wasser im Verhältnis 2:1 (v/v). Anschließend zentrifugieren Sie bei 134 g für 5 min (4 °C) und laden Sie 10 l der beschrifteten N-Glykane in die UPLC-Instrumente. </li>
	<li>Trennen Sie die beschrifteten N-Glykane mit einer Durchflussrate von 0,4 ml/min mit einem linearen Gradienten von 75% bis 62% Acetonitril für 25 min. Führen Sie dann einen analytischen Lauf mit dextran Kalibrierleiter/Glykopeptidsäule auf einem UPLC bei 60 °C durch (hier wurden die Proben vor der Injektion bei 4 °C aufbewahrt).</li>
	<li>Erkennen Sie N-Glyklyanfluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 330 nm bzw. 420 nm.</li>
	<li>Integrieren Sie die Glykane basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit.</li>
	<li>Berechnen Sie den relativen Wert jedes Glycan Peak (GP)/ aller Glycan Peaks (GPs) (Prozentsatz, %) wie folgt: GP1: GP1/Gpps*100, GP2: GP2/GpPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
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<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
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<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

UPLC dient als relative quantitative Analysemethode5,15. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass UPLC eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und relativer quantitativer Genauigkeit ist. Die Menge an Glykanen in jedem Peak wird als Prozentsatz der gesamten integrierten Fläche mit UPLC ausgedrückt, was der relative Wert ist. Die relative Quantifizierung verbessert die Vergleichbarkeit von Testproben. Darüber hinaus werden 96 Well-Protein-G-P...

N-Glykosylierung menschlicher Proteine ist eine häufige und wesentliche posttranslationale Modifikation1 und kann dazu beitragen, das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten relativ genau vorherzusagen. Aufgrund der Komplexität seiner Struktur, es wird erwartet, dass es mehr als 5.000 Glykanstrukturen, die großes Potenzial als diagnostische und prädiktive Biomarker für Krankheiten2. N-Glykane, die an Immunglobulin G (IgG) angeschlossen sind, haben sich als wesentlich für die Funktion von IgG erwiesen, und IgG-N-Glykosylierung beteiligt sich am Gleichgewicht zwischen den pro- und entzündungshemmenden Systemen3. Differential-IgG N-Glykosylierung ist an der Entwicklung und Progression von Krankheiten beteiligt, was sowohl eine Veranlagung als auch einen funktionellen Mechanismus darstellt, der an der Krankheitspathologie beteiligt ist. Die entzündliche Rolle der IgG N-Glykosylierung wurde mit Alterung, entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs assoziiert4. 
Mit der Entwicklung der Detektionstechnik Die folgenden Methoden werden am häufigsten in Glykomik mit hohem Durchsatz eingesetzt: hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie mit Fluoreszenzdetektion (UPLC-FLR), Multiplex-Kapillargelelektrophorese mit laserinduzierten Fluores Cence Detection (xCGE-LIF), matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisationszeit-massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und Flüssigchromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS) . Diese Methoden haben frühere Mängel des niedrigen Flusses, instabile Ergebnisse und schlechte Empfindlichkeitsspezifität5,6überwunden.
UPLC ist weit verbreitet, um den Zusammenhang zwischen IgG N-Glykosylierung und bestimmten Krankheiten zu erforschen (d.h. Alterung7, Adipositas8, Dyslipidämie9, Typ-II-Diabetes10, Bluthochdruck11, ischämischer Schlaganfall12, und Parkinson-Krankheit13). Im Vergleich zu den anderen drei oben genannten Methoden hat UPLC die folgenden Vorteile5,14. Erstens bietet es eine relative quantitative Analysemethode, und die Datenanalyse, die die Gesamtflächennormalisierung umfasst, verbessert die Vergleichbarkeit jeder Stichprobe. Zweitens sind die Kosten für Ausrüstung und das erforderliche Know-how relativ gering, was die Implementierung und Umwandlung von Glykosylierungsbiomarkern in klinische Anwendungen erleichtert. Hier wird eine Einführung in UPLC vorgestellt, damit es weiter verbreitet werden kann.

