Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Schäden in einer subnukleären Region einer Zelle mit Hilfe eines konfokalen Fluoreszenzmikroskopie-Lasers zu induzieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie Proteine an Stellen mit DNA-Schäden rekrutiert und aufbewahrt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Echtzeit-Visualisierung des interessierenden Proteins ermöglicht, so dass das Profil der Rekrutierung und Retention erstellt werden kann.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie einen Objektträger mit den interessierenden Zellen in einen Inkubator auf der Bühne legen, der bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird. Registrieren Sie Bildfelder mit einem codierten automatisierten Mikroskoptisch. Wählen Sie ein erkennbares Merkmal des Kulturgefäßes aus, z. B. die Barriere zwischen den Vertiefungen.

Erfassen Sie ein Bild und notieren Sie die X-Y-Position. Dies ermöglicht die Ausrichtung und Registrierung der X-Y-Positionen ausgewählter Felder nach der Probenvorbereitung. Sobald die Bildregistrierung abgeschlossen ist, wählen Sie ein Feld für die Mikrobestrahlung aus und fokussieren Sie die Probe.

Bei Zellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, wählen Sie die Fokalebene mit dem maximalen Kernquerschnitt im interessierenden Fluoreszenzkanal. Die Fokussierung auf den maximalen Querschnitt des Zellkerns ist von entscheidender Bedeutung, da sie sicherstellt, dass der Brennpunkt auf dem Zellkern zentriert ist, um die Rekrutierung des interessierenden Proteins an der Stelle der induzierten Schädigung zu überwachen. Wählen Sie ein klares Merkmal innerhalb des Zellkerns aus, z. B. einen Nukleolus, und verschieben Sie die Brennebene nach oben und unten, während Sie diese Veränderung des Aussehens beobachten.

Die wahre Fokusebene liegt im Übergang von hell zu dunkel. Um das Sample zu fokussieren, wählen Sie die Fokusebene aus, in der das ausgewählte Feature den schärfsten Kontrast aufweist. Der nächste Schritt besteht darin, die Position des Interessenfeldes zu registrieren.

Erstellen Sie in der Mikroskopsoftware einen drei mal drei Pixel großen quadratischen Bereich of Interest (ROI). Platzieren Sie diesen ROI über dem Kern einer Zelle, die beschädigt werden soll, und legen Sie diesen ROI auf den beschädigten ROI fest. Erfassen Sie ein Bild vor dem Schaden, einschließlich der Position des Schadens-ROI.

Erfassen Sie ein Bild mit einem hellen Feld im Fluoreszenzkanal für das interessierende Protein. Die Zellen sind nun bereit für die Laser-Mikrobestrahlung. Für diese Demonstration wird der 405-Nanometer-Laser mit 100 % Leistung verwendet.

Die Laserdosis von 405 Nanometern wird gesteuert, indem die Scanrate moduliert und ein Scan des ausgewählten Schadens-ROI durchgeführt wird. In diesem Experiment werden acht und 0,5 Bilder pro Sekunde für die Mikrobestrahlung bei 405 Nanometern verwendet. Die Auswahl der geeigneten Laserleistung für die Schädigung von Zellen ist entscheidend für die Trennung verschiedener DNA-Reparaturwege.

Führen Sie Zeitraffer-Bildaufnahmen von Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen nach Beschädigungen durch. Passen Sie die Dauer und Häufigkeit des Zeitraffers an, um die Datenerfassung zu optimieren und idealerweise die Akkumulation des fluoreszierenden Proteins zum Schadens-ROI und seine Dissoziation über den Zeitverlauf des Experiments zu erfassen. Nachdem der Zeitkurs abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Zellfeld für die Schädigung aus und setzen Sie die Mikrobestrahlung und die Zeitrafferbildgebung fort, bis die gewünschte Anzahl geschädigter Zellen erreicht ist.

Es werden 10 bis 25 Zellen pro ausgewählter Bedingung empfohlen. Um die Gesamtzellzahl für die Immunfluoreszenzanalyse zu erhöhen, schädigen Sie zusätzliche Felder innerhalb des Kulturgefäßes, um einen mehrfeldigen Zeitverlauf der Reaktion nach der Schädigung zu erzeugen. Notieren Sie die XY-Position jedes Feldes und den Zeitpunkt, zu dem der Schaden aufgetreten ist.

