Name: Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie Mikro-Laserbestrahlung mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von DNA-Reparaturmechanismen in Säugerzellen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Rekrutierung von Reparaturproteinen.

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Die Autoren möchte Dr. Samuel H. Wilson an der National Institute of Environmental Health Sciences für die Zell-Linien, die in dieser Arbeit verwendet.

<ol><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+reversible+assembly+of+a+multiprotein+DNA+repair+complex+ensures+accurate+target+site+recognition+and+efficient+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair.</a> J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).</li>
<li>Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mammalian+NER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mammalian NER proteins.</a> DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).</li>
<li>Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+laser+scissors+%28microbeams%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A history of laser scissors (microbeams).</a> Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+laser+uv-microirradiation+%28lambda+%3D+2573+A%29+on+proliferation+of+Chinese+hamster+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells.</a> Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).</li>
<li>Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+laser--UV+microirradiation-induced+DNA+photolesions+by+immunofluorescent+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining.</a> Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).</li>
<li>Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+laser-UVA-microirradiation+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells.</a> J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).</li>
<li>Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependence+of+oxidative+DNA+damage+induced+by+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).</li>
<li>Kielbassa, C., Epe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+induced+by+ultraviolet+and+visible+light+and+its+wavelength+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence.</a> Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+laser+systems+to+study+cellular+responses+to+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand+breaks+and+alkali-labile+bonds+induced+by+ultraviolet+light+in+DNA+with+5-bromouracil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo.</a> Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).</li>
<li>Krasin, F., Hutchinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+from+single+photochemical+events+in+DNA+containing+5-bromouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil.</a> Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).</li>
<li>Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dye+Hoechst+33258+in+a+modification+of+the+bromodeoxyuridine+photolysis+technique+for+the+analysis+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair.</a> Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).</li>
<li>Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microirradiation+of+Chinese+hamster+cells+at+wavelength+365+nm%3A+effects+of+psoralen+and+caffeine%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine.</a> Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).</li>
<li>Limoli, C. L., Ward, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+introducing+double-strand+breaks+into+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA.</a> Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).</li>
<li>Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0739626092900178">Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy.</a> Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).</li>
<li>Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1076567008702738">Confocal Microscopy: Recent Developments.</a> Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad51+accumulation+at+sites+of+DNA+damage+and+in+postreplicative+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin.</a> J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).</li>
<li>Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactivation+of+PARP+triggers+nonhomologous+end-joining+in+repair-deficient+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts.</a> PLoS One. 7 (11), 49301(2012).</li>
<li>Bolin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cyclin-dependent+kinase+5+depletion+on+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+activity+and+responses+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation.</a> Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Godon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibition+versus+PARP-1+silencing%3A+different+outcomes+in+terms+of+single-strand+break+repair+and+radiation+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility.</a> Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).</li>
<li>Hanssen-Bauer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+coordinates+disparate+responses+and+multiprotein+repair+complexes+depending+on+the+nature+and+context+of+the+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage.</a> Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).</li>
<li>Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback-regulated+poly%28ADP-ribosyl%29ation+by+PARP-1+is+required+for+rapid+response+to+DNA+damage+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).</li>
<li>Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+regulatory+protein+recruitment+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites.</a> J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).</li>
<li>Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recruitment+of+DNA+Ligase+I+and+III+to+DNA+repair+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites.</a> Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).</li>
<li>Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+local+DNA+damage+by+visible+light+to+study+chromatin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair.</a> DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).</li>
<li>Gassman, N. R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-irradiation+tools+to+visualize+base+excision+repair+and+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair.</a> DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).</li>
<li>Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+near+infrared+femtosecond+lasers+as+sub-micron+radiation+microbeam+for+cell+DNA+damage+and+repair+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies.</a> Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).</li>
<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Front Genet. 4, 135(2013).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+Werner+protein+at+DNA+double-strand+breaks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells.</a> J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).</li>
<li>Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+oxidative+stress-induced+DNA+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+single-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">DNA single-strand break repair.</a> Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).</li>
<li>London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+XRCC1-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair.</a> DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).</li>
<li>Moser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+of+chromosomal+DNA+nicks+during+nucleotide+excision+repair+requires+XRCC1+and+DNA+ligase+III+alpha+in+a+cell-cycle-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner.</a> Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).</li>
<li>Campalans, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+spatiotemporal+patterns+and+PARP+dependence+of+XRCC1+recruitment+to+single-strand+break+and+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).</li>
<li>Cooke, M. S., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooke%2C+MS+%22Immunochemical+detection+of+oxidative+DNA+damage.+Vol.+I%22">Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I</a>. , World Scientific. 275-293 (2003).</li>
<li>Rossner, P., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+of+oxidatively+damaged+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).</li>
<li>Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).</li>
<li>Rybak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+level+phosphorylation+of+histone+H2AX+on+serine+139+%28%CE%B3H2AX%29+is+not+associated+with+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks.</a> Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).</li>
<li>Haince, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1-dependent+kinetics+of+recruitment+of+MRE11+and+NBS1+proteins+to+multiple+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites.</a> J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).</li>
<li>Caldecott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+break+repair+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-strand break repair and genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).</li>
<li>Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+aspects+of+clustered+DNA+damage+induction+by+ionising+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Prot+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation.</a> Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).</li>
<li>Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkylation+base+damage+is+converted+into+repairable+double-strand+breaks+and+complex+intermediates+in+G2+cells+lacking+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease.</a> PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).</li>
<li>Siddiqi, M. A., Bothe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-+and+double-strand+break+formation+in+DNA+irradiated+in+aqueous+solution%3A+dependence+on+dose+and+OH+radical+scavenger+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration.</a> Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).</li>
<li>Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+laser+inactivation--towards+a+spatiotemporal-functional+analysis+of+proteins%2C+and+the+ablation+of+chromatin%2C+organelle+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function.</a> J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).</li>
<li>Wojtovich, A. P., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+ROS+production%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of ROS production.</a> Redox Biol. 2, 368-376 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mit den beschriebenen Bedingungen hier, kann jede confocal Mikroskop mit einer UV-A oder 405 nm Laser, entweder vom Hersteller integriert oder durch den Endbenutzer hinzugefügt DNA-Schäden im Zellkern einer Zelle zu induzieren und erlauben die Einstellung von DNA-Reparatur-Proteine auf der Website von induzierten DNA-Schäden kontrolliert werden. Jedoch wie erwähnt im Protokoll und repräsentative Ergebnisse, Wellenlänge Auswahl angewendet macht, und Schaden Charakterisierung sind wichtige Themen, die vom Benutzer zuerst angegangen werden müssen, um eine spezifische DNA Studie Weg zu reparieren. Darüber hinaus gibt es weitere Überlegungen in experimentellen Design, das auch von Benutzern geprüft werden muss.