<table><tbody><tr><td>2-Aminobenzamid, 2-AB</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Sammelplatte</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Filterplatte</td><td>Pol</td><td>0,45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-monolithische Platte</td><td>BIA Separations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Plattenrotor</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Deutschland</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium formiat</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ständiges Schütteln Inkubator / Wippe</td><td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Kalibrierungsleiter / Glykopeptidsäule</td><td>Watts technology Co., Ltd, China</td><td>BEH Säule</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td> <td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrische Öfen</td><td>Tester Instruments Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters Technology Co., Ltd, Amerika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Beschriftungskit</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Deutschland</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperaturzentrifuge</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperaturkühlschrank</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verteiler 96-Well-Platte</td><td>Watts-Technologie Co., Ltd, China</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Reinwassermessgerät</td><td>Millipore Co., Ltd, Amerika</td><td>Vorteil A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-Tester</td><td>Sartorius Co., Ltd, Deutschland</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Deutschland</td><td>4672100, 0,5-10&mu; L & 10-100 Monate L & 20-200 Mio. Jahre L & 1000 Mio. Tonnen l</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>Enzym Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN)</td><td>Sigma, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Liquid</td><td>Gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, Amerika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Tieftemperatur-Kühlschrank</td><td>Thermo Co., Ltd, Amerika</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatographie</td><td>Watts Technology Co., Ltd, China</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe</td><td>Watts Technology Co., Ltd, China</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Verflüchtigungsmaschine/Trockner</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Deutschland</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei Instrument Co., Ltd, China</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr><td>Verifizierter Lieferant - Wasserbad-Tester instruments Co., Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Waage</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

immunglobulin g n-glycan analyse durch ultra-performance liquid chromatographie

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics ist eine neue Spezialität in der Omics-Systemforschung, die ein erhebliches Potenzial bei der Entdeckung von Biomarkern der nächsten Generation für Krankheitsanfälligkeit, Wirkstoffzielforschung und Präzisionsmedizin bietet. Alternative IgG N-Glykane wurden bei mehreren häufigen chronischen Krankheiten berichtet und schlugen vor, großes Potenzial in klinischen Anwendungen zu haben (d. h. Biomarker für die Diagnose und Vorhersage von Krankheiten). IgG N-Glykane sind weithin charakterisiert mit dem Verfahren der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (UPLC). UPLC ist eine stabile Detektionstechnologie mit guter Reproduzierbarkeit und hoher relativer quantitativer Genauigkeit. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt, und Glyzanzusammensetzung und relative Häufigkeit im Plasma sind charakterisiert.

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden IgG N-Glykane in 24 anfänglichen IgG-Glykanspitzen (GPs) basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert. Die N-Glyglykanstrukturen sind durch Massenspektrometrienachweis gemäß einer früheren Studie (Tabelle 1)15verfügbar. Um eine vergleichbare Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten, wurde die Gesamtflächennormalisierung angewandt, bei der d...