Zellen können sofort nach der Beschädigung repariert werden oder für ausgewählte Zeitabschnitte vor der Fixierung repariert werden. Um diese Analyse zu starten, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in einer Bildanalyseanwendung wie NIS-Elements. Generieren Sie für jede zu messende Zelle zunächst einen Referenz-ROI, der den Zellkern darstellt.

Verwenden Sie einen Schwellenwertalgorithmus für das Fluoreszenzsignal, das die Pixel enthält, aus denen der Kern besteht, und konvertieren Sie diesen Bereich dann in einen ROI. Erstellen Sie als Nächstes einen ROI von sechs x sechs Pixeln und platzieren Sie ihn über dem Schadens-ROI. Dieser größere ROI ist jetzt der Schadens-ROI für die Analyse.

Erfassen Sie für jede zu messende Zelle die mittlere Blütenintensität für die Referenz- und Schadens-ROIs. Passen Sie für jeden Frame des Zeitverlaufs den Referenz-ROI an, um sicherzustellen, dass der nukleare Bereich genau durch den ROI abgedeckt wird, und passen Sie den Schadens-ROI an, um sicherzustellen, dass die beschädigte Stelle abgedeckt ist. Zeichnen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzsignals innerhalb jedes ROI für jedes Bild des Zeitverlaufs auf.

Normalisieren Sie für jede Zelle die Fluoreszenzintensität des mittleren Schadens-ROI auf die entsprechende Referenz-ROI in jedem Frame des Zeitraffers. Hier wird die mittlere nukleare Fluoreszenzintensität als Referenz-ROI verwendet und die Normalisierung wird durchgeführt, indem die mittlere Referenz-ROI-Fluoreszenzintensität von der mittleren Schadens-ROI-Fluoreszenzintensität subtrahiert wird. Wiederholen Sie die Normalisierung für alle geschädigten Zellen sowie für mindestens zwei unbeschädigte Kontrollzellen.

Schließlich werden die normalisierten Intensitätswerte im Laufe der Zeit grafisch dargestellt, um Veränderungen in der Rekrutierungsdynamik als Funktion der experimentellen Behandlung zu zeigen. Zellen, die XRCC1-GFP stabil exprimieren, wurden vor und nach der Schädigungsinduktion bestrahlt und abgebildet. Die Rekrutierung von XRCC1-GFP zum Schadens-ROI wurde beobachtet und die Dynamik der Rekrutierung gemessen.

Die Bildung von Doppelstrangbrüchen wurde anhand von zwei Markern untersucht. Bei beiden Markern löste die zweisekündige niedrig dosierte Stimulation bei 355 Nanometern nach fünf Minuten und 20 Minuten kein Ansprechen aus und ein schwaches und variables Ansprechen 10 Minuten nach der Bestrahlung. Die 10-sekündige Hochdosis-Mikrobestrahlung bei 355 Nanometern induziert ein erhöhtes Fluoreszenzsignal innerhalb des Schadens-ROI nach fünf, 10 und 20 Minuten nach der Bestrahlung, das nach 40 Minuten reduziert wird.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DNA-Doppelstrang-Bruchmarker bei 355-Nanometer-Mikrobestrahlung dosisabhängig reagieren. Im Gegensatz dazu führte die 405-Nanometer-Laserstimulation zu einer signifikanten Akkumulation beider Marker innerhalb des Schadens-ROI, unabhängig von der applizierten Dosis. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Stunden für 10 Zellen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Wellenlänge des Lasers und die angelegte Leistung an den zu überwachenden Reparaturprozess anzupassen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um Fragen zur Rekrutierung zusätzlicher Proteine oder zur Veränderung des Phosphorylierungsstatus oder anderer posttranslationaler Modifikationen zu beantworten. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die dynamische Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu untersuchen und besser zu bestimmen, wie Proteindomänen und Mutationen die Erkennung von und die Reaktion auf DNA-Schäden beeinflussen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop verwenden, um DNA-Schäden zu induzieren und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu überwachen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und Chemikalien wie Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.