Der Transwell-Migration-Assay
Migration von Zellen als Reaktion auf chemische Signale ist entscheidend für Entwicklung, Immunität und Krankheit Staaten wie zum Beispiel Krebs. Quan…
Die Transwell-Migration-Assay ist eine klassische Technik, die Wissenschaftler, Zelle Bewegung zu quantifizieren können. Migration bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, einzeln oder in Büscheln zu bewegen. Zellbewegungen werden ermöglicht durch präzise Umstrukturierung ihrer Zytoskelett und Migration tritt in der Regel als Reaktion auf Reize, die als Hinweise dienen.
Heute besprechen wir die Transwell-Migration-Assay, die was nutzt eine einfache Kammer-Setup aus, um Migration als Reaktion auf Anziehung Hinweise zu beurteilen.
Wir werden zunächst einige Hintergrundinformationen über die Transwell Kammer.
Das Gerät wurde zuerst von Dr. Stephen Boyden 1961 entworfen, die es verwendet, um die Migration der Leukozyten zu studieren. Daher ist diese Methode auch bekannt als der Boyden Kammer Assay.
In einer einfachen Boyden Kammer ist die Außenwand der Brunnen, wie die von einer 96-Well-Platte. In jede Vertiefung ist eine Transwell, die einen zylindrischen Einsatz ist, platziert. Die Einlage hat eine Polycarbonat-Membran eines definierten Porengröße. Wenn in den Brunnen platziert, unterteilt die Kammer in zwei Fächer. Das obere Fach ist, wo dessen Wanderungsverhalten ist zu untersuchenden Zellen werden ausgesät, und der untere Stausee ist wo die Lösung des Lockstoffgradient platziert wird. Per Definition ist ein Lockstoffgradient ein Molekül, das die Fähigkeit hat, Zelle Motilität zu fördern, durch die "Gewinnung von Zellen."
Durch diese Anziehungskräfte wandern Zellen im oberen Fach durch die Poren in den unteren Behälter. Wenn die Zellen anhaftende Eigenschaften, wie einige Melanomzellen, nach Bewegung werden sie "an der Unterseite der Membran kleben". In diesem Fall kann die Membran befestigt werden, gebeizt, und Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden können. Auf der anderen Seite werden in den unteren Behälter nicht anhaftende Zellen, wie Spermien, migrieren. In diesem Fall können Zellen in das Reservoir-Lösung mit Hilfe von einem Hemocytometer gezählt werden.
Obwohl das Setup für diese Test einfach ist, gibt es mehrere Dinge, die Sie vor dem Experiment beachten müssen. Betrachten wir einige von ihnen.
Beginnend mit der Aussaat Lösung, müssen Sie sicherstellen, dass die Dichte optimiert um Zellwanderung zu beobachten ist. Zu wenige Zellen nicht nachweisbar Migration führen können, und größere Dichte werden die Membran, erschwert das Auflisten von Migration übervölkern. Die zweite Überlegung ist die Porengröße des Einsatzes. Es sollte sorgfältig gewählt werden, je nach Zelltyp. Wenn die Porengröße zu klein ist, werden Zellen durchlaufen.
Alternativ, wenn die Poren zu groß ist, werden Zellen nur durch, fallen die ist keine Migration. Zu guter Letzt muss achten, die Lockstoffgradient-Konzentration und die Inkubationszeit für Migration erlaubt sein wie diese voneinander abhängig sind. Optimale Konzentration mit geeigneten Inkubationszeit bei dem Konzentrationsgefälle zwischen den Abteilen beibehalten wird induziert Zellwanderung durch die Chemo-Attraktion. Umgekehrt können längere Inkubationen begleitet werden, durch ein Gleichgewicht der Lockstoffgradient in der Kammer, die zum Verlust des chemischen Gradienten, die die Analyse der erzielten Ergebnisse verwirren kann.
Mit diesen Überlegungen im Auge sprechen wir über ein Protokoll zur Messung der Migration von adhärenten Zellen.
