Name: Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Erfahren Sie die räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit photoaktivierbarem Peptid-MHC. Diese bildgebende Methode ermöglicht präzise Untersuchungen polarisierter Signalwege in T-Lymphozyten.

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Wir danken Mitglieder des Huse Lab um Rat und Hilfe. Unterstützt durch die US National Institutes of Health (R01-AI087644, m.h.) und P30-CA008748, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. Vorbereitung der stimulierende Glasflächen
<ol><li>Mantel acht Brunnen gekammert Deckglas mit biotinylierte Poly-L-Lysin (Bio-PLL) verdünnt 1: 500 in destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschen Sie mit H2O.</li>
	<li>Dry für 2 h bei RT.</li>
	<li>Block Bio-PLL beschichtete Oberflächen mit blockierenden Puffer (HEPES gepufferten Kochsalzlösung [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], mit 2 % BSA) für 30 min bei RT<ol>
<li>Lösen Sie 5 mg Poly-L-Lysin Hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Fügen Sie 125 μmol (0,55 mg) von NHS-Biotin hinzu (aus einer 100 mg/mL Brühe in DMSO) und überprüfen Sie den pH-Wert der Reaktion. Liegt der pH-Wert unter 8,5, fügen Sie 2 μL 4 N NaOH, um zwischen pH 8,5 und 9,5 zu erhöhen.</li>
		<li>Vortex für 30 Minuten.</li>
		<li>Die Reaktion mit 50 μL der 100 mM Glycin in 20 mM Tris pH 8.0 aufgelöst zu stillen.</li>
		<li>Bei voller Leistung für 10 min drehen und den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bio-PLL-Qualität ist in der Regel im Vergleich zu bisherigen Vorbereitungen durch Beschichtung zweifache Verdünnungsreihen des Materials auf einer 96-Well-ELISA-Platte und Quantifizierung von Biotin Inhalt nach Inkubation mit alkalischer Phosphatase Streptavidin gekoppelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockierende Puffer zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken. Fügen Sie Streptavidin (100 µg/mL in blocking-Puffer). 1 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie in HBS. Füllen Sie und invertieren Sie Kammer Folie Brunnen 4-5mal, HBS aus dem Brunnen zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken.</li>
	<li>Fügen Sie die biotinylierte pMHC Liganden und Adhäsionsmoleküle an die Oberfläche. Bemerkung: MCC und Eizellen kann Photocaged durch Zugabe von ortho-Nitrobenzyl Basis Schutzgruppen (z. B. Nitrophenylethyl (NPE) oder Nitroveratryloxycarbonyl (SVOC)) an die ε-Aminogruppe des wichtigsten Lysines (K12 im MCC, K7 in OVA). Photocaged MCC und OVA erhalten Sie von kommerziellen Anbietern. Nach der Rekonstitution in wässrigen Puffer sind sie in bakteriell ausgedrückt-Ek und H2-Kb mit etablierten Ansätzen11,12refolded.</li>
	<li>Validierung von Photoactivatable MCC oder Eizellen Peptid<ol>
<li>Decage Peptide SVOC-geschützt durch UV Bestrahlung mit einer UV-Lampe handheld (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min bei RT</li>
		<li>Pulse 1.0 x 105 APCs mit 1 µM nonstimulatory Peptid (negative Kontrolle, z.B. Hb), unbestrahlten Photoactivatable Peptid, bestrahlten Photoactivatable Peptid und Agonist Peptid (Positivkontrolle, z.B., MCC) für 1 h bis über Nacht bei 37 ° C.</li>
		<li>Förderung der T-Zellen, die mit dem Ausdruck der 5 C. C7/2B4/und TCR, Verwendung CH12 oder CH27 B-Zellen. Um OT1 T-Zellen zu stimulieren, verwenden Sie RMA-s oder EL4 Thymom Zellen.</li>
		<li>Mischen Sie die gepulste APCs mit einer gleichen Anzahl von T-Zellen in 96-Well Runde Bodenplatten zu einem Endvolumen von 200 µL. Inkubation bei 37 ° C für 12-24 h.</li>
