Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

In diesem Videoprotokoll wird eine Methode zur Messung der Effizienz und Genauigkeit der DNA-Doppelstrang-Bremsreparatur durch NHEJ oder HR in einer Säugetierzelllinie demonstriert. Das Verfahren beginnt mit der Erzeugung einer Zelllinie, die eine chromosomal integrierte Einzelkopie der NHEJ- oder HR-Reporterkassette enthält. Diese Reporterzellen werden dann mit einer Mischung aus I, SCE, einem exprimierenden Plasmid und DS rotem Plasmid und einem Plasmid transfiziert.

Ich sce. Eine Endonuklease erzeugt einen Doppelstrangbruch im Reporterkonstrukt und DS RED dient als Transfektionskontrolle. Der prozentuale Anteil der GFP-positiven und der roten DS-Zellen wird dann per Fax analysiert, um die Effizienz von NHEJ oder HR auf Wunsch zu quantifizieren.

Die Genauigkeit der Reparatur wird analysiert, indem die Reporterprodukte in E. coli gerettet und die Reparaturprodukte sequenziert werden. Auf diese Weise wird die Effizienz und Genauigkeit des Dublettenstrangbruchs oder der DSB-Reparatur in einer gegebenen Zelllinie auf der Grundlage der durchflusszytometrischen Quantifizierung von Reparaturereignissen und der Sequenzierung der Reparaturprodukte bestimmt. Diese Methode hat viele Vorteile gegenüber den bestehenden Methoden zur Analyse der Reparatur von Doppelstrangbremsen.

Zunächst wird bei dieser Methode spezifisch zwischen einer homologen Rekombination und einer nicht-homologen und Fügemethode unterschieden. Dann ist die Methode hochgradig quantitativ, was die Analyse von Millionen von Zellen durch Durchflusszytometrie ermöglicht, und dann erfordert die Methode keine umfangreiche Verpackung von Zellen nach Abschluss der Reparatur für die Selektion von antibiotikaresistenten Cls. Und schließlich kann der Abschluss der Reparatur in Echtzeit überwacht werden, indem das Aussehen der grünen Zellen betrachtet wird.

Und diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Reparatur zu beantworten, wie z. B. die Messung der HR- und einer HEGA-Reparatureffizienz in virusmutierten Zelltypen oder die nach medikamentösen Behandlungen. Untersuchen Sie die A-Reparatur in verschiedenen Stadien des Zellzyklus und messen Sie die Reparaturrate So allgemein. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es wichtig ist, eine gute Transfektionseffizienz zu erreichen.

In diesem Verfahren. Zwei Reporterkassetten werden verwendet, um die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen zu untersuchen. Eine Kassette wird verwendet, um nicht-homologe Endverbindungen oder N-H-E-J-D-N-A-Reparaturen zu untersuchen.

Die andere wird verwendet, um die homologe Rekombination oder HR-DNA-Reparatur des nicht-homologen Endes zu untersuchen. Die verbindende Reporterkassette enthält ein GFP-Gen mit einem modifizierten Intron mit drei Kilobasen, das aus dem PEM-One-Gen oder dem GFP-PEM-Gen hergestellt wurde. Kurz gesagt, das P one Intro enthält ein adenovirales Exon, flankiert von Erkennungssequenzen für Hindi drei und I SCE eine Endonuklease zur Induktion von doppelsträngigen Brüchen.

Die I SCE one Stellen sind eine invertierte Orientierung I SCE one hat eine nicht-palindromische Erkennungssequenz, daher erzeugen zwei invertierte Stellen inkompatibel. DNA-Enden inkompatibel. DNA-Enden ahmen am besten das natürlich vorkommende dss nach.

Eine ungeordnete NAEJ-Kassette ist GFP-negativ, da das adenovirale Exon das G-F-P-O-R-F stört. Bei Induktion von doppelsträngigen DNA-Brüchen durch ISEE one wird das adenovirale Exon entfernt und NHEJ stellt die Funktion des GFP-Gens wieder her. Die homologe Rekombinationsreporterkassette basiert ebenfalls auf dem GFP PEM one Konstrukt in der HR-Kassette.

Das erste Exon des G FP PEM one enthält eine Deletion von 22 Basenpaaren in Kombination mit der Insertion von drei Restriktionsstellen. I SCE one Hindi drei I SCE E one. Die Löschung stellt sicher, dass GFP auch hier nicht durch ein NHEJ-Ereignis rekonstituiert werden kann.

