Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung des photoaktivierbaren Peptids MHC zur Induktion polarisierter Signalwege in T-Lymphozyten zu beschreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Signaltransduktion von Immunzellen zu beantworten, z. B. wie Lymphozyten schnelle lokalisierte Signale übertragen und dann polarisierte zelluläre Antworten auf diese Signale aufbauen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine räumliche und zeitliche Kontrolle der T-Zell-Signalübertragung ermöglicht.

Dies geschieht durch die Festlegung des genauen Zeitpunkts und Ortes der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors. Das Verfahren wird von Elisa Sanchez, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Zugabe von biotinyliertem Poly-L-Lysin oder Bio-PLL, verdünnt von eins bis 500 in destilliertem deionisiertem Wasser auf ein Deckglas mit acht Vertiefungen.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen und dann zwei Stunden bei Raumtemperatur trocknen. Blockieren Sie bio-PLL-beschichtete Oberflächen mit Blockierungspuffer bestehend aus HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 2%BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer von den bio-PLL-beschichteten Oberflächen, ohne die Vertiefungen trocknen zu lassen. Dann Streptavidin hinzufügen und bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die beschichteten Oberflächen nach einer Stunde in HBS.

Füllen und invertieren Sie die Vertiefungen des Kammerschiebers vier- bis fünfmal, wobei HBS aus den Vertiefungen entfernt wird. Lassen Sie die Vertiefungen nicht trocknen. Fügen Sie den bio-PLL-beschichteten Oberflächen das spezifische, biotinylierte, photoaktivierbare Peptid, die Haupthistokompatibilität, die komplexen Liganden und die Adhäsionsmoleküle für CD4-positive T-Zellen oder CD8-positive Zellen hinzu.

Vor Licht schützen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation wie zuvor waschen und bis zur Aussaat in HBS belassen. Zum Schluss werden 200.000 CD4- oder CD8-positive T-Zellen, die den entsprechenden TCR exprimieren, in die richtigen Vertiefungen gegeben und die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius adhäsieren gelassen.

Sobald sich die Zellen an der Oberfläche festgesetzt und auf ihr ausgebreitet haben, sind sie bereit für die Photoaktivierung und Bildgebung. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein inverses Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer UV-kompatiblen 150X-Objektivlinse ausgestattet ist. Überwachen Sie die Sonden sowohl im grünen als auch im roten Kanal mit 488-Nanometer- bzw. 561-Nanometer-Anregungslasern.

Passen Sie nach der Montage des Objektträgers mit den T-Zellen die Mikroskopeinstellungen an, um bei Bedarf eine TIRF- oder Epifluoreszenzbeleuchtung zu erhalten. Wählen Sie im Live-Modus ein Feld von Zellen aus, die die interessierenden Fluoreszenzsonden exprimieren. Richten Sie mikrometergroße Regionen für die Photoaktivierung unter einzelnen Zellen mithilfe der Softwaresteuerung ein.

Starten Sie dann die Akquisition. In der Regel sind 80 Zeitpunkte mit einem Abstand von jeweils fünf Sekunden erforderlich. Damit bleibt Zeit für sequentielle Belichtungen von 488 Nanometern und 563 Nanometern bei Dual-Color-Experimenten.

Nachdem Sie 10 Zeitpunkte erfasst haben, photoaktivieren Sie die ausgewählten Regionen, indem Sie den digitalen Blendenverschluss für eine bis 1,5 Sekunden öffnen. Wählen Sie nach Abschluss des Zeitraffers ein neues Zellenfeld aus und wiederholen Sie den Vorgang. Beginnen Sie mit der Bestimmung der Fluoreszenzintensität eines Hintergrundbereichs außerhalb der Zelle, der für die Hintergrundkorrektur verwendet werden soll.

Zeichnen Sie einen mikrometergroßen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und erstellen Sie eine Maske. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren, Maskenstatistiken. Wählen Sie Mittlere Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.

Bestimmen Sie die Fluoreszenzintensität innerhalb des photoaktivierten Bereichs für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Maske, um den Bereich hervorzuheben, der fotoaktiviert wurde. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren, Maskenstatistiken.

Wählen Sie Mittlere Fluoreszenzintensität aus, und exportieren Sie die Werte. Ermitteln Sie die X- und Y-Koordinaten des Mittelpunkts des fotoaktivierten Bereichs, indem Sie Maske auswählen, um den Bereich hervorzuheben, der photoaktiviert wurde. Sobald der Bereich der Photoaktivierung markiert ist, wählen Sie "Analysieren", "Statistik maskieren", "Bereichsmittelpunkt" und "Werte exportieren" aus.

Bestimmen Sie die X- und Y-Koordinaten der interessierenden Fluoreszenzsonde. Wählen Sie Manuelle Partikelverfolgung und klicken Sie auf die Fluoreszenzsonde, die Sie im Zeitverlauf interessieren möchten. Nachdem alle Zeitpunkte nachverfolgt wurden, wählen Sie Analysieren, Statistik maskieren, Bereichsmitte und Werte exportieren aus.

T-Zellen wurden an ein gekammertes Deckglas gebunden, das photoaktivierbares MCC-IEFK enthielt. C1-GFP, eine Sonde für den Lipid Second Messenger DAG, wurde mittels TIRF-Mikroskopie und RFP-Tubulin im Epifluoreszenzmodus abgebildet. Die lokalisierte Photoaktivierung der Oberfläche unter der T-Zelle induziert die Akkumulation von DAG in der bestrahlten Zone.

Darauf folgt innerhalb von Sekunden die Neuausrichtung des Zentrosoms auf den gleichen Bereich. Die C1-GFP-Akkumulation kann quantifiziert werden, indem die normierte Fluoreszenzintensität nach Hintergrundkorrektur im Zentrum des photoaktivierten Bereichs über die Zeit berechnet wird. Die Umorientierung des Zentrosoms als Reaktion auf die Photoaktivierung kann quantifiziert werden, indem der Abstand zwischen dem Zentrosom und dem Zentrum des photoaktivierten Bereichs als Funktion der Zeit berechnet wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einem Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. In dieser Zeit generieren wir in der Regel 15 bis 20 Zeitrafferfilme zur Analyse. Dieser Ansatz ebnete den Forschern den Weg, die genaue Kinetik und Polarisation der aktivierenden Signalübertragung in T-Zellen zu erforschen.

Es wurde auch angepasst, um die inhibitorische Signalübertragung in natürlichen Killerzellen zu untersuchen. Dadurch haben wir nun ein besseres Verständnis dafür, wie kommunikative Interaktionen zwischen Immunzellen aufgebaut und aufgelöst werden.