Paarung und Eizellimplantation: Eine Methode, um Embryonen zu erzeugen und sie nach Entwicklungsstadien zu sortieren

- Beginnen Sie mit einem Paarungstank, einem Tank mit einem herausnehmbaren Einsatz, durch den die Eier fallen können. Geben Sie abends vor der Embryoentnahme zwei männliche und drei weibliche adulte Fische in ein geteiltes Paarungsbecken, um sich über Nacht aneinander zu gewöhnen.

Setzen Sie den Fisch am nächsten Morgen in ein neues Gatterbecken mit Systemwasser um und entfernen Sie die Trennwand. Warten Sie 15 bis 30 Minuten, um den Fischen Zeit zum Paaren und Laichen zu geben.

Sammeln Sie nun die Embryonen und lagern Sie sie in einer Petrischale, in der sich Hanks Embryomedium befindet. Bauen Sie sie während des gesamten Protokolls bei 28,5 Grad Celsius an. Untersuchen Sie die Morphologie von Embryonen unter einem Präpariermikroskop.

Sie werden mehrere Entwicklungsmerkmale beobachten. Durch die Spaltung der Blastoscheibe entstehen mehrere Zellen. Das Blastoderm nimmt die Form eines umgekehrten Bechers über der Dotterzelle an. Paraxiale Mesodermsegmente entwickeln sich im dorsalen Teil des Embryos und so weiter.

Nach 24 Stunden nach der Befruchtung sortieren Sie die Embryonen einfach nach Gesamtkörperlänge. Im Beispielprotokoll werden wir die Verpaarung von transgenen mCherry-Reporterfischen einrichten und die daraus resultierenden Embryonen sortieren.

- Kultivieren Sie Embryonen zunächst bis zu einem Alter von drei Monaten, was der Fortpflanzungsreife entspricht. Trennen Sie zwei erwachsene männliche und drei weibliche Fische vom gewünschten Stamm in getrennte Paarungsbecken mit frischem Systemwasser am Abend vor der Embryoentnahme. Entfernen Sie am nächsten Morgen, nachdem das Licht angeschaltet ist, die Trennwand und lassen Sie die Fische sich auf natürliche Weise paaren, bis Embryonen am Boden des Tanks beobachtet werden.

Entnehmen Sie die Embryonen in 30-Minuten-Intervallen und trennen Sie die Petrischalen mit dem Embryomedium, bis die gewünschte Anzahl entnommen ist. Um die Embryonen zu inszenieren, kultivieren Sie sie in Gruppen von 50 bis 75 pro 10 Zentimeter Petrischale, um ein konsistentes Entwicklungstiming aller Embryonen zu fördern. Halten Sie die Platten dann bei 28,5 Grad Celsius.

Messen Sie das Alter des Embryos anhand der Somitenzahl nach der Segmentierung bis etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und trennen Sie die Embryonen nach dem Entwicklungsalter.