		<li>Die Überstände von jedes gut erholen und IL-2 von ELISA mit Streptavidin-Meerrettich Peroxidase farbmetrischen Erkennung zu analysieren. Hinweis: Bestätigung des festsetzende Status alle Peptide durch Electrospray Massenspektrometrie vor umfaltung in MHC-komplexe, wird dringend empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Faltung und Reinigung der MHC Lichteinwirkung zu minimieren. Zum Beispiel Falten Reaktionen in Alufolie wickeln und Gel Filtration Chromatographie mit der UV-Lampe aus durchführen. Hinweis: Es hat sich herausgestellt, dass Photoactivatable MCC-I-Ek und OVA - H2-Kb induzieren UV-unabhängige T-Zell-Aktivierung in hoher Dichte, möglicherweise aufgrund von unvollständigen funktionellen Käfighaltung. Daher wird die Photoactivatable pMHC in einer 10-30 X Überschreitung des nonstimulatory pMHC (z. B. -Ek , enthalten das Hämoglobin64-76 Peptid (Hb)) während der Ruhigstellung Schritt verdünnt. Dies verbessert das Signal Rauschabstand des nachfolgenden bildgebenden Experiments.</li>
	<li>Zu Photoactivate CD4+ T Zellen, gemeinsam verwenden eine Mischung aus biotinylierte Hb-I-Ek (3 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable MCC-I-E-k (0,1 µg/mL) und biotinylierte Antikörper gegen die Klasse ich MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). der Antikörper Anti-H2-Kk fördert 5 C. C7/2B4/und T-Zellen, die H2-Kk, um auf die Glasoberfläche zu verbreiten, ohne Aktivierung zum Ausdruck bringen.</li>
	<li>Für CD8+ T Zellen, verwenden Sie eine Mischung aus biotinylierte H2-Db trägt das Peptid KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 µg/mL), und der extrazellulären Domäne des das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (2 µg/mL produziert von Insekten Zelle Kultur13). Die ICAM-1 fördert enge Kontakt Bildung durch die Gewinnung der Integrin LFA1 auf der T-Zell-Oberfläche.</li>
	<li>Gelten Sie alle Protein-Mischungen in blockierende Puffer, gefolgt von Inkubation für 1 h bei RT oder mindestens 2 h bei 4 ° C. Hinweis: Die molekulare Dichte auf Oberflächen dieser Art zu ~ 8000 pro µm2 wurde zuvor ermittelte6. Da die Photoactivatable pMHC ~1/30 darstellt werdenth biotinylierte Protein auf der Oberfläche, seine Dichte ~ 267 Moleküle pro µm2, vor decaging.</li>
	<li>Waschen Sie wie in Schritt 1.6 und in HBS erst unmittelbar vor Gebrauch.</li>
	<li>Fügen Sie 200.000 CD4+ oder CD8+ T Zellen, mit dem Ausdruck der entsprechenden TCR in jede Vertiefung und lassen Zellen bei 37 ° C für 15 min einhalten. Sobald Zellen befestigt und auf der Fläche verteilt haben, sind sie bereit für photoaktivierungen und Imaging. Hinweis: Retrovirale Transduktion von T-Effektorzellen mit fluoreszierenden bildgebende Sonden wird im Detail Elswhere6,7beschrieben. Kalzium-Signalisierung kann auch mit untransduced T-Zellen geladen mit dem Kalzium sensibler Farbstoff Fluo-46untersucht werden. Der ratiometrischen Farbstoff Fura-2 ist nicht empfehlenswert, weil es Erregung im UV-Bereich erfordert, die auch induziert decaging von Photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. die Bildaufnahme
<ol><li>Verwenden Sie einem inversen TIRF-Mikroskop mit einem UV kompatibel 150 X Objektiv für die Bildaufnahme ausgestattet. UV bestrahlen benutzerdefinierte Regionen mit einer digitalen Membran-System angeschlossen, um ein 100 W-Quecksilber-Lampe (HBO). Direkte UV-Licht von dieser Lampe auf die Probe mit einem 400 nm langen Pass Spiegel.</li>
	<li>Verwenden Sie Bildanalyse-Software für lokalisierte photoaktivierungen und Zeitraffer Erwerb. In den meisten Experimenten überwachen Sonden in den grünen und roten Kanälen mit 488 nm und 561 nm Anregung Laser, beziehungsweise. Laserlicht ist gerichtet auf die Probe mit einem Dual-Bandpass dichroitischen Spiegel, der auch im UV-Bereich (um decaging ermöglichen) überträgt. Weitere Informationen auf mikroskopkonfiguration finden Sie in der Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 6 .</li>
	<li>Passen Sie nach der Montage der Kammer-Folie mit der T-Zellen Einstellungen an, um TIRF oder Epifluoreszenz-Beleuchtung, wie nötig zu erhalten. Wählen Sie im live-Modus einen Bereich von Zellen, die die fluoreszierenden Wortanzahl von Interesse zum Ausdruck bringen. Mikron-Skala Regionen für photoaktivierungen unter Einzelzellen mit Softwaresteuerung zu etablieren.</li>
	<li>Beginnen Sie Time-Lapse Erwerb. In der Regel 80 Zeitpunkten erworben werden, mit einem Intervall von 5 s zwischen jeden Zeitpunkt. Somit bleibt mehr als genug Zeit für sequentielle 488 nm und 563 nm Expositionen bei dual Farbe Experimente.</li>