Zellen untersucht werden sind in einem Protease-freies Medium bereit, da Proteasen können wichtige Membranrezeptoren denaturieren und letztlich Migration beeinflussen. Nachdem Zellen vorbereitet sind, sollten die Aussetzung zu einer optimalen Aussaatdichte verdünnt werden. Um die Kammer vorzubereiten, werden Transwells in Brunnen auf einem multiwell Teller gelegt. Zellsuspension sollte in die Transwell pipettiert werden, ohne die Membran zu berühren oder die Einführung von Luftblasen.
Lockstoffgradient Lösung ist in den unteren Behälter dafür, dass die Lösung die Membran des Einsatzes berührt pipettiert. Die Inkubationszeit für die Migration wird von den experimentellen Erwägungen abhängen. Nach Inkubation werden die Membranen durch Eintauchen des Einsatzes in 70 % igem Ethanol fixiert. Nach Abzug des Einsatzes zu trocknen, wird die Zelle Färbelösung hinzugefügt.
Als nächstes werden Zellen für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation werden die Einsätze mit Hilfe von Waschpuffer gewaschen. Schließlich kann die Membran ausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt. Zellen auf der Unterseite der Membran stehen für die Anzahl der Zellen, die in der Gegenwart migriert haben und fehlender Chemoattractants.
Denn jetzt Sie ein Gefühl für das Protokoll haben, werfen wir einen kurzen Blick auf wie Forscher diese Methode in ihre Entdeckungen verwenden.
Die häufigsten Anwendungen des Assays gehört zu Lockstoffgradient Eigenschaften von unbekannten Substanzen zu bewerten. Hier interessierte Wissenschaftler untersuchen schwimmen wegen der Frosch Spermien in Anwesenheit von allurin, eine Substanz abgesondert von Amphibien Eiern. Um dies zu tun, pipettieren sie zuerst aktiv Frosch Spermien an die Spitze der Transwell Einsätze. Am Ende hinzugefügt sie allurin. Nach Abzug der Zellen migrieren, zählte sie Sperma in das Reservoir-Lösung unter dem Mikroskop. Mit dieser Technik konnten sie eine Konzentration-Wirkungs-Kurve zeigt die Wirkung der allurin Konzentration auf Sperma Migration zu erzeugen.
Wenn eine Zelle durch Krankheitserreger angegriffen wird, sendet er Chemoattractants Immunzellen zu rekrutieren, die migrieren, befestigen und anschließend beheben Infektion. Um dieses Phänomen zu testen, diese Wissenschaftler kultivierten Epithelzellen auf der Unterseite der Einsätze. Anschließend infiziert sie diese Zellen mit verschiedenen Bakterienstämme. Schließlich führte sie Immunzellen in die obere Kammer. Es ist bekannt, dass die infizierten Zellen mehrere Chemoattractants zu produzieren, die Migration von Immunzellen zu induzieren. Ergebnisse dieses Experiments zeigten unterschiedliche Grade der Neutrophilen Migration als Reaktion auf verschiedene Arten der bakteriellen Infektion.
Zu guter Letzt Krebs Zelle Invasion und Metastasierung durch die extrazelluläre Matrix hat schon immer fasziniert Zellbiologen. Hier wollte Wissenschaftler feststellen, wie bestimmte Chemoattractants können dazu beitragen, eine solche Migration durch eine 3D Matrix. Sie gentechnisch zwei separate Pools von Zellen: eine grüne fluoreszierende, zum Ausdruck zu bringen und ein anderes rot fluoreszierende, Protein. Sie pipettiert dann eine extrazelluläre Matrix-Mimic an die Spitze der Transwells.
Sobald erstarrt, sie invertiert die Transwell und zwei Pools der Zellen an der Unterseite der Membran ausgesät. Als nächstes sie ersetzt die Einlage in die multiwell Platte und die Lockstoffgradient-Lösung in die obere Kammer pipettiert. Dies verursacht die Zellen an der Unterseite und durch die 3D Matrix bewegen. Mit Hilfe der konfokalen Bildgebung diese Forscher Zellwanderung in 3D rekonstruiert, und die Migrationsmuster von zwei Gruppen von Zellen zu unterscheiden.
