4.5: Der Transwell-Migration-Assay

Der Transwell-Migrationsassay ist eine klassische Technik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die Zellbewegung zu quantifizieren. Migration bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, sich einzeln oder in Clustern zu bewegen. Zellbewegungen werden durch eine präzise Umstrukturierung ihres Zytoskeletts ermöglicht, und die Migration erfolgt in der Regel als Reaktion auf Reize, die als Signale fungieren.

Heute werden wir den Transwell-Migrationsassay diskutieren, der einen einfachen Kammeraufbau verwendet, um die Migration als Reaktion auf anziehende Signale zu bewerten.

Wir beginnen mit einigen Hintergrundinformationen zur Transwell-Kammer.

Die Apparatur wurde erstmals 1961 von Dr. Stephen Boyden entwickelt, der sie zur Untersuchung der Leukozytenmigration verwendete. Daher ist diese Methode auch als Boyden-Kammer-Assay bekannt.

In einer einfachen Boyden-Kammer besteht die Außenwand aus den Vertiefungen, wie die einer 96-Well-Platte. In jeder Vertiefung befindet sich ein Querschacht, bei dem es sich um einen zylindrischen Einsatz handelt. Die Einlage verfügt über eine Polycarbonat-Membran mit definierter Porengröße. Wenn es in die Vertiefung gestellt wird, teilt es die Kammer in zwei Kammern. Das obere Kompartiment ist der Ort, an dem Zellen ausgesät werden, deren Migrationsverhalten untersucht werden soll, und das untere Reservoir ist der Ort, an dem die Lösung des Chemolockstoffs platziert wird. Per Definition ist ein Chemolockstoff ein Molekül, das die Fähigkeit hat, die Zellmotilität zu fördern, indem es "Zellen anzieht".

Aufgrund dieser Anziehungskräfte wandern Zellen im oberen Kompartiment durch die Poren in das untere Reservoir. Wenn die Zellen adhärente Eigenschaften haben, wie einige Melanomzellen, "kleben" sie nach der Bewegung an der Unterseite der Membran. In diesem Fall kann die Membran fixiert, gefärbt und Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden. Auf der anderen Seite wandern nicht-adhärente Zellen, wie Spermien, in das untere Reservoir. In diesem Fall können Zellen in der Reservoirlösung mit Hilfe eines Hämozytometers gezählt werden.

Obwohl der Aufbau für diesen Assay einfach ist, gibt es einige Dinge, die Sie vor dem Experiment beachten müssen. Schauen wir uns einige von ihnen an.

Beginnend mit der Seeding-Lösung müssen Sie sicherstellen, dass die Dichte optimiert ist, um die Zellmigration zu beobachten. Zu wenige Zellen können zu einer nicht nachweisbaren Migration führen, und größere Dichten überbevölkern die Membran, was es schwierig macht, die Migration aufzuzählen. Die zweite Überlegung ist die Porengröße des Einsatzes. Es sollte je nach Zelltyp sorgfältig ausgewählt werden. Wenn die Porengröße zu klein ist, können die Zellen nicht passieren.

Wenn die Porengröße zu groß ist, fallen die Zellen einfach durch, was keine Migration ist. Schließlich muss man auf die Konzentration des Chemolockstoffs und die Inkubationszeit achten, die für die Migration vorgesehen ist, da diese voneinander abhängig sind. Eine optimale Konzentration mit angemessener Inkubationszeit, während der der Konzentrationsgradient zwischen den Kompartimenten aufrechterhalten wird, induziert die Zellmigration aufgrund der Chemo-Anziehung. Umgekehrt können längere Inkubationen von einem Gleichgewicht des Chemolockstoffs in der gesamten Kammer begleitet sein, was zu einem Verlust des chemischen Gradienten führt, was die Analyse der erzielten Ergebnisse verwirren kann.

Lassen Sie uns vor diesem Hintergrund ein Protokoll besprechen, das zur Messung der Migration adhärenter Zellen verwendet wird.

Die zu untersuchenden Zellen werden in einem proteasefreien Medium präpariert, da Proteasen wichtige Membranrezeptoren denaturieren und letztlich die Migration beeinflussen können. Nach der Aufbereitung der Zellen sollte die Suspension auf eine optimale Aussaatdichte verdünnt werden. Zur Vorbereitung der Kammer werden die Transwells in Vertiefungen auf einer Multiwell-Platte platziert. Die Zellsuspension sollte in den Transwell pipettiert werden, ohne die Membran zu berühren oder Luftblasen einzuführen.

