Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines konfokalen fluoreszierenden Mikroskopielasers eine DNA-Schädigung in einem subnukleären Bereich einer Zelle hervorzurufen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der DNA-Reparatur zu beantworten, beispielsweise wie Proteine an Stellen von DNA-Schäden rekrutiert und dort festgehalten werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Echtzeit-Visualisierung des Proteins von Interesse ermöglicht wird, sodass ein Profil der Rekrutierung und Retention erstellt werden kann.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Kammerobjektträger mit den Zellen von Interesse in einen Inkubator für den Mikroskoptisch stellen, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Registrieren Sie die Bildfelder mithilfe eines codierten, automatisierten Mikroskoptisches. Wählen Sie ein erkennbares Merkmal des Kulturgefäßes, wie beispielsweise die Trennwand zwischen den Vertiefungen.

Sammeln Sie ein Bild und notieren Sie die X-Y-Position. Dies ermöglicht die Ausrichtung und Registrierung der X-Y-Positionen ausgewählter Felder nach der Probenvorbereitung. Sobald die Bildregistrierung abgeschlossen ist, wählen Sie ein Feld für die Mikrobestrahlung aus und fokussieren Sie die Probe.

Bei Zellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, wählen Sie die Fokusebene mit dem maximalen nukleären Querschnitt im gewünschten fluoreszierenden Kanal aus. Die Fokussierung auf den maximalen Querschnitt des Zellkerns ist entscheidend, da sie sicherstellt, dass der Fokuspunkt zentral auf dem Kern liegt, um die Rekrutierung des Proteins von Interesse an der Stelle der induzierten Schädigung zu überwachen. Wählen Sie eine deutliche Struktur innerhalb des Zellkerns, beispielsweise den Nukleolus, und bewegen Sie die Fokusebene nach oben und unten, während Sie die Veränderung im Erscheinungsbild beobachten.

Die wahre Fokusebene liegt innerhalb des Übergangs von hell zu dunkel. Um die Probe zu fokussieren, wählen Sie die Fokusebene aus, in der das ausgewählte Merkmal den schärfsten Kontrast aufweist. Der nächste Schritt besteht darin, die Position des interessierenden Bereichs zu registrieren.

Erstellen Sie im Mikroskopie-Software eine dreimal-dreipixelgroße quadratische Region of Interest (ROI). Platzieren Sie diese ROI über dem Kern einer Zelle, die beschädigt werden soll, und definieren Sie diese ROI als Schadens-ROI. Erfassen Sie ein Bild vor der Schädigung, das die Position der Schadens-ROI enthält.

Eine Aufnahme mit Hellfeld im Fluoreszenzkanal für das Protein von Interesse aufnehmen. Die Zellen sind nun bereit für die Laser-Mikrobestrahlung. Für diese Demonstration wird der 405-Nanometer-Laser mit 100 % Leistung verwendet.

Die Dosis des 405-Nanometer-Lasers wird durch die Modulation der Abtastrate gesteuert, wobei ein Scan des ausgewählten Schadens-Bereichs (ROI) durchgeführt wird. Verwenden Sie in diesem Experiment acht bzw. 0,5 Bilder pro Sekunde für die Mikrobestrahlung bei 405 Nanometern. Die Auswahl der geeigneten Laserleistung zum Beschädigen der Zellen ist entscheidend, um verschiedene DNA-Reparaturwege voneinander zu unterscheiden.

Führen Sie die zeitraffende Bildaufnahme von Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen nach der Schädigung durch. Passen Sie Dauer und Frequenz der Zeitraffelaufnahme an, um die Datenerfassung zu optimieren, wobei idealerweise die Anreicherung des fluoreszierenden Proteins am schadhaften ROI und dessen Dissoziation im Verlauf des Experiments erfasst wird. Nach Abschluss des Zeitverlaufs wählen Sie ein neues Zellfeld für die Schädigung aus und setzen die Mikrobestrahlung und die zeitraffende Bildaufnahme fort, bis die gewünschte Anzahl geschädigter Zellen erreicht ist.

Für jede ausgewählte Bedingung werden 10 bis 25 Zellen empfohlen. Um die Gesamtanzahl der Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse zu erhöhen, beschädigen Sie zusätzliche Felder innerhalb des Kulturgefäßes, um einen mehrfeldrigen Zeitverlauf der Reaktion nach der Schädigung zu erzeugen. Notieren Sie den X-Y-Standort jedes Feldes sowie den Zeitpunkt, zu dem die Schädigung erfolgte.