Um ein Protein Verhalten in lebenden Zellen Post überwachen muss Mikro-Bestrahlung, ein Eindringmittel beschrifteten Protein erstellt werden. Die Verfügbarkeit einer breiten Palette von fluoreszierenden Proteinen, die spektral getrennt werden können bietet Werkzeuge für die Erstellung von Protein-Fusionen, die verwendet werden können, für die Charakterisierung von zellulärer Reaktionen auf die Induktion von DNA-Schäden. Transiente Transfektion von fluoreszierenden Proteinen von Interesse ermöglicht schnelle Screening von schädlichen Bedingungen, Mutationen oder sogar Inhibitoren, während stabil transfizierte Zellen bieten mehr Kontrolle über Ausdruck Niveaus und ermöglichen anderen biochemischen Charakterisierungen ausgeführt werden soll, Mikro-Bestrahlung Ergebnisse validieren. Spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine können auch in der gleichen Zelle Interaktionen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Weg oder in verschiedene Wege überwachen genutzt werden. Fluoreszierende Proteine auch die Notwendigkeit spezifischer Antikörper für jedes Protein des Interesses und live Zelle überwachen Protein Verhalten für längere Zeit nach der Induktion der Schäden.
Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen hat jedoch auch Nachteile. Ohne genetische Hintergründe einen Mangel an die Aktivit‰tderzur von Interesse werden das Eindringmittel tagged Proteine körpereigene Proteine mithalten. Konjugation des fluoreszierenden Tags an den N oder C-Terminus des Proteins kann ändern, Proteinfaltung, wichtige Protein-Protein-Wechselwirkungen zu behindern oder zu blockieren Translokation Signale; Funktion zu verändern und möglicherweise Auswirkungen auf die Rekrutierung Dynamik. Diese Effekte wurden in einer Reihe von Berichten nachgewiesen, wo immunofluorescent Färbung dramatisch anders Rekrutierung und Retentionszeiten für körpereigene Proteine Schaden Seite28unter Beweis gestellt. Verwendung von transiente Transfektion oder stabile Klone kann auch die Reaktion beobachtet, in der Regel durch Variationen in Proteingehalte Ausdruck ändern. Darüber hinaus kann die Verwendung von mehreren fluoreszierende Proteine in einem einzigen Experiment auch die Dynamik der Rekrutierung, ändern wenn Proteingehalte nicht gut equilibriert sind oder Einstellung des größeren Fluoreszent-tagged Proteins die Rekrutierung anderer Proteine blockiert . Zu guter Letzt können fluoreszierende Proteine als schwache Sensibilisierung Agenten, erhöht die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und möglicherweise verändern die DNA-Schäden Mischungen induzierte46,47fungieren. Trotz dieser Nachteile bieten fluoreszierende Proteine eine Reihe von Vorteilen im Studium DNA zu reparieren, mit Mikro-Bestrahlung, und wenn Benutzer entsprechende Steuerelemente, z. B. die Schäden Charakterisierung, die hier beschrieben wird, integrieren sie bieten neue Einblicke in Schaden Reaktion und Proteinprotein Interaktionen3.
Wenn live Cell Imaging nicht erforderlich ist, kann Immunfluoreszenz verwendet werden, um die Reaktion auf induzierte Schäden zu überwachen. Durch die Festsetzung von Zellen zu bestimmten Zeiten post Schaden Induktion und Färbung mit Antikörper spezifisch für Proteine und Läsionen, statische Momentaufnahmen der Schaden Induktion und die Rekrutierung und Bindung von Reparatur, die Proteine aufgebaut werden können. Antikörper können verwendet werden, um die Rekrutierung von mehreren Proteinen Interesse und/oder post-translationalen Modifikationen durch die DNA-Schäden-Reaktion induziert zu überwachen. Verwendung von Immunfluoreszenz eliminiert die Notwendigkeit für fluoreszierende Proteine und ermöglicht eine endogene Protein Verhalten untersucht werden. Diese Methode hat jedoch auch seine Nachteile. Hochspezifische Antikörper sind notwendig und Permeabilisierung und blockierende Verfahren müssen optimiert werden, um eine Erkennung der Rekrutierung mit ausreichender Signalstärke ermöglichen. Befestigung Verfahren werden nicht sofort ausgeführt, und diese körperliche Einschränkung schränkt die zeitliche Auflösung dieses Ansatzes. Ortsbild des Schadens Induktion zuordnen, so dass Zellen nach dem färben wieder entfernt werden können, kann auch erhebliche Herausforderungen darstellen. Confocal Mikroskop, die in dieser Arbeit verwendeten ermöglicht Image-basierte Anmeldung wie oben beschrieben, also geschädigte Zellen mit hoher Präzision verlegt werden können. Wenn Bühne Registrierung oder geätzten Deckglas nicht zur Verfügung, die Zeit ist, die Investitionen beteiligt können versetzten Zellen ohne Bühne Registrierung, gepaart mit der inhärenten Verzögerung zwischen Schaden Induktion und die abgebildeten Rekrutierung Immunfluoreszenz machen. für einige Nutzer unattraktiv. Jedoch werden die genaue und vollständige Mikro-Bestrahlung experimentellen Designs derartiger Ansätze parallel mit der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen enthalten, wie in dem vorgestellten Protokoll beschrieben.