Die I SCE one-Standorte sind umgekehrt ausgerichtet. Die I SCE eine Verdauung hinterlässt also unvereinbare Enden. Auf die erste Kopie von GFP PMM folgt ein Promotor abzüglich eines TG, abzüglich des ersten Exons und des Intros von GFP M1. Das intakte Konstrukt ist GFP-negativ, wenn ein Doppelstrangbruch durch einen Aufschluss induziert wird.

Das funktionelle GFP-Gen wird durch ein Genkonversionsereignis zwischen den beiden mutierten Kopien des ersten GFP-PMM rekonstituiert, ein Exon, andere Arten der DSB-Reparatur, wie z.B. die Kreuzung über einzelsträngiges Knien. Und NHEJ wird das GFP-Gen nicht rekonstituieren. Da die zweite Kopie des GFP-Gens fehlt.

Das erste A TG-Codon und die zweite Exon-Auflösung durch Kreuzung oder einzelsträngiges Knien stellen die GFP-Aktivität nicht wieder her. Dieses Design ermöglicht daher den ausschließlichen Nachweis der Auflösung durch Genkonversion, die der vorherrschende HR-Signalweg in Säugetierzellen ist. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, verwenden Sie das endofreie Kit von Kyogen, um einen hochwertigen Vorrat an NHEJ- oder HR-Reporterplasmid herzustellen, 10 Mikrogramm des Plasmids zu linearisieren und die DNA aus der Verdauungslösung zu reinigen.

Weitere Informationen zur Plasmidvorbereitung finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Zur Vorbereitung auf die Transfektion. Stellen Sie sicher, dass normale menschliche Fibroblasten unter den besten Wachstumsbedingungen erhalten bleiben.

Wenn Sie mit einem gefrorenen Fläschchen beginnen, teilen Sie die Zellen vor der Transfektion zweimal. Wenn man von einer Platte mit Konfluenzzellen ausgeht, teilen sich die Zellen einmal auf, wachsen die Zellen auf 70 bis 80% Konfluenz. Das dauert etwa zwei Tage, wenn fünf mal 10 bis fünfte Zellen in einer 100-Millimeter-Platte plattiert werden.

Für eine optimale Transfektionseffizienz bringen Sie die Zellen in logarithmisches Wachstum. Eine aktiv wachsende Kultur enthält Zellen im M-Stadium, die als abgerundete Zellen gesehen werden, die an der Oberfläche für die Transfektion befestigt sind, und etwa zwei mal 10 der sechs Zellen aus zwei 100-Millimeter-Platten ernten. Es ist wichtig, nicht zu viel Trypsin zu verwenden, da die Zellen mit Trypsin aufhören, sobald sich 80% der Zellen von der Platte gelöst haben.

Suspendieren Sie die Zellen erneut in NHDF-Lösung. Da die Zellen empfindlich auf NHDF-Lösung reagieren, minimieren Sie die Inkubationszeit und mischen Sie die Zellen vorsichtig. Als nächstes verwenden Sie den Amaxa-Nukleo-Effektor, um die Zellen mit 0,5 Mikrogramm linearisiertem Reporterkonstrukt für normale menschliche Fibroblasten zu transfizieren.

Diese Transfektionsbedingungen führen zur Integration einer einzelnen Kopie eines Reporterkonstrukts für den Großteil der integren 24 Stunden nach der Transfektion bei einem Milligramm pro Milliliter genetischer oder G vier 18. Um die Zellen mit chromosomal integrierten Reporterkonstrukten auszuwählen, setzen Sie die Selektion sieben bis 10 Tage lang fort und wählen Sie dann entweder einzelne G 4 1 8 resistente Kolonien aus oder legen Sie die resistenten Klone zusammen. Erweitern Sie die Kultur auf ca. fünf 100-Millimeter-Platten.

Frieren Sie drei Platten für die zukünftige Verwendung ein und erweitern Sie die verbleibenden zwei Platten auf fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro 100-Millimeter-Platte. Zehn 100-Millimeter-Platten reichen in der Regel für fünf Transfekten. Zwei Tage nach der Plattierung, als die Zellen, die das Reporterkonstrukt enthielten, eine Konfluenz von 70 bis 80 % mit einer Mischung aus fünf Mikrogramm I sce erreichten, von denen eines das Plasmid exprimierte, und 0,1 Mikrogramm des roten DS-Plasmids.

Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz transfizieren Sie mit dem AM maxon Nukleoeffektor etwa zwei mal 10 der sechs Zellen aus einer logarithmisch wachsenden Kultur. Da die DSP-Effizienz als Verhältnis von GFP-positiven zu DS-roten positiven Zellen gemessen wird, können Variationen in der Mischung von ISCE-Eins und DS-Rotplasmid die Ergebnisse beeinflussen. Die Plasmidqualität kann sich auch auf die Ergebnisse auswirken, indem sie die Transfektionseffizienz verändert.