Die Zellen können unmittelbar nach der Schädigung fixiert werden oder für ausgewählte Zeitspannen zur Reparatur freigegeben werden, bevor die Fixierung erfolgt. Um diese Analyse zu beginnen, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in einer Bildanalyse-Software wie NIS-Elements. Erstellen Sie für jede zu vermessende Zelle zunächst eine Referenz-ROI, die den Zellkern darstellt.

Wenden Sie einen Schwellenwertalgorithmus auf das Fluoreszenzsignal an, das die Pixel des Zellkerns umfasst, und wandeln Sie diesen Bereich anschließend in eine ROI um. Erstellen Sie danach eine sechs mal sechs Pixel große ROI und platzieren Sie sie über der Schadens-ROI. Diese größere ROI ist nun die Schadens-ROI für die Analyse.

Notieren Sie für jede zu messende Zelle die mittlere Fluoreszenzintensität für die Referenz- und Schadens-ROIs. Passen Sie für jeden Frame der Zeitreihe die Referenz-ROI an, um sicherzustellen, dass der Kernbereich genau durch die ROI abgedeckt ist, und passen Sie die Schadens-ROI an, um sicherzustellen, dass die Schadensstelle abgedeckt ist. Notieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des fluoreszierenden Signals innerhalb jeder ROI für jeden Frame der Zeitreihe.

Normalisieren Sie für jede Zelle die mittlere Fluoreszenzintensität des Schadens-ROI bezüglich der entsprechenden Referenz-ROI in jedem Frame der Zeitrafferaufnahme. Hier wird die mittlere nukleäre Fluoreszenzintensität als Referenz-ROI verwendet, und die Normalisierung erfolgt durch Subtraktion der mittleren Fluoreszenzintensität des Referenz-ROI von der mittleren Fluoreszenzintensität des Schadens-ROI. Wiederholen Sie die Normalisierung für alle geschädigten Zellen sowie für mindestens zwei ungeschädigte Kontrollzellen.

Schließlich werden die normalisierten Intensitätswerte über die Zeit grafisch dargestellt, um die Änderungen in der Rekrutierungsdynamik in Abhängigkeit von der experimentellen Behandlung zu zeigen. Zellen, die stabil XRCC1-GFP exprimieren, wurden bestrahlt und vor und nach der Schädigungsinduktion abgebildet. Die Rekrutierung von XRCC1-GFP an die Schadens-ROI wurde beobachtet und die Dynamik der Rekrutierung gemessen.

Die Bildung von Doppelstrangbrüchen wurde mit zwei Markern untersucht. Bei beiden Markern führt die zweite schwache Dosisstimulation bei 355 Nanometern fünf und zwanzig Minuten nach Bestrahlung zu keiner Reaktion und zehn Minuten nach Bestrahlung zu einer schwachen und variablen Reaktion. Die 10-Sekunden-Hochdosis-Mikrobestrahlung bei 355 Nanometern induziert fünf, zehn und zwanzig Minuten nach Bestrahlung ein erhöhtes fluoreszierendes Signal innerhalb der Schadens-ROI, das nach 40 Minuten abnimmt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Marker für DNA-Doppelstrangbrüche auf eine 355-Nanometer-Mikrobestrahlung dosisabhängig reagieren. Im Gegensatz dazu führte eine Laserstimulation mit 405 Nanometern zu einer signifikanten Anreicherung beider Marker innerhalb der Schadens-ROI, unabhängig von der applizierten Dosis. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung für 10 Zellen innerhalb von etwa vier Stunden durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Laserwellenlänge und die angelegte Leistung auf den zu überwachenden Reparaturprozess abzustimmen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um Fragen zur Rekrutierung zusätzlicher Proteine oder zu Änderungen im Phosphorylierungsstatus oder anderen posttranslationalen Modifikationen zu beantworten. Diese Technik ermöglicht es Forschenden, die dynamische Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu untersuchen und besser zu bestimmen, wie Proteinstrukturen und Mutationen die Erkennung von DNA-Schäden sowie die darauf folgende zelluläre Antwort beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop verwendet, um DNA-Schäden zu induzieren und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu überwachen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und Chemikalien wie Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Einsatz von persönlicher Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.