	<li>Nach 10 Zeitpunkte, Photoactivate die ausgewählten Regionen durch Öffnen der digitalen Membran für 1-1.5 s Verschlusszeit.</li>
	<li>Nachdem die Zeitspanne abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Feld der Zellen, und wiederholen Sie den Vorgang.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
Hinweis: Lokalisierte photoaktivierungen immobilisierten Liganden erstellt eine wohldefinierte, stationäre stimulierende Region, die für Quantitative Analyse der Signalisierung Antworten und Zytoskeletts umgestaltet Veranstaltungen verwendet werden kann. Analyse Protokolle in der Regel beinhalten, Quantifizierung der Fluoreszenzintensität innerhalb der bestrahlten Region oder über der bestrahlten Region als positionelle Endpunkt für Distanzmessungen (zB. für die Beurteilung der Polarisation des Centrosome, die bestrahlten Region). Beide Analyseprotokolle sind nachfolgend beschrieben. Verschiedene interaktive Analyse Bildprogramme können verwendet werden, um Intensität und Abstandsmessungen, dann Ausgang zur weiteren Verarbeitung und Analyse werden kann.
<ol><li>
Fluoreszenzintensität
	<ol>
<li>Bestimmen der Fluoreszenzintensität (FI) einer Hintergrund-Region außerhalb der Zelle (FIb). Dies wird für die Hintergrundkorrektur verwendet werden.<ol>
<li>Zeichnen Sie einen Mikrometer großen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und machen Sie eine Maske zu. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte. Hinweis: Modalitäten (z.B. 3.1.1.1) beziehen sich auf Slidebook Software (siehe Tabelle der Materialien). Durchführung dieses Protokolls mit anderen Software-Paketen (zB., Fidschi) etwas anders.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die FI in der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt zu bestimmen.<ol>
<li>Wählen Sie die Maske um den Bereich zu markieren, der photoaktiviert war. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund FI aus den Messwerten der FI in der Region. Dann die korrigierte FI Messungen geteilt durch die durchschnittliche normalisieren, Hintergrund korrigiert FI die ersten 9 Frames vor photoaktivierungen. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Hinweis: Graph ΔF/F als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung
	<ol>
<li>Rufen Sie die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region, wählen Sie Maske um den Bereich zu markieren, die photoaktiviert war. Sobald die Region des photoaktivierungen markiert ist, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bestimmen die x- und y-Koordinaten für die fluoreszierenden Sonde von Interesse für jeden Zeitpunkt. Dies geschieht in der Regel durch manuelle oder automatisierte Teilchen verfolgen.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten der fluoreszierenden Sonde von Interesse, wählen Sie Manuell Particle Tracking und klicken Sie auf die fluoreszierende Sonde von Interesse im Laufe der Zeit. Sobald alle Zeitpunkte verfolgt haben, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie den Abstand zwischen den fluoreszierenden Proteins des Interesses und der Mitte der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung: Abstand = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), die x2 und y sind2 die Koordinaten des fluoreszierenden Proteins von Interesse und X1 und y1 die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.</li>
		<li>Diagramm der Abstand als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In den letzten Jahren hat Licht als ein ausgezeichnetes Werkzeug für raumzeitlich kontrollierte Aktivierung von zellulären Prozessen entstanden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, jede mit damit verbundenen vor- und Nachteile. Das System hier beschrieben wird, die auf die decaging von immobilisierten, extrazellulären Liganden, eignet sich besonders für die Analyse von rapid, subzelluläre, polarisierte Signalisierung Antworten. Dieser Ansatz wurde angewandt, um IS Bildung in T-Zellen wie oben beschrieben zu untersuc...