Hier wird live Cell Imaging und Immunfluoreszenz verwendet, um das Dienstprogramm von Mikro-Laserbestrahlung zu demonstrieren. Immunofluorescent Färbung ermöglicht es uns, die Mischung von DNA-Schäden erstellt genau zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteine induziert durch jede Laserleistung, die es uns, besser ermöglichen interpretieren die beobachteten Veränderungen in der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP. Basierend auf diesen Ergebnissen, sollte die Verwendung von 405 nm Laser zur Untersuchung von Proteinen, BER und SSBR beschränken. Darüber hinaus die optimale Versuchsplanung wären Leistungsmessungen nach dem Ziel, einen vollen Schaden Mischung Charakterisierung für jede Zelllinie verwendet und Validierung der Rekrutierung und Aufbewahrung in Gewebekulturen beobachtet getaggt Proteine mit Immunfluoreszenz. Offensichtlich, Ausrüstung, Zeit und Kostengründen diese optimalen experimentellen Designs nicht mehr können für einige Benutzer. Jedoch gezeigt, wie wichtig jedes dieser Elemente ist hier, und Benutzer sollten diese Überlegungen im Hinterkopf behalten, wenn Mikro-Bestrahlung Experimente ab.

Fluoreszenz-Mikroskopie ist entstanden, als eine leistungsfähige Technik zu visualisieren zellulären Architektur, Protein Lokalisierung zu prüfen und überwachen von Protein-Protein und Protein-DNA-Wechselwirkungen. Fluoreszenz-Mikroskopie, um DNA-Schäden Reaktionen nach der Anwendung des globalen DNA Beschädigung Mittel, wie ultraviolettes (UV) Licht zu studieren mit lieferte ionisierender Strahlung, chemische Oxidation oder alkylierende Vertreter und/oder Chemotherapeutika neue Einblicke in Initiierung, Signalisierung und Rekrutierung von DNA Reparatur Proteine zu Websites von DNA-Schäden1,2. Aber diese globale und asynchrone Ereignisse zu beschädigen sind begrenzt, wenn detaillierte Informationen über die Rekrutierung Ordnung, Kinetik der Assoziation und Dissoziation, und die Beziehungen zwischen den wichtigsten DNA-Reparatur-Proteine werden gesucht. Glücklicherweise, Fortschritte in der Laser-scanning-konfokale Mikroskope, breitere Verfügbarkeit von Schäden-induzierende Laserwellenlängen und Verbesserungen in fluoreszierende Proteine in den vergangenen 25 Jahren haben zur Verfügung gestellt Forscher mit verbesserten Tools für diese Prüfung Aspekte der DNA Reparatur, durch gezielte DNA-Schäden-Induktion.
Bestrahlung von Zellen mit Laser Microbeams um zellulärer und subzellulärer Funktionen zu studieren ist ein etabliertes Werkzeug in Zelle und Strahlung Biologie3. Anwendung dieser Technik auf die Untersuchung der DNA-Reparatur entstanden bei Cremer und Mitarbeiter ein hoch konzentriert UV (257 nm) Laser Microbeam System induzieren DNA-Schäden über eine 0,5 µm vor Ort in Chinese Hamster Eierstock (CHO) Zellen4 und etabliert die Induktion von DNA Photolesions durch dieses System5. Während bietet deutliche Verbesserungen gegenüber UV-Microbeam-Methoden zur Annahme dieser Zeit Schäden an System aufgrund seiner spezialisierten Einrichtung und seine Unfähigkeit, generieren beschränkte bricht Doppelstrang (DSB)6. Spätere Untersuchung einer Vielzahl von UV-B (290-320 nm) und UV-ein (320-400 nm) Wellenlängen durch eine Anzahl von Gruppen ergab, dass UV Photoproducts, oxidativen Läsionen, Basis Einzelstrang bricht (SSBs) und DSB können abhängig von der Wellenlänge des Lasers angeregt werden und 4,7,8,9,10 (rezensiert in 3) eingeschaltet. Darüber hinaus Kombinationen dieser UV-B und UV-A-Wellenlängen mit sensibilisierenden Agenten, wie Psoralen, Bromodeoxyuridine (BrdU) und Hoechst Farbstoffe, fand man auch induzieren DNA-Schädigung abhängig von der Wellenlänge, Kraft und Dauer der Exposition, wenn benötigt, die Macht zu induzieren Schaden ist oft in Anwesenheit dieser Agenten11,12,13,14,15verringert. Diese Neuerungen erweitert den Einsatz von Mikro-Bestrahlung, gäbe es noch technische Hürden für weitere Verbreitung dieser Methoden angegangen werden.
Cremer und Mitarbeiter deutlich erweiterten Bereich der Mikro-Bestrahlung durch die präzise Fokussierung der UV-Microbeam um signifikante schädliche Energie stark lokalisierte großflächig in der Zelle zu übernehmen. Wie konfokale Mikroskope und Lasersysteme ermöglichen erweiterte, war eng gebündelte Licht ganz allgemein zugänglich; Allerdings präsentierte Kupplung UV-Quellen zu Bereichen und den Umgang mit der chromatische Aberrationen, die sie noch induziert erhebliche Herausforderungen für die meisten Benutzer3,6,16. Wie UV Farbstoffe in der Popularität in den 1990er Jahren in der Lage, mit Schwerpunkt Optik stieg und gefangennehmende aufgeregt, UV Fluoreszenz zugänglicher16 wurdeVerbesserungen in der Laser-scanning-Benutzer angeboten konzentriert die Möglichkeit zur Erstellung sehr UV Erregung-Spots innerhalb Zellen6,17. Aber es war nicht bis in die frühen 2000er Jahre, dass die tatsächlichen Auswirkungen dieser Kombination von eng fokussierten Strahlen mit höherer Intensität Laser fühlte, wenn zahlreiche Berichte entstanden demonstrieren, dass DNA-Strangbrüchen mit und ohne Sensibilisatoren in ausgelöst werden könnte, die UV-A-Bereich6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, und sogar bei mehr sichtbare Wellenlängen wie 488 nm27. Diese Weiterentwicklungen für eine breitere Anwendung von Mikro-Bestrahlungstechnik auf eine Reihe von kommerziellen Systemen erlaubt. Parallel zu diesen Entwicklungen entstanden zwei-Photonen-Techniken auch, erlaubt präzise Induktion von DNA-Schäden; Obwohl diese Fortschritte hier nicht diskutiert werden, gibt es eine Reihe von Review-Artikel diskutieren diese Methoden9,28,29,30.