Sie haben genau beobachtete sich Jupiter Transwell Migration Test video an. Mit dem Verständnis der Komponenten und das Protokoll dieser Methode wissen Sie jetzt, warum es so weit von Zellbiologen verwendet wird. Trotz der Einfachheit dieser Einrichtung macht die Auswahl an Konfigurationen, die diese Methode anpassen kann es unverzichtbar für Zelle Motilität Studien. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Die Transwell-Migration-Assay ist eine klassische Technik, die Wissenschaftler, Zelle Bewegung zu quantifizieren können. Migration bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, einzeln oder in Büscheln zu bewegen. Zellbewegungen werden ermöglicht durch präzise Umstrukturierung ihrer Zytoskelett und Migration tritt in der Regel als Reaktion auf Reize, die als Hinweise dienen.
Heute besprechen wir die Transwell-Migration-Assay, die was nutzt eine einfache Kammer-Setup aus, um Migration als Reaktion auf Anziehung Hinweise zu beurteilen.
Wir werden zunächst einige Hintergrundinformationen über die Transwell Kammer.
Das Gerät wurde zuerst von Dr. Stephen Boyden 1961 entworfen, die es verwendet, um die Migration der Leukozyten zu studieren. Daher ist diese Methode auch bekannt als der Boyden Kammer Assay.
In einer einfachen Boyden Kammer ist die Außenwand der Brunnen, wie die von einer 96-Well-Platte. In jede Vertiefung ist eine Transwell, die einen zylindrischen Einsatz ist, platziert. Die Einlage hat eine Polycarbonat-Membran eines definierten Porengröße. Wenn in den Brunnen platziert, unterteilt die Kammer in zwei Fächer. Das obere Fach ist, wo dessen Wanderungsverhalten ist zu untersuchenden Zellen werden ausgesät, und der untere Stausee ist wo die Lösung des Lockstoffgradient platziert wird. Per Definition ist ein Lockstoffgradient ein Molekül, das die Fähigkeit hat, Zelle Motilität zu fördern, durch die "Gewinnung von Zellen."
Durch diese Anziehungskräfte wandern Zellen im oberen Fach durch die Poren in den unteren Behälter. Wenn die Zellen anhaftende Eigenschaften, wie einige Melanomzellen, nach Bewegung werden sie "an der Unterseite der Membran kleben". In diesem Fall kann die Membran befestigt werden, gebeizt, und Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden können. Auf der anderen Seite werden in den unteren Behälter nicht anhaftende Zellen, wie Spermien, migrieren. In diesem Fall können Zellen in das Reservoir-Lösung mit Hilfe von einem Hemocytometer gezählt werden.
Obwohl das Setup für diese Test einfach ist, gibt es mehrere Dinge, die Sie vor dem Experiment beachten müssen. Betrachten wir einige von ihnen.
Beginnend mit der Aussaat Lösung, müssen Sie sicherstellen, dass die Dichte optimiert um Zellwanderung zu beobachten ist. Zu wenige Zellen nicht nachweisbar Migration führen können, und größere Dichte werden die Membran, erschwert das Auflisten von Migration übervölkern. Die zweite Überlegung ist die Porengröße des Einsatzes. Es sollte sorgfältig gewählt werden, je nach Zelltyp. Wenn die Porengröße zu klein ist, werden Zellen durchlaufen.
Alternativ, wenn die Poren zu groß ist, werden Zellen nur durch, fallen die ist keine Migration. Zu guter Letzt muss achten, die Lockstoffgradient-Konzentration und die Inkubationszeit für Migration erlaubt sein wie diese voneinander abhängig sind. Optimale Konzentration mit geeigneten Inkubationszeit bei dem Konzentrationsgefälle zwischen den Abteilen beibehalten wird induziert Zellwanderung durch die Chemo-Attraktion. Umgekehrt können längere Inkubationen begleitet werden, durch ein Gleichgewicht der Lockstoffgradient in der Kammer, die zum Verlust des chemischen Gradienten, die die Analyse der erzielten Ergebnisse verwirren kann.
Mit diesen Überlegungen im Auge sprechen wir über ein Protokoll zur Messung der Migration von adhärenten Zellen.
Zellen untersucht werden sind in einem Protease-freies Medium bereit, da Proteasen können wichtige Membranrezeptoren denaturieren und letztlich Migration beeinflussen. Nachdem Zellen vorbereitet sind, sollten die Aussetzung zu einer optimalen Aussaatdichte verdünnt werden. Um die Kammer vorzubereiten, werden Transwells in Brunnen auf einem multiwell Teller gelegt. Zellsuspension sollte in die Transwell pipettiert werden, ohne die Membran zu berühren oder die Einführung von Luftblasen.
