Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen
5. September 2017
Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Schäden in einer subnukleären Region einer Zelle mit Hilfe eines konfokalen Fluoreszenzmikroskopie-Lasers zu induzieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie Proteine an Stellen mit DNA-Schäden rekrutiert und aufbewahrt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Echtzeit-Visualisierung des interessierenden Proteins ermöglicht, so dass das Profil der Rekrutierung und Retention erstellt werden kann.
Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen Objektträger mit den interessierenden Zellen in einen Inkubator auf der Bühne legen, der bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird. Registrieren Sie Bildfelder mit einem codierten automatisierten Mikroskoptisch. Wählen Sie ein erkennbares Merkmal des Kulturgefäßes aus, z. B. die Barriere zwischen den Vertiefungen.
Erfassen Sie ein Bild und notieren Sie die X-Y-Position. Dies ermöglicht die Ausrichtung und Registrierung der X-Y-Positionen ausgewählter Felder nach der Probenvorbereitung. Sobald die Bildregistrierung abgeschlossen ist, wählen Sie ein Feld für die Mikrobestrahlung aus und fokussieren Sie die Probe.
Bei Zellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, wählen Sie die Fokalebene mit dem maximalen Kernquerschnitt im interessierenden Fluoreszenzkanal. Die Fokussierung auf den maximalen Querschnitt des Zellkerns ist von entscheidender Bedeutung, da sie sicherstellt, dass der Brennpunkt auf dem Zellkern zentriert ist, um die Rekrutierung des interessierenden Proteins an der Stelle der induzierten Schädigung zu überwachen. Wählen Sie ein klares Merkmal innerhalb des Zellkerns aus, z. B. einen Nukleolus, und verschieben Sie die Brennebene nach oben und unten, während Sie diese Veränderung des Aussehens beobachten.
Die wahre Fokusebene liegt im Übergang von hell zu dunkel. Um das Sample zu fokussieren, wählen Sie die Fokusebene aus, in der das ausgewählte Feature den schärfsten Kontrast aufweist. Der nächste Schritt besteht darin, die Position des Interessenfeldes zu registrieren.
Erstellen Sie in der Mikroskopsoftware einen drei mal drei Pixel großen quadratischen Bereich of Interest (ROI). Platzieren Sie diesen ROI über dem Kern einer Zelle, die beschädigt werden soll, und legen Sie diesen ROI auf den beschädigten ROI fest. Erfassen Sie ein Bild vor dem Schaden, einschließlich der Position des Schadens-ROI.
Erfassen Sie ein Bild mit einem hellen Feld im Fluoreszenzkanal für das interessierende Protein. Die Zellen sind nun bereit für die Laser-Mikrobestrahlung. Für diese Demonstration wird der 405-Nanometer-Laser mit 100 % Leistung verwendet.
Die Laserdosis von 405 Nanometern wird gesteuert, indem die Scanrate moduliert und ein Scan des ausgewählten Schadens-ROI durchgeführt wird. In diesem Experiment werden acht und 0,5 Bilder pro Sekunde für die Mikrobestrahlung bei 405 Nanometern verwendet. Die Auswahl der geeigneten Laserleistung für die Schädigung von Zellen ist entscheidend für die Trennung verschiedener DNA-Reparaturwege.
Führen Sie Zeitraffer-Bildaufnahmen von Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen nach Beschädigungen durch. Passen Sie die Dauer und Häufigkeit des Zeitraffers an, um die Datenerfassung zu optimieren und idealerweise die Akkumulation des fluoreszierenden Proteins zum Schadens-ROI und seine Dissoziation über den Zeitverlauf des Experiments zu erfassen. Nachdem der Zeitkurs abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Zellfeld für die Schädigung aus und setzen Sie die Mikrobestrahlung und die Zeitrafferbildgebung fort, bis die gewünschte Anzahl geschädigter Zellen erreicht ist.
Es werden 10 bis 25 Zellen pro ausgewählter Bedingung empfohlen. Um die Gesamtzellzahl für die Immunfluoreszenzanalyse zu erhöhen, schädigen Sie zusätzliche Felder innerhalb des Kulturgefäßes, um einen mehrfeldigen Zeitverlauf der Reaktion nach der Schädigung zu erzeugen. Notieren Sie die XY-Position jedes Feldes und den Zeitpunkt, zu dem der Schaden aufgetreten ist.
Zellen können sofort nach der Beschädigung repariert werden oder für ausgewählte Zeitabschnitte vor der Fixierung repariert werden. Um diese Analyse zu starten, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in einer Bildanalyseanwendung wie NIS-Elements. Generieren Sie für jede zu messende Zelle zunächst einen Referenz-ROI, der den Zellkern darstellt.
Verwenden Sie einen Schwellenwertalgorithmus für das Fluoreszenzsignal, das die Pixel enthält, aus denen der Kern besteht, und konvertieren Sie diesen Bereich dann in einen ROI. Erstellen Sie als Nächstes einen ROI von sechs x sechs Pixeln und platzieren Sie ihn über dem Schadens-ROI. Dieser größere ROI ist jetzt der Schadens-ROI für die Analyse.
Erfassen Sie für jede zu messende Zelle die mittlere Blütenintensität für die Referenz- und Schadens-ROIs. Passen Sie für jeden Frame des Zeitverlaufs den Referenz-ROI an, um sicherzustellen, dass der nukleare Bereich genau durch den ROI abgedeckt wird, und passen Sie den Schadens-ROI an, um sicherzustellen, dass die beschädigte Stelle abgedeckt ist. Zeichnen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzsignals innerhalb jedes ROI für jedes Bild des Zeitverlaufs auf.
Normalisieren Sie für jede Zelle die Fluoreszenzintensität des mittleren Schadens-ROI auf die entsprechende Referenz-ROI in jedem Frame des Zeitraffers. Hier wird die mittlere nukleare Fluoreszenzintensität als Referenz-ROI verwendet und die Normalisierung wird durchgeführt, indem die mittlere Referenz-ROI-Fluoreszenzintensität von der mittleren Schadens-ROI-Fluoreszenzintensität subtrahiert wird. Wiederholen Sie die Normalisierung für alle geschädigten Zellen sowie für mindestens zwei unbeschädigte Kontrollzellen.
Schließlich werden die normalisierten Intensitätswerte im Laufe der Zeit grafisch dargestellt, um Veränderungen in der Rekrutierungsdynamik als Funktion der experimentellen Behandlung zu zeigen. Zellen, die XRCC1-GFP stabil exprimieren, wurden vor und nach der Schädigungsinduktion bestrahlt und abgebildet. Die Rekrutierung von XRCC1-GFP zum Schadens-ROI wurde beobachtet und die Dynamik der Rekrutierung gemessen.
Die Bildung von Doppelstrangbrüchen wurde anhand von zwei Markern untersucht. Bei beiden Markern löste die zweisekündige niedrig dosierte Stimulation bei 355 Nanometern nach fünf Minuten und 20 Minuten kein Ansprechen aus und ein schwaches und variables Ansprechen 10 Minuten nach der Bestrahlung. Die 10-sekündige Hochdosis-Mikrobestrahlung bei 355 Nanometern induziert ein erhöhtes Fluoreszenzsignal innerhalb des Schadens-ROI nach fünf, 10 und 20 Minuten nach der Bestrahlung, das nach 40 Minuten reduziert wird.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Doppelstrang-Bruchmarker bei 355-Nanometer-Mikrobestrahlung dosisabhängig reagieren. Im Gegensatz dazu führte die 405-Nanometer-Laserstimulation zu einer signifikanten Akkumulation beider Marker innerhalb des Schadens-ROI, unabhängig von der applizierten Dosis. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden für 10 Zellen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Wellenlänge des Lasers und die angelegte Leistung an den zu überwachenden Reparaturprozess anzupassen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um Fragen zur Rekrutierung zusätzlicher Proteine oder zur Veränderung des Phosphorylierungsstatus oder anderer posttranslationaler Modifikationen zu beantworten. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die dynamische Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu untersuchen und besser zu bestimmen, wie Proteindomänen und Mutationen die Erkennung von und die Reaktion auf DNA-Schäden beeinflussen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwenden, um DNA-Schäden zu induzieren und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu überwachen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und Chemikalien wie Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.
Übersicht
Diese Studie verwendet konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Laser-Mikrobestrahlung, um DNA-Schäden zu induzieren und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen in Echtzeit zu beobachten. Die Techniken verbessern unser Verständnis von DNA-Schadenserkennung und Reparaturmechanismen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- DNA-Reparaturmechanismen
Hintergrund
- DNA-Schäden sind ein kritischer Faktor für die zelluläre Funktion und Integrität.
- Das Verständnis der Dynamik von DNA-Reparaturproteinen ist wesentlich für Einblicke in die genomische Stabilität.
- Konfokale Mikroskopie ermöglicht präzise Abbildung zellulärer Prozesse.
- Laser-Mikrobestrahlung bietet eine Methode zur Induktion lokaler DNA-Schäden.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Rekrutierung und Retention von DNA-Reparaturproteinen an Stellen induzierter DNA-Schäden.
- Analyse der Dynamik der Proteinantwort über die Zeit nach DNA-Schäden.
- Vergleich der Auswirkungen verschiedener Laserwellenlängen auf DNA-Reparaturwege.
Verwendete Methoden
- Zellen werden in Kammerschiebern kultiviert und in einer kontrollierten Umgebung gehalten.
- Konfokale Mikroskopie wird verwendet, um Bildfelder zu registrieren und sich auf Zellkerne zu konzentrieren.
- Laser-Mikrobestrahlung wird mit einem 405-Nanometer-Laser durchgeführt, um DNA-Schäden zu induzieren.
- Time-lapse-Bildgebung erfasst die Rekrutierung fluoreszenzmarkierter Proteine nach dem Schaden.
Hauptergebnisse
- Die Rekrutierung von XRCC1-GFP zu Schadensstellen wurde beobachtet und quantifiziert.
- Verschiedene Laserdosen lösten unterschiedliche Reaktionen in DNA-Reparaturmarkern aus.
- Time-lapse-Bildgebung offenbarte die Dynamik der Proteinakkumulation und Dissoziation.
- Die Ergebnisse zeigten eine dosisabhängige Reaktion von DNA-Reparaturmarkern auf Mikrobestrahlung.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt erfolgreich den Einsatz von konfokaler Mikroskopie und Laser-Mikrobestrahlung in der DNA-Reparaturforschung.
- Die Echtzeit-Visualisierung liefert wertvolle Einblicke in die Rekrutierungsdynamik von Reparaturproteinen.
- Diese Techniken können angewendet werden, um DNA-Reparaturmechanismen in verschiedenen Kontexten weiter zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Laser micro-irradiation combined with confocal microscopy enables precise induction and quantification of DNA strand breaks in mammalian cells, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides real-time, quantitative insights into DNA repair protein recruitment and retention, informing target validation and pathway interrogation. The method enhances predictive confidence for DNA repair targets and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment dynamics.
- Supports functional validation of DNA repair targets by quantifying recruitment and retention at damage sites.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing single- and double-strand break responses.
- Provides quantitative data for triaging DNA repair targets in discovery portfolios.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, dose-controlled DNA damage induction for assay standardization.
- Generates quantitative, time-resolved readouts of protein recruitment for screening readiness.
- Supports development of scalable assays for compound evaluation targeting DNA repair pathways.
- Enables platform reuse across different repair proteins and cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair dynamics with disease-relevant cellular contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in mammalian systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying repair kinetics and pathway engagement.
- Facilitates evaluation of protein domain mutations and post-translational modifications in repair processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analytics for DNA repair targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of DNA repair mechanisms and protein function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers time-resolved, normalized fluorescence measurements for comparative analysis of repair dynamics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling mechanistic evaluation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for diverse DNA repair research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of DNA damage and repair assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of DNA repair targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to laser-equipped confocal microscopes and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of laser dose, ROI selection, and normalization protocols.
- Adaptable to various cell models and repair proteins with appropriate optimization.
- Safety precautions are essential due to laser use and chemical fixation steps.