Mit der aktuellen Zugänglichkeit der konfokalen Mikroskopen in der Lage, hochspezialisierte UV-Licht und die weit verbreitete Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinen ermöglicht Echtzeit-Tracking der DNA-Reparatur-Proteine liefern haben zu Mikro-Bestrahlung Techniken entwickelt. leistungsstarke Tools für die Prüfung von DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur Wege. Benutzer müssen sich jedoch bewusst sein, dass die Generation der DNA-Schädigung hängt stark von der Wellenlänge des Lasers und die Kraft auf die Sub-atomaren Bereich angewendet wird. Einsatz von UV-C (~ 260 nm) Wellenlängen ermöglichen direkte DNA-Anregung und hohe Selektivität für die Induktion von UV Photoproducts7,8. UV-B und UV-A-Wellenlängen produzieren Mischungen von DNA-Schäden (Basis Läsion, SSBs und DSB), abhängig von der angewandten Kraft und zellulären Hintergrund verwendet7. Endogener Photosensitizer und Anti-Oxidationsmittel Ebenen in den gezielten Zellen können die DNA-Schäden-Mischungen produziert durch diese Wellenlängen beeinflussen. Darüber hinaus kann die Verwendung von exogenen Photosensibilisatoren (BrdU, etc.) unterstützen, senken den Energiebedarf für die Induktion von DNA-Schäden. Aber diese Agenten können DNA-Schäden induzieren, indem sich, und sie können den Zellzyklus und Chromatinstruktur verändern, damit ihre Verwendung unerwünschte Effekten führen kann, die vom Benutzer berücksichtigt werden müssen. Daher muss vor der Verwendung von Mikro-Bestrahlung, um DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur zu studieren, reiflicher Überlegung des DNA-Reparatur-Signalwegs von Interesse, die Wellenlängen zur Verfügung und die DNA-Schäden-Mischung erstellt.
Hier, Mikro-Laserbestrahlung erfolgt bei beiden häufigsten verwendeten Wellenlängen, 355 nm und 405 nm, ohne Sensibilisatoren, demonstrieren die Mischungen von DNA-Schäden durch diese Wellenlängen und die Einflüsse, die diese Schäden Mischungen haben bei der Prüfung der Reparatur der induzierteSSBs und DSB Nutzer sollten sich bewusst sein, dass diese Wellenlängen nicht zu einer einzigen Art von Strangbrüchen oder base Läsionen. Um DNA Reparatur Wege zu unterscheiden, müssen Nutzer sorgfältig die angewandte Kraft die Kontrolle über eine bestimmte Region des Kerns und charakterisieren den verursachten Schaden mit mehreren Strang Pause Markierungen und DNA-Läsion Antikörper. Wenn Sie richtig angewendet und dadurch gekennzeichnet, kann Mikro-Laserbestrahlung bereichern einige Arten von DNA-Schäden, so dass Anwender beurteilen, Reparatur von base Läsionen und SSBs oder DSB, mit einigen Besonderheiten. Daher haben wir eine Methode erlaubt Benutzern, reproduzierbar durchzuführen Mikro-Laserbestrahlung, charakterisieren die DNA-Schäden-Mischungen induziert durch die angewandte Laser-Dosis und Datenanalyse zur Verfügung gestellt.

<table><tbody><tr><td>Nikon A1rsi konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>355 nm Laser</td><td>PicoQuant VisUV</td><td></td><td>Strahlungsquelle</td></tr><tr><td>Galvanometer Photoaktivierung Miniscanner</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Objektträger Fotodiode Leistungssensor</td><td>THORLabs</td><td>S170C</td><td></td></tr><tr><td>Faser-Photodioden-Leistungssensor</td><td>THORLabs</td><td>S150C</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler tragbarer optischer Leistungs- und Energiezähler</td><td>THORLabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td></td><td></td><td>von Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS Minimales</td></tr><tr><td>essentielles Medium</td><td>Hyklon</td><td>SH3026501</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologika</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>XRCC1-GFP</td><td>Origene</td><td>RG204952</td><td></td></tr><tr><td>Jetprime</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>11407</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>ThermoFisher</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>4-Kammer-Deckglas</td><td>ThermoFisher</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>8-Kammer-Deckglas</td><td>ThermoFisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anti 53BP-1</td><td>Novus</td><td>NB100304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Phospho-Histon H2AX&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>05-636-I</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer</td><td>Cosmo Bio Klon</td><td>CAC-NM-DND-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-8-oxo-2&akut;-desoxyguanosin&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>4354-MC-050</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 Anti-Maus</td><td>ThermoFisher</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 Anti-Kaninchen</td><td>ThermoFisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>R37606</td><td>Achtung giftig!</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher</td><td>0780</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>ThermoFisher</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin (BSA)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>9311</td><td>Achtung giftig!</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td>Achtung giftig!</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>SA49</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Achtung giftig!</td></tr><tr><td>Trishydrochlorid</td><td>Amresco</td><td>O234</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung von mikro-laserbestrahlung zur prüfung von einzelnen und doppelt strand break repair in säugerzellen

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Hochgradig koordinierten DNA Reparatur Wege vorhanden sein um zu erkennen, Verbrauchsteuern und ersetzen Sie beschädigte DNA-Basen und Reparatur von DNA-Strangbrüchen zu koordinieren. Während molekularbiologische Techniken Struktur, enzymatische Funktionen und Kinetik der Reparatur-Proteine geklärt haben, gibt es noch eine Notwendigkeit zu verstehen, wie die Reparatur innerhalb des Zellkerns abgestimmt ist. Mikro-Laserbestrahlung bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Induktion von DNA-Schäden und Überwachung der Rekrutierung von Reparatur-Proteine. Induktion von DNA-Schäden durch Mikro-Laserbestrahlung kann auftreten, mit einem Bereich von Wellenlängen, und Benutzer können zuverlässig induzieren Einzelstrang Pausen, Basis Läsionen und doppelte Strangbrüchen mit einer Reihe von Dosen. Hier, Mikro-Laserbestrahlung wird verwendet, um prüfen, Reparatur von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche induziert durch zwei gemeinsame konfokale Laserwellenlängen, 355 nm und 405 nm. Weitere, richtige Charakterisierung der angewandten Dosis zur Induktion von konkreten Schaden Mischungen wird beschrieben, so dass Benutzer reproduzierbar Laser Mikro-Bestrahlung Datenerfassung und Analyse durchführen können.