Immunglobulin G (IgG) N-Glycanwird durch hydrophile Wechselwirkungschromatographie UPLC charakterisiert. Darüber hinaus ist die Struktur von IgG N-Glycan klar getrennt. Hier wird eine Einführung in diese experimentelle Methode vorgestellt, so dass sie in der Forschung weit verbreitet werden kann.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie ist etablierte Technologie für die genaue Analyse von IgG n-Glykin aufgrund seiner Empfindlichkeit scheint zu sein und es hat die Fähigkeit, eine spezifische Informationen von Glycan diese Methode ist einfach zu bedienen und hat eine Anzahl von verschiedenen relativ niedrigen Kosten von Schritten, hohe Reproduzierbarkeit Die Fähigkeit, Glykanisomere. Die Messungen von Protein enthaton im Plasma könnten attraktiv sein. in der Medizin.auch mit IgG in Glykose-Basis und solche und biologische enthalten die Bevölkerung assoziiert. Sie wissen, dass von unreinem Zustand verwendet wird, um IgG in Glykanen zu testen. Tatsächlich kann es n-Glykane von Protein testen.Dies ist erforderlich, in einem kreuzgebundenen Protein von zwei reinen Zustand kann auf das Protein angewendet werden Der ODER-Experimentalprozess ist relativ einfach, während der experimentelle Prozess standardisiert werden muss. Der Versuchdauert durchundgehend, und die experimentellen Schritte müssen auswendig gelernt werden, um die experimentellen Fähigkeiten zu beherrschen. Um die Proben vorzubereiten, tauen Sie die gefrorene Plasmaprobe auf.Dann Zentrifuge bei 80 mal G für 10 Minuten. Lassen Sie das Protein G monolithische Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Übertragen Sie 100 Mikrometer Probe in jeden Brunnen der Zwei-Milliliter-Sammelplatte.Fügen Sie ultrareines Wasser als eine Kontrollprobe hinzu. Verdünnen Sie die Proben mit einem X PBS um einbis sieben Volumenvolumenverhältnis. Reinigen Sie eine 0,45 Mikron hydrophile Polypropolen-Filterplatte mit 200 Mikroliter reinem Ultrawasser.Wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. Die verdünnten Proben in die Filterplatte geben und die Proben mit einer Vakuumpumpe mit Einem Druck von 266,6 bis 399,9 Pascal in die Sammelplatte filtern. Um das Protein G monolithische Platten vorzubereiten, entsorgen Sie zuerst den Speicherpuffer.Reinigen Sie die monolithischen Platten mit zwei Millilitern reinem Reinstwasser, zwei Millilitern eines X PBS, einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure, zwei Millilitern 10 X PBS und zwei Millilitern eines X PBS sequenziell. Entfernen Sie die folgende Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe. Übertragen Sie die gefilterten Proben mit einer Mehrkanalpipette zur IgG-Bindung und -Reinigung auf die monolithische Proteinplatte G.Fügen Sie dann zwei Milliliter eines X PBS hinzu, um die monolithischen Platten zu reinigen. Entfernen Sie die PBS mit einer Vakuumpumpe, und wiederholen Sie die Reinigung zwei weitere Male. IgG mit einem Milliliter 0,17 Molaren-Ameisensäure illute und filteren die Proben per Vakuumpumpe in die Sammelplatte.Dann 170 Mikroliter eines molaren Ammoniumbicarbonats in die Sammelplatte geben. Detektieren Sie die IgG-Konzentration mit einem Absorptionsspektropetometer bei der optimalen Wellenlänge von 280 Nanometern. Das extrahierte IgG drei Stunden in einen Ofen stellen, um bei 60 Grad Celsius zu trocknen.Bestimmen Sie die menge, die gemäß ihrer Konzentration, wie im Manuskript beschrieben, beobachtet werden soll, und bewahren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius auf. Sammeln Sie das getrocknete IgG und speichern Sie Chemikalien wie 1,33% SDS, vier Prozent IgePal und 5% PBS bei Raumtemperatur. Bereiten Sie Indoglycosidase F-Enzym durch Verdünnung von 250 Einheiten Enzym mit 250 Mikroliter reines Ultrawasser.Zur Denaturierung des IgG 30 Mikroliter 1,33%SDS hinzufügen und durch Wirbelmischen mischen. Die Probe für 10 Minuten in einen 65-Grad-Celsius-Ofen geben. Dann entfernen Sie es aus dem Ofen, und lassen Sie es für 15 Minuten abkühlen.Fügen Sie 10 Mikroliter von vier Prozent IgePal in die gleiche Probe, und legen Sie es auf einem Schüttel-Inkubator für fünf Minuten. Fügen Sie 20 Mikroliter von fünf X PBS und 30 bis 35 Mikroliter 0,1 Molnatriumhydroxid hinzu, um den pH-Wert auf 8,0 zu regulieren, und mischen Sie sie durch Wirbeln. Fügen Sie vier Mikroliter Endoglycosidase F