Lockstoffgradient Lösung ist in den unteren Behälter dafür, dass die Lösung die Membran des Einsatzes berührt pipettiert. Die Inkubationszeit für die Migration wird von den experimentellen Erwägungen abhängen. Nach Inkubation werden die Membranen durch Eintauchen des Einsatzes in 70 % igem Ethanol fixiert. Nach Abzug des Einsatzes zu trocknen, wird die Zelle Färbelösung hinzugefügt.
Als nächstes werden Zellen für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation werden die Einsätze mit Hilfe von Waschpuffer gewaschen. Schließlich kann die Membran ausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt. Zellen auf der Unterseite der Membran stehen für die Anzahl der Zellen, die in der Gegenwart migriert haben und fehlender Chemoattractants.
Denn jetzt Sie ein Gefühl für das Protokoll haben, werfen wir einen kurzen Blick auf wie Forscher diese Methode in ihre Entdeckungen verwenden.
Die häufigsten Anwendungen des Assays gehört zu Lockstoffgradient Eigenschaften von unbekannten Substanzen zu bewerten. Hier interessierte Wissenschaftler untersuchen schwimmen wegen der Frosch Spermien in Anwesenheit von allurin, eine Substanz abgesondert von Amphibien Eiern. Um dies zu tun, pipettieren sie zuerst aktiv Frosch Spermien an die Spitze der Transwell Einsätze. Am Ende hinzugefügt sie allurin. Nach Abzug der Zellen migrieren, zählte sie Sperma in das Reservoir-Lösung unter dem Mikroskop. Mit dieser Technik konnten sie eine Konzentration-Wirkungs-Kurve zeigt die Wirkung der allurin Konzentration auf Sperma Migration zu erzeugen.
Wenn eine Zelle durch Krankheitserreger angegriffen wird, sendet er Chemoattractants Immunzellen zu rekrutieren, die migrieren, befestigen und anschließend beheben Infektion. Um dieses Phänomen zu testen, diese Wissenschaftler kultivierten Epithelzellen auf der Unterseite der Einsätze. Anschließend infiziert sie diese Zellen mit verschiedenen Bakterienstämme. Schließlich führte sie Immunzellen in die obere Kammer. Es ist bekannt, dass die infizierten Zellen mehrere Chemoattractants zu produzieren, die Migration von Immunzellen zu induzieren. Ergebnisse dieses Experiments zeigten unterschiedliche Grade der Neutrophilen Migration als Reaktion auf verschiedene Arten der bakteriellen Infektion.
Zu guter Letzt Krebs Zelle Invasion und Metastasierung durch die extrazelluläre Matrix hat schon immer fasziniert Zellbiologen. Hier wollte Wissenschaftler feststellen, wie bestimmte Chemoattractants können dazu beitragen, eine solche Migration durch eine 3D Matrix. Sie gentechnisch zwei separate Pools von Zellen: eine grüne fluoreszierende, zum Ausdruck zu bringen und ein anderes rot fluoreszierende, Protein. Sie pipettiert dann eine extrazelluläre Matrix-Mimic an die Spitze der Transwells.
Sobald erstarrt, sie invertiert die Transwell und zwei Pools der Zellen an der Unterseite der Membran ausgesät. Als nächstes sie ersetzt die Einlage in die multiwell Platte und die Lockstoffgradient-Lösung in die obere Kammer pipettiert. Dies verursacht die Zellen an der Unterseite und durch die 3D Matrix bewegen. Mit Hilfe der konfokalen Bildgebung diese Forscher Zellwanderung in 3D rekonstruiert, und die Migrationsmuster von zwei Gruppen von Zellen zu unterscheiden.
Sie haben genau beobachtete sich Jupiter Transwell Migration Test video an. Mit dem Verständnis der Komponenten und das Protokoll dieser Methode wissen Sie jetzt, warum es so weit von Zellbiologen verwendet wird. Trotz der Einfachheit dieser Einrichtung macht die Auswahl an Konfigurationen, die diese Methode anpassen kann es unverzichtbar für Zelle Motilität Studien. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
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Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.