Charakterisierung der induzierten DNA-Schäden Induktion von base Läsionen und Strangbrüche ist abhängig von der Laser-Dosis angewendet auf den ausgewählten nuklearen Bereich und der zellulären Mikroumgebung des Modells Zelle verwendet7. Fluoreszierende Proteine verschmolzen zu reparieren Proteine, wie XRCC1, 53BP1, Ku70 oder Rad51, bieten nützliche Single und double strand Pause Marker für die Festlegung des minimalen Energiebedarfs Ansammlung eines fluoreszierenden Proteins innerhalb eines Schadens ROI oben sehen die Hintergrund Fluoreszenz9,19,31. Wenn Bedingungen, die eine Reaktion auslösen gefunden werden, ist es entscheidend, die Schaden-Mischung induziert durch die spezifischen Wellenlänge und Dosis zu charakterisieren. Dämpfung der Dosis und Dauer auf die verwendete Wellenlänge können die Benutzer, die Bildung von komplexen Schäden Mischungen zu minimieren. Niedrige Laser Dosen im Bereich von UV-A wurden nachgewiesen, um überwiegend SSBs und eine kleine Menge an base Läsionen, geeignet für das Studium SSBR und BER Wege10,28zu produzieren. Erhöhung der Dosis schafft komplexere Basis Läsionen, oxidative und UV-induzierte und induziert mehr bedeutende Zahlen von DSB7,10. Während die Induktion von einer einzigen Art von DNA-Schäden für die Prüfung von bestimmten DNA-Reparatur wegen wünschenswert ist, ist es wahrscheinlicher, dass Benutzer eine Mischung aus DNA-Läsionen mit einer bestimmten Läsion wie SSBs wird viel häufiger als Basis Läsionen oder DSB induziert werden. Dies ist vergleichbar mit DNA-Schäden Mischungen induziert durch chemische Stoffe wie Wasserstoffperoxid (H2O2) oder Methyl Methanesulfonate (MMS)32. Benutzer müssen sich bewusst sein, wenn sie berichten, Ergebnisse, die Mischungen beschädigen können auftreten, und vorsichtig Charakterisierung der Dosis und die Läsionen am Standort induzierte Schäden notwendig sind, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
In Mikro-Bestrahlung Studien dient XRCC1-GFP oft als Marker für die Induktion von base Läsionen und SSBs9,28. XRCC1 ist ein Gerüst-Protein, das eine wichtige in SSB Reparatur (SSBR Rolle) und base Excision Reparatur (BER) und beteiligt sich auch an andere Reparatur-Wege, wie Nucleotide Excision Repair (NER)33,34,35 . Es spielt eine wichtige koordinierende Rolle DNA-Reparatur, Interaktion mit einer Reihe von wichtigen Proteinen, einschließlich poly(ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1), DNA-Polymerase β (Pol β), und DNA-Ligase III. Wir nutzten XRCC1-GFP stabil in CHO-K1-Zellen exprimiert um festzustellen, die Laser-Dosen benötigt, um SSBs und DSB zu generieren. Wir haben zunächst die minimale Dosis erforderlich, um eine beobachtbare Rekrutierung von XRCC1-GLP für jede Wellenlänge (Abbildung 1) induzieren identifiziert. Für die 355 nm Wellenlänge erzeugt eine 2 s Verweilzeit über die definierten Schäden ROI eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb dieser ROI, unter Angabe der Induktions von DNA-Schäden, die über dem Hintergrund (Abb. 1A) nachweisbar war. Für 405 nm, ein 8 Bilder pro Sekunde-Scan-Rate war nötig, um eine beobachtbare Rekrutierung auf den Schaden ROI (Abb. 1A) zu generieren. Die Dosis wurde erhöht (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) erstelle ich eine intensivere beschädigen ROI (Abb. 1A).
Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GLP auf dem Gelände der verursachte Schaden wurde dann von Timelapse Bildgebung überwacht. Bindung des Proteins an der Stelle des DNA-Schäden kann laufend DNA-Reparatur, hinweisen, während Dissoziation des Proteins von der Website der induzierten Schäden oft einen Marker für die Fertigstellung des BER oder SSBR gilt. Allerdings gab es keine eindeutigen Beweise, die Verknüpfung der Dissoziation von XRCC1 von Laser-induzierten DNA-Schäden Websites mit dem Abschluss der Reparatur. Einstellung des Proteins an den Ort der Schädigung wird gemessen durch die Berichterstattung der mittlere Intensität der das Fluoreszenzsignal innerhalb der beschädigten ROI über das mittlere Fluoreszenzsignal für den gesamten Kern (Abbildung 1B) gemessen. Diese Art von Normalisierung hilft Adresse Intensitätsschwankungen im nuklearen Signal, obwohl andere Normalisierungstechniken können, abhängig von der zelluläre Verteilung des Proteins des Interesses eingesetzt werden. Hier ist XRCC1 im nuklearen Fach lokalisiert, so Normierung auf die nuklearen Bereich die Verteilung des Signals auf den Schaden ROI misst. Die ROI bedeuten fluoreszente Intensität wird dann für jedes Bild im Zeitraffer, einschließlich das Bild vor Schäden und grafisch dargestellt als Funktion der Zeit (Abbildung 1C) aufgezeichnet.
Wir zeichnen dann weiter den Schaden induziert durch die zwei ausgewählten Laser-Dosen, die Bildung von DNA-base-Läsionen zu untersuchen. Erstens war Bildung von CPD, eine sperrige UV-induzierten Läsion durch Immunfluoreszenz als Marker für NER Typ Läsionen (Abbildung 2A) sondiert. Dann wurde die oxidativ induzierte Basis lesion8-OxodG als Marker für BER Typ Läsionen (Abbildung 2B) sondiert. Keine signifikante Zunahme der CPD Läsionen wurden bei der niedrigen Dosis Exposition für beide Wellenlängen beobachtet (2 s 355 nm und 8 Bilder pro Sekunde für 405 nm), während die hohe Dosis Behandlung bei beiden Wellenlängen (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) zeigten eine deutliche Steigerung in fluoreszierenden Signal innerhalb des Schadens ROI (Abb. 2A) beobachtet. Ein Streudiagramm der CPD ROI bedeuten Intensität für jede geschädigte Zelle zeigt Heterogenität bei Schäden Entstehung und Erkennung bei Wellenlängen und Dosen, darauf hinweist, dass ein niedriges Niveau der CPD Läsionen kann bei niedrigeren Dosen vorhanden sein, aber die Last möglicherweise nicht deutlich erkannt, bis eine höhere Dosis angewendet wird. Das Streudiagramm zeigt auch diese Ineffizienz in Antikörpernachweis, die genaue Quantifizierung der Schäden Mischungen beschränken können.
Dies wird durch die Markierung 8-OxodG bei der Erkennung von oxidativ induzierten DNA-Läsionen unterstrichen. Keine deutliche Steigerung Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden wurde ROI für 8-OxodG Laser-Wellenlänge oder verwendete Dosis (Abbildung 2B) beobachtet. Der Antikörper verwendet für diese Arbeit steht im Einklang mit früheren Veröffentlichungen9,10,36; Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass es Einschränkungen bei der Beobachtung der Bildung von 8-OxodG mit Antikörpern37,38geben kann. Bestätigung des Mangels an oxidativ induzierte Läsionen empfiehlt sich auch durch eine zweite Markierung, wie Rekrutierung von 8-Oxoguanine DNA-Glycosylase (OGG1), das Enzym zur Entfernung von 8-OxodG von der DNA-10. Wir beobachteten OGG1 Rekrutierung unserer DNA-Schäden Seiten; jedoch kann nicht die Bildung von geringen Mengen von oxidativ induzierten DNA-Schäden vollständig ausgeschlossen werden.
Zu guter Letzt haben wir untersucht die Bildung des DSB mit zwei Markierungen, γH2AX und 53BP-1, bei der passendesd Laser Dosen durch Immunfluoreszenz (Abbildung 3 &#38; 4). ΓH2AX wird häufig als Strang Pause Marker verwendet, aber seine Spezifität für DSB wurden in einer Reihe von Berichten39,40in Frage gestellt. Darüber hinaus ist es eine Phosphorylierung-Ereignis, das von der Strang Pause Website propagiert, so Lokalisierung des Signals zu einem Strang Bruch aufgrund dieser Signallaufzeiten begrenzt sein kann. Daher ermöglicht die Kombination von γH2AX mit 53BP-1 für eine genauere Beurteilung der DSB Bildung innerhalb des Schadens ROI.
Die Beantwortung von γH2AX und 53BP-1 Mikro-Bestrahlung ist Wellenlänge und dosisabhängig. Die niedrige Dosis (2 s) Stimulation bei 355 nm entlockt keine Antwort bei 5-20 min und eine schwache und Variable Antwort 10 min Post Bestrahlung(Abbildung 3)für beide Marken. Die hohe Dosis (10 s) von 355 nm Mikro-Bestrahlung induziert eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden ROI auf 5, 10 und 20 min Post Bestrahlung, die bei 40 min (Abbildung 3B) reduziert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sorgfältige Titration von 355 nm-Dosis ist erforderlich, um Kreuz-Stimulation der Reparatur Wege zu minimieren, wie gezeigt durch den reduzierten Nachweis der Doppelstrang Pause Marker γH2AX zu den frühen Zeitpunkten (&#60; 20 min) in der niedrigen Dosis angewendet.
Ähnliche Experimente wurden mit niedrig (8 Bilder pro Sekunde) und hohe Dosis (0,5 fps) 405 nm Laser Stimulation (Abbildung 4) durchgeführt. Bei dieser Wellenlänge beobachtet signifikante Häufung von Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI für 53BP-1 und γH2AX unabhängig von der angewendeten Dosis, darauf hinweist, dass diese Dosen ein komplexes Gemisch von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche fast generieren unmittelbar nach der Induktion von DNA-Schäden (Abbildung 4). Darüber hinaus erschwert die hohen Dosen von 405 nm zeigen eine Zunahme der Pan-nuklearen γH2AX Färbung innerhalb von 10 min der Schaden Induktion (Abbildung 4B, unten), die Schadenserkennung ROI zu berichten, während die 53BP-1-Ansammlung ist mehr in den Schaden ROI enthalten.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 405 nm Mikro-Bestrahlung nicht geeignet zur Überwachung von SSBR oder BER ist, und dass mehrere Marker für die DNA-Addukten und strand Pausen eingesetzt werden, sollte um die induzierte Läsionen und DNA-Reparatur Antworten vollständig zu charakterisieren.
Dosis-abhängige Änderung der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP Sobald die induzierte DNA-Schäden charakterisiert worden ist, kann Mikro-Laserbestrahlung eine ideale Plattform für die Untersuchung der Dynamik des DNA-Reparatur-Proteine werden. Die Aufbewahrung und Dissoziation Kinetik der XRCC1-GFP zeigt eine Dosisabhängigkeit (Abbildung 1), die nicht unerwartet die Induktion von verschiedene Schäden Mischungen von jeder Wellenlänge gegeben ist. Die höchste Einstrahlung Dosen (10 s und 0,5 fps) zeigen eine höhere Intensität Rekrutierung von XRCC1-GFP im Verhältnis zu den niedrigeren Dosen und längerer Verweildauer der XRCC1-GLP am Ort der Schädigung im Laufe 20 min Zeit (Abbildung 1C). Dies bedeutet, dass die DNA-Schäden, die bei höheren Dosen für 355 und 405 nm erstellt dürfte nicht gelöst, im Verlauf des Experiments, die im Einklang mit der Erscheinung und Aufrechterhaltung der DSB Marker, γH2AX und 53BP-1 (Abbildungen 3 &#38; 4 ).
Interessanterweise zeigen die niedrigeren Schaden-Dosen (2 s und 8 Bilder pro Sekunde) schnelle Rekrutierung von XRCC1-GFP zu Schaden-Websites und Dissoziation der XRCC1-GLP experimentelle Zeit Laufe vor Bestrahlung Ebenen (Abbildung 1C). Ohne die vollständige Charakterisierung der Schaden Mischung kann dies zu dem Schluss führen, dass SSBs und base Läsionen mit diesen schädlichen Bedingungen vollständig gelöst sind. Jedoch das Vorhandensein von γH2AX und 53BP-1 bei 40 min für 355 nm und 5 Minuten für die 405 nm kann zu unterschiedlichen Interpretationen führen. Für die 355 nm 2 s Dosis möglicherweise Schaden Mischung überwiegend SSBs, so dass das Aussehen der DSB-Marker bei 40 min angeben kann, dass einige unrepariert Läsionen zum DSB führen können oder dass DSB durch diese Energie erzeugt auf einer längeren Zeitskala repariert werden. Skala Zeitunterschiede zwischen SSBR und DSB-Reparatur wurden bisher gemeldeten28,41,42. In gleicher Weise 405 nm niedrigdosierte (8 Bilder pro Sekunde) Dissoziation deutet auf ein niedriges Niveau der SSBs oder Mikro-Bestrahlung und andere DNA Beschädigung Agenten schädigen ein clustering von SSBs, die schnell, DSB, umgewandelt werden, die für hohe gemerkt worden ist bisher43, 44 , 45.
Zusammen diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Charakterisierung der induzierten Schäden Mischungen und Nutzung mehrerer DNA Reparatur Proteine und Markierungen für die Interpretation der Rekrutierung und Bindung von DNA Reparatur Proteine an den Standorten des verursachten Schadens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig1.jpg"> 
Abbildung 1 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Rekrutierung von XRCC1-GFP.  (A) CHO-K1 Zellen stabil auszudrücken XRCC1-GFP wurden bestrahlt und abgebildet vor und unmittelbar nach Schaden Induktion. Pfeile zeigen die Position des Mikro-Bestrahlungsdosis und Maßstabsleiste ist 10 µm. (B) Rekrutierung wird gemessen, indem die mittlere Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI Ermittlung und Normalisierung der mittlere fluoreszierende Intensität des gesamten Kernes. (C) Dynamik der Rekrutierung kann für jedes Timelapse-Bild gemessen werden. Graphen sind Vertreter von zwei unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken repräsentieren die SEM (n = 24). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig2.jpg"> 
Abbildung 2 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Nukleotid Schaden.  CHO-K1 Zellen wurden um zu laser-Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und sofort nach Induktion der Schaden behoben. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um die CPD erkennen und 8-OxodG Addukte. (A) oben, Streudiagramm der ROI bedeuten Fluoreszenz Intensität beobachten geschädigte Zellen nach der CPD Färbung. Unten, repräsentative Bilder der CPD Färbung. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm (n = 12). (B) repräsentative Bilder für 8-OxodG Färbung. PfeileGeben Sie die Position der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig3.jpg"> 
Abbildung 3 . DNA-Doppelstrang Pause Markern reagieren auf 355 nm Mikro-Bestrahlung in einer Dosis-abhängigen Weise.  CHO-K1-Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und auf die Zeit Punkte angegebene Post-Stimulation. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1 wurde durchgeführt. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56265/56265fig4.jpg"> 
Abbildung 4. DNA-Doppelstrang Pause Markern robust auf 405 nm Mikro-Bestrahlung reagieren. CHO-K1 Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und die Zeit Punkte angegebenen Post Stimulation festgesetzt. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56265/56265fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines konfokalen fluoreszierenden Mikroskopielasers eine DNA-Schädigung in einem subnukleären Bereich einer Zelle hervorzurufen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der DNA-Reparatur zu beantworten, beispielsweise wie Proteine an Stellen von DNA-Schäden rekrutiert und dort festgehalten werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Echtzeit-Visualisierung des Proteins von Interesse ermöglicht wird, sodass ein Profil der Rekrutierung und Retention erstellt werden kann.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Kammerobjektträger mit den Zellen von Interesse in einen Inkubator für den Mikroskoptisch stellen, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Registrieren Sie die Bildfelder mithilfe eines codierten, automatisierten Mikroskoptisches. Wählen Sie ein erkennbares Merkmal des Kulturgefäßes, wie beispielsweise die Trennwand zwischen den Vertiefungen.Sammeln Sie ein Bild und notieren Sie die X-Y-Position. Dies ermöglicht die Ausrichtung und Registrierung der X-Y-Positionen ausgewählter Felder nach der Probenvorbereitung. Sobald die Bildregistrierung abgeschlossen ist, wählen Sie ein Feld für die Mikrobestrahlung aus und fokussieren Sie die Probe.Bei Zellen, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, wählen Sie die Fokusebene mit dem maximalen nukleären Querschnitt im gewünschten fluoreszierenden Kanal aus. Die Fokussierung auf den maximalen Querschnitt des Zellkerns ist entscheidend, da sie sicherstellt, dass der Fokuspunkt zentral auf dem Kern liegt, um die Rekrutierung des Proteins von Interesse an der Stelle der induzierten Schädigung zu überwachen. Wählen Sie eine deutliche Struktur innerhalb des Zellkerns, beispielsweise den Nukleolus, und bewegen Sie die Fokusebene nach oben und unten, während Sie die Veränderung im Erscheinungsbild beobachten.Die wahre Fokusebene liegt innerhalb des Übergangs von hell zu dunkel. Um die Probe zu fokussieren, wählen Sie die Fokusebene aus, in der das ausgewählte Merkmal den schärfsten Kontrast aufweist. Der nächste Schritt besteht darin, die Position des interessierenden Bereichs zu registrieren.Erstellen Sie im Mikroskopie-Software eine dreimal-dreipixelgroße quadratische Region of Interest (ROI). Platzieren Sie diese