Enzym, und mischen durch Wirbeln.Dann für 18 bis 20 Stunden in einem 37 Grad Celsius Wasserbad inkubieren. Am nächsten Tag die freigesetzten Gylkane bei 60 Grad Celsius in einen Ofen stellen, um zweieinhalb bis drei Stunden zu trocknen. Sparen Sie die Freisetzungglycans bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung.Bereiten Sie die beiden Aminobenzimid-Etikettierungsreagenz mit 24,5 Mikroliter DMSO, 10,5 Mikroliter Essigsäure, 0,7 Milligramm zweiaminobenzimid und sechs Milligramm Natriumcyanoborohydrid vor. Als nächstes beschriften Sie die Glykane in einem dunklen Raum, indem Sie 35 Mikroliter zweiaminobenzimid-Etikettierungsreagenz hinzufügen. Die beschrifteten Glcans für fünf Minuten auf einen Oszillator übertragen und dann drei Stunden bei 65 Grad Celsius in den Ofen geben.Danach auf Raumtemperatur für 30 Minuten übertragen. Die IgG n-Glykase, mit der wir sie kennzeichnen, um durch den fluoreszierenden Detektion von unreinem Zustand nachgewiesen zu werden. Pretreat eine 0,2 Mikron GHP Filterplatte mit 200 Mikroliter 70%Ethanol, 200 Mikroliter ultrareinem Wasser und 200 Mikroliter 96%aceto Nitril bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie dann den Abfall mit einer Vakuumpumpe. Um die beiden Aminobenzimid-markierten Glykane zu reinigen, fügen Sie der Probe 700 Mikroliter 100% Acetonitril hinzu und übertragen Sie sie für fünf Minuten in einen Schüttelinkubator. Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Übertragen Sie den Überstand für zwei Minuten auf eine 0,2 Mikrometer GHP-Filterplatte und entfernen Sie das Filtrat mit dem Vakuum. Waschen Sie die beiden Aminobenzimid-beschrifteten Glykin mit 200 Mikroliter n96%Acetonitril bei vier Grad Celsius, und entfernen Sie das Filtrat mit einer Vakuumpumpe fünf- bis sechsmal. Erleuchten Sie zwei Aminobenzimid markiert Glykan mit 100 Mikroliter ultra reinem Wasser dreimal.Die beiden mit Aminobenzimid bezeichneten Glykane in einen Ofen geben, um bei 60 Grad Celsius dreieinhalb Stunden zu trocknen. Die beschrifteten n-Glykane bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Messung speichern. Öffnen Sie zunächst die Software, um die mobilen Phasen zu steuern.Waschen Sie UPLC-Instrumente mit 50% Lösungsmittel B und 50% Lösungsmittel C bei einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 30 Minuten. Dann mit 25% Lösungsmittel A und 75%Lösungsmittel B mit einer Durchflussrate von 0,2 Milliliter pro Minute für 20 Minuten waschen. Fügen Sie dann eine Durchflussrate von 0,4 Milliliter pro Minute hinzu.Lösen Sie die beschrifteten n-Glykane mit 25 Mikrolitern einer Mischung aus 100%Acetonitril und ultrareinem Wasser bei einem Volumenverhältnis von zwei bis eins auf. Dann Zentrifuge bei 134 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, und verwenden Sie ein Trockenerohr, um 10 Mikroliter des Überstandes in die UPLC-Instrumente zu laden. Trennen Sie die beschrifteten n-Glykane mit einer Durchflussrate von 0,4 Millilitern pro Minute mit einem linearen Gradienten von 75% bis 62%Acetonitril für 25 Minuten.Führen Sie dann einen analytischen Lauf von Dexteran Kalibrierleiter Glykopeptid-Säule auf einem UPLC bei 60 Grad Celsius. Detektieren Sie n-glykanische Leuchtstoffröhren bei X-Zitatund-Emissionswellenlängen von 330 Nanometern bzw. 420 Nanometern. Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurden IgG n-Glykane in 24 anfänglicheN IgG-Glykanspitzen basierend auf Spitzenposition und Retentionszeit analysiert.Die n-glykanischen Strukturen sind in 24 Arten durch Massenspektrometriedede verfügbar. Um die Wiederholbarkeit und Stabilität des Verfahrens zu beschwichtigen, wurde die Standardprobe sechsmal parallel getestet. Die Glyzinpeaks mit relativ geringen Anteilen wiesen hohe Messfehler von mehr als 10 % des Variationskoeffizienten auf.In dem Stück und wichtig für die Bildung zu einer etablierten IgG n-glykanische Struktur, insbesondere für die Einrichtung von Terminal Daher ist anstelle von 3.3 IgG n-Glyse in gefunden e.V. die Bedeutung von IgG entscheidend. Glycane von sind dafür bekannt, anders zu sein. Mit den Entwicklungen in der Glykan-Prototomik, kombiniert in Glykanen, um Informationen zu diesem zu erkunden, so dass es als Potenzial für die heutige Diagnose verwendet werden kann.Nach dieser Technikentwicklung bietet es eine neue Möglichkeit, die