T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Immunität durch das erkennen Antigene Peptide, die im Rahmen der Zelloberfläche MHC angezeigt. Antigen-Anerkennung, die durch die TCR vermittelt wird, treibt die Differenzierung der naiven T-Zellen und fördert die Lieferung der Zytolyse und kommunikative Reaktionen der Effektor Populationen. TCR Engagement induziert auch dramatische Veränderungen in der zellulären Architektur. Innerhalb von Minuten die T-Zellen gloms auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), bilden eine polarisierte Schnittstelle bekannt als der immunologischen Synapse (IS)1,2. Der IS potenziert T-Zell-Effektor-Reaktionen durch die Aktivierung der direktionalen Freisetzung von Zytokinen oder, im Falle von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), lytische Proteine, die die APC zerstören.
TCR Engagement von pMHC induziert die schnelle Phosphorylierung mehrere nachgeschaltete Adapter Moleküle, einschließlich Linker für die Aktivierung von T-Zellen (LAT), die letztlich fördert robuste Umgestaltung der synaptischen cytoskelett2. Kortikale filamentösen Aktin (F-Aktin) treibt T Zelle auf der APC-Oberfläche verteilt und löst sich dann in eine ringförmige Struktur zeichnet sich durch F-Aktin-Ansammlung an der Peripherie IS und Erschöpfung von der Mitte. F-Aktin Ringbildung ist eng an die Neuausrichtung der Mikrotubuli organisierenden Zentrum (MTOC, auch genannt die Centrosome in T-Zellen) an eine Position unterhalb der Mitte der Schnittstelle gekoppelt. Beide Veranstaltungen auftreten innerhalb von Minuten der erste Antigen-Anerkennung und den architektonischen Kontext, in dem nachfolgenden Aktivierung Veranstaltungen, den und Effektor Reaktionen auftreten, zu etablieren.
Um IS Bildung zu untersuchen, haben verschiedene Labors Ansätze entwickelt, in denen die APC durch eine Glasoberfläche, die ersetzt wird entweder immobilisierte Liganden TCR enthält oder ein Lipid Bilayer unterstützt, dass selbst die Liganden3,4enthält. T-Zellen bilden IS-ähnliche Kontakte auf diesen Flächen, die durch Totalreflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF) oder konfokalen Mikroskopie, hochauflösende Studien der frühen T-Zellaktivierung und IS Bildung abgebildet werden können.
Obwohl diese Ansätze für ausgezeichnete Visualisierung des fertig montierten IS erlaubt haben, tritt ein Großteil der Signalisierung folgende TCR:pMHC Ligatur innerhalb von Sekunden, erschweren die Bemühungen um die Abfolge der Ereignisse nach TCR Aktivierung genau bestimmen . Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein photoaktivierungen Konzept entwickelt, in denen verwendet wird Photoactivatable pMHC, räumlich-zeitliche Kontrolle der TCR Aktivierung5,6,7zu erreichen. In diesem System sind T-Zellen Glasflächen mit Photoactivatable pMHC, die nicht-stimulierende, TCR bis Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht ist beigefügt. UV-Bestrahlung ein Mikrometer großen Bereich der Oberfläche unter der T-Zelle entfernt die Photocage schaffen eine anregende Zone, die von der T-Zellen erkannt werden kann. Ereignisse nach dem