ROI über dem Kern einer Zelle, die beschädigt werden soll, und definieren Sie diese ROI als Schadens-ROI. Erfassen Sie ein Bild vor der Schädigung, das die Position der Schadens-ROI enthält.Eine Aufnahme mit Hellfeld im Fluoreszenzkanal für das Protein von Interesse aufnehmen. Die Zellen sind nun bereit für die Laser-Mikrobestrahlung. Für diese Demonstration wird der 405-Nanometer-Laser mit 100 % Leistung verwendet.Die Dosis des 405-Nanometer-Lasers wird durch die Modulation der Abtastrate gesteuert, wobei ein Scan des ausgewählten Schadens-Bereichs (ROI) durchgeführt wird. Verwenden Sie in diesem Experiment acht bzw. 0,5 Bilder pro Sekunde für die Mikrobestrahlung bei 405 Nanometern. Die Auswahl der geeigneten Laserleistung zum Beschädigen der Zellen ist entscheidend, um verschiedene DNA-Reparaturwege voneinander zu unterscheiden.Führen Sie die zeitraffende Bildaufnahme von Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen nach der Schädigung durch. Passen Sie Dauer und Frequenz der Zeitraffelaufnahme an, um die Datenerfassung zu optimieren, wobei idealerweise die Anreicherung des fluoreszierenden Proteins am schadhaften ROI und dessen Dissoziation im Verlauf des Experiments erfasst wird. Nach Abschluss des Zeitverlaufs wählen Sie ein neues Zellfeld für die Schädigung aus und setzen die Mikrobestrahlung und die zeitraffende Bildaufnahme fort, bis die gewünschte Anzahl geschädigter Zellen erreicht ist.Für jede ausgewählte Bedingung werden 10 bis 25 Zellen empfohlen. Um die Gesamtanzahl der Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse zu erhöhen, beschädigen Sie zusätzliche Felder innerhalb des Kulturgefäßes, um einen mehrfeldrigen Zeitverlauf der Reaktion nach der Schädigung zu erzeugen. Notieren Sie den X-Y-Standort jedes Feldes sowie den Zeitpunkt, zu dem die Schädigung erfolgte.Die Zellen können unmittelbar nach der Schädigung fixiert werden oder für ausgewählte Zeitspannen zur Reparatur freigegeben werden, bevor die Fixierung erfolgt. Um diese Analyse zu beginnen, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in einer Bildanalyse-Software wie NIS-Elements. Erstellen Sie für jede zu vermessende Zelle zunächst eine Referenz-ROI, die den Zellkern darstellt.Wenden Sie einen Schwellenwertalgorithmus auf das Fluoreszenzsignal an, das die Pixel des Zellkerns umfasst, und wandeln Sie diesen Bereich anschließend in eine ROI um. Erstellen Sie danach eine sechs mal sechs Pixel große ROI und platzieren Sie sie über der Schadens-ROI. Diese größere ROI ist nun die Schadens-ROI für die Analyse.Notieren Sie für jede zu messende Zelle die mittlere Fluoreszenzintensität für die Referenz- und Schadens-ROIs. Passen Sie für jeden Frame der Zeitreihe die Referenz-ROI an, um sicherzustellen, dass der Kernbereich genau durch die ROI abgedeckt ist, und passen Sie die Schadens-ROI an, um sicherzustellen, dass die Schadensstelle abgedeckt ist. Notieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des fluoreszierenden Signals innerhalb jeder ROI für jeden Frame der Zeitreihe.Normalisieren Sie für jede Zelle die mittlere Fluoreszenzintensität des Schadens-ROI bezüglich der entsprechenden Referenz-ROI in jedem Frame der Zeitrafferaufnahme. Hier wird die mittlere nukleäre Fluoreszenzintensität als Referenz-ROI verwendet, und die Normalisierung erfolgt durch Subtraktion der mittleren Fluoreszenzintensität des Referenz-ROI von der mittleren Fluoreszenzintensität des Schadens-ROI. Wiederholen Sie die Normalisierung für alle geschädigten Zellen sowie für mindestens zwei ungeschädigte Kontrollzellen.Schließlich werden die normalisierten Intensitätswerte über die Zeit grafisch dargestellt, um die Änderungen in der Rekrutierungsdynamik in Abhängigkeit von der experimentellen Behandlung zu zeigen. Zellen, die stabil XRCC1-GFP exprimieren, wurden bestrahlt und vor und nach der Schädigungsinduktion abgebildet. Die Rekrutierung von XRCC1-GFP an die Schadens-ROI wurde beobachtet und die Dynamik der Rekrutierung gemessen.Die Bildung von Doppelstrangbrüchen wurde mit zwei Markern untersucht. Bei beiden Markern führt die zweite schwache Dosisstimulation bei 355 Nanometern fünf und zwanzig Minuten nach Bestrahlung zu keiner Reaktion und zehn Minuten nach Bestrahlung zu einer schwachen und variablen Reaktion. Die 10-Sekunden-Hochdosis-Mikrobestrahlung bei 355 Nanometern induziert fünf, zehn und zwanzig Minuten nach Bestrahlung ein erhöhtes fluoreszierendes Signal innerhalb der Schadens-ROI, das nach 40 Minuten abnimmt.Diese Ergebnisse zeigen, dass die Marker für DNA-Doppelstrangbrüche auf eine 355-Nanometer-Mikrobestrahlung dosisabhängig reagieren. Im Gegensatz dazu führte eine Laserstimulation mit 405 Nanometern zu einer signifikanten Anreicherung beider Marker innerhalb der Schadens-ROI, unabhängig von der applizierten Dosis. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung für 10 Zellen innerhalb von etwa vier Stunden durchgeführt werden.Bei der Durchführung dieser Technik ist es wichtig, die Laserwellenlänge und die angelegte Leistung auf den zu überwachenden Reparaturprozess abzustimmen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um Fragen zur Rekrutierung zusätzlicher Proteine oder zu Änderungen im Phosphorylierungsstatus oder anderen posttranslationalen Modifikationen zu beantworten. Diese Technik ermöglicht es Forschenden, die dynamische Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu untersuchen und besser zu bestimmen, wie Proteinstrukturen und Mutationen die Erkennung von DNA-Schäden sowie die darauf folgende zelluläre Antwort beeinflussen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop verwendet, um DNA-Schäden zu induzieren und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen zu überwachen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und Chemikalien wie Formaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Einsatz von persönlicher Schutzausrüstung, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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