Die Chemolockstofflösung wird in das untere Reservoir pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösung die Membran des Einsatzes berührt. Die Inkubationszeit für die Migration hängt von den experimentellen Überlegungen ab. Nach der Inkubation werden die Membranen fixiert, indem der Einsatz in 70%iges Ethanol getaucht wird. Nachdem Sie den Einsatz trocknen gelassen haben, wird eine Zellfärbelösung zugegeben.

Anschließend werden die Zellen etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Einlagen mit Hilfe von Waschpuffer gewaschen. Abschließend kann die Membran herausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt werden. Zellen an der Unterseite der Membran stellen die Anzahl der Zellen dar, die in Gegenwart und Abwesenheit von Chemolockstoffen migriert sind.

Da Sie nun ein Gefühl für das Protokoll haben, werfen wir einen kurzen Blick darauf, wie Forscher diese Methode bei ihren Erkundungen einsetzen.

Eine der häufigsten Anwendungen dieses Assays ist die Bewertung der chemoanziehenden Eigenschaften unbekannter Verbindungen. Hier interessierten sich die Wissenschaftler für die Untersuchung der Schwimmwege von Froschspermien in Gegenwart von Allurin, einer Substanz, die von Amphibieneiern abgesondert wird. Dazu pipettierten sie zunächst aktive Froschspermien an die Oberseite der Transwell-Einsätze. Unten fügten sie Allurin hinzu. Nachdem sie die Zellen wandern ließen, zählten sie die Spermien in der Reservoirlösung unter dem Mikroskop. Mit dieser Technik konnten sie eine Konzentrations-Reaktions-Kurve erstellen, die die Wirkung der Allurinkonzentration auf die Spermienmigration darstellt.

Wenn eine Zelle von Krankheitserregern angegriffen wird, sendet sie Chemolockstoffe aus, um Immunzellen zu rekrutieren, die wandern, sich anheften und anschließend die Infektion auflösen. Um dieses Phänomen zu testen, kultivierten die Wissenschaftler Epithelzellen an der Unterseite der Inserts. Anschließend infizierten sie diese Zellen mit verschiedenen Bakterienstämmen. Schließlich brachten sie Immunzellen in die obere Kammer ein. Es ist bekannt, dass die infizierten Zellen mehrere Chemolockstoffe produzieren, die die Migration von Immunzellen induzieren. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten einen unterschiedlichen Grad der Migration von Neutrophilen als Reaktion auf verschiedene Arten von bakteriellen Infektionen.

Schließlich hat die Invasion von Krebszellen und die Metastasierung durch die extrazelluläre Matrix Zellbiologen schon immer fasziniert. Hier wollten die Wissenschaftler herausfinden, wie bestimmte Chemolockstoffe durch eine 3D-Matrix zu einer solchen Migration beitragen können. Sie veränderten gentechnisch zwei getrennte Zellpools: einen grün fluoreszierenden und einen rot fluoreszierenden Protein. Dann pipettierten sie eine extrazelluläre Matrix-Nachahmung an die Spitze von Transwells.

Nach der Erstarrung drehten sie den Transwell um und säten zwei Zellpools an der Unterseite der Membran aus. Als nächstes setzten sie den Einsatz in die Multiwell-Platte ein und pipettierten die Chemolockstofflösung in die obere Kammer. Dies führte dazu, dass sich die Zellen am unteren Rand nach oben und durch die 3D-Matrix bewegten. Mit Hilfe der konfokalen Bildgebung rekonstruierten die Forscher die Zellmigration in 3D und unterschieden die Migrationsmuster zweier Zellgruppen.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über den Transwell-Migrationsassay angesehen. Mit dem Verständnis der Bestandteile und des Protokolls dieser Methode wissen Sie nun, warum sie von Zellbiologen so häufig eingesetzt wird. Trotz der Einfachheit dieses Aufbaus ist diese Methode aufgrund ihrer vielfältigen Konfigurationen, die sie anpassen kann, für Studien zur Zellmotilität unverzichtbar. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!