Um konsistente Messungen zu erhalten, ist es daher wichtig, die gleiche Plasmidmischung innerhalb eines Experiments zu verwenden. Bereiten Sie gleichzeitig drei Kalibrierungskontrollen für jede Kontrolle vor. Transfizieren Sie etwa zwei mal 10 der sechs Zellen. Bei den drei Kontrollen handelt es sich um fünf Mikrogramm EGFP-exprimierendes Plasmid, fünf Mikrogramm DS, rotes Plasmid und fünf Mikrogramm.

Ein Kontrollplasmid, das kein fluoreszierendes Protein exprimiert. Drei Tage nach der Transfektion ist die Wirksamkeit der Transfektion und Expression von GFP- und DS-Rotproteinen durch ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit Filtern zum Nachweis von GFP und DS zu überprüfen. Rot wachsen die Zellen für einen zusätzlichen Tag vor der Faxanalyse, vier Tage nach der Transfektion ernten Sie die I SCE one transfizierten Zellen und die Kontrollzellen. In diesem Stadium ist es entscheidend, alle Zellen zu ernten und Zellen mit runder Form zu haben.

Um dies zu erreichen, verwenden Sie eine längere Trypsinisierungszeit oder eine höhere Trypsinkonzentration. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass 99 % der Zellen von der Platte gelöst sind und eine runde Form haben. Suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie sie auf Faxröhren.

Halten Sie die Zellen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht, während es möglich ist, die Zellen einige Stunden auf Eis zu lagern. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Zellen unmittelbar nach der Ernte. Kalibrieren Sie anschließend die Fakten mit TFP DS RED und den Negativkontrollen.

Passen Sie die Spannungs- und Farbkompensation an, um alle Fluoreszenzzellen in die Analyse einzubeziehen. Beachten Sie, dass die Fluoreszenzintensität der experimentellen Proben geringer ist als die der Kontrollen. Nach der Kalibrierung der Fakten mit den Kontrollen wird die Zählung der transfizierten Zellen von I SCE one bei jeder Behandlung mit mindestens 20.000 Zellen durchgeführt, um eine mögliche Interferenz zwischen GFP und ds zu vermeiden.

Die rote Fluoreszenz hält den Anteil der GFP-positiven oder DS-roten Zellen unter 25 %Wenn der Prozentsatz höher ist, reduzieren Sie die Menge an DS RED oder I sce E ein Plasmid. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen entspricht der Effizienz der D-N-A-D-S-P-Reparatur und der Prozentsatz der roten DS-positiven Zellen gibt die Effizienz der Transfektion an. Berechnen Sie die relative Effizienz der D-N-A-D-S-P-Reparatur als Verhältnis von GFP-positiven Zellen zu roten DS-positiven Zellen.

Um die Genauigkeit der reparierten Verfügungen zu bestimmen, retten Sie die Reporterkonstrukte, indem Sie genomische DNA mit eco R one Enzym-Zirkularisierung und Umwandlung in kompetente E-Coli-Zellen verdauen. Diese Rettung ist möglich, da die ursprünglichen Konstrukte einen bakteriellen Replikationsursprung enthalten, der durch Restriktion, Verdauung und Sequenzierung analysiert wird. Dies sind typische Fakten, Ergebnisse der Kontrolldurchschnitte und von NHEJ- und HR-Experimenten.

Die Fluoreszenzintensität und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen sind bei den I SCE one transfizierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen geringer. Der Unterschied im Fluoreszenzsignal ist auf den Unterschied in der Kopienzahl der GFP- und DS RED-Konstrukte in diesen Zellen zurückzuführen. Jede Zelle im Experiment enthält eine Kopie des integrierten Reporterkonstrukts.

Erfolgreiche Reparaturereignisse rekonstituieren also das GFP-Gen in einem Teil der Zellen. Die Effizienz von NHEJ und HR wird als Verhältnis von GFP-positiven zu DS-roten positiven Zellen berechnet. NHEA ist ein effizienterer Prozess als HR in menschlichen Zellen, in menschlichen Fibroblasten liegt die NHEJ-Effizienz typischerweise bei 0,6 bis 1,3 und die HR-Effizienz bei 0,05 bis 0,3.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der DNA-Reparatur, um die Rolle verschiedener Faktoren bei HEG und HR zu erforschen und die Kinetik und Regulation von NHEG und HR in Säugetierzellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Effizienz und Genauigkeit von HR und GJ in Säugetierzellen mit einem Fluoreszenz-Assay messen können.