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Eine spezifische und sensitive Methode, um Einblick in die Expression von Glykosphingolipid Antigene Immunsystem Organe und Zellen zu gewinnen beschrieben. Das Verfahren nutzt die Ionenfallenmassenspektrometer ermöglicht stufenweise Fragmentierung Glycosphingolipid Moleküle zur Strukturanalyse gegenüber chemisch synthetisierten Standard.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Dieses Video demonstriert das Prinzip der Trennung von hydrophilen polaren Verbindungen mittels hydrophiler Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie. Diese Technik hilft bei der Aufreinigung verschiedener polarer Analyten, einschließlich N-Glykanen.

Hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie: Eine Technik zur Trennung hydrophiler polarer Analyten mit Hilfe von hydrophilen Kügelchen

Es wurde ein Hochdurchsatzprotokoll für die kombinierte Proteomik- und Glykomik-Aufreinigung und die LC-MS/MS-Quantifizierung im Plasma entwickelt. Die Deamidierungsanalyse von N-verknüpften Glykosylierungsmotiven war spezifisch für deglykosylierte Stellen. Eine genaue Quantifizierung der N-Glykane wurde durch die Kopplung der filtergestützten N-Glykan-Trennung an die Individualitätsnormalisierung bei der Markierung mit der Glykanhydrazid-Tag-Strategie erreicht.

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Dieser Artikel stellt eine verbesserte Form einer neuartigen Bottom-up-Glykomics-Technik vor, die entwickelt wurde, um das gepoolte Zusammensetzungsprofil von Glykanen in unfraktionierten Bioflüssigkeiten durch die chemische Zerlegung von Glykanen in ihre konstituierenden bindungsspezifischen Monosaccharide für den Nachweis durch GC-MS zu analysieren. Mögliche Anwendungen sind die Früherkennung von Krebs und anderen glykan-affektiven Störungen.

Glycan Knoten Analyse: Ein Bottom-up-Ansatz Glycomics

Ein Sialoglycan-Mikroarray-Assay kann verwendet werden, um Anti-Neu5Gc-Antikörper in menschlichen Seren zu bewerten, was es zu einem potentiellen Hochdurchsatz-Diagnosetest für Krebs und andere chronisch entzündungsvermittelte menschliche Krankheiten macht.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Diese Arbeit zeigt das Potenzial der gedruckten Glycan Array (PGA) Technologie für die Analyse von zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat bei Kleintieren.

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere

Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

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Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Glykomics-gesteuerte Glykoproteomics-Methode, eine integrierte Omics-Technologie, die umfassende Einblicke in das heterogene Glykoproteom in komplexen Tumormikroumgebungen bietet, die für ein besseres Verständnis der Glykobiologie von Krebserkrankungen erforderlich sind.

Glykomics-gesteuerte Glykoproteomik ermöglicht eine umfassende Profilierung des Glykoproteoms in komplexen Tumormikroumgebungen 

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Freisetzung von O-Glykanen aus Muzinen und die anschließende Entsalzung, Permethylierung und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie vor.

Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Erfahren Sie die UPLC-basierte Analyse von IgG N-Glykanen für die Glykobiologie. Diese Methode bietet hohe Sensitivität, Reproduzierbarkeit und kostengünstige Anwendung in der medizinischen Diagnostik.

Immunglobulin G N-Glycan Analyse durch Ultra-Performance Liquid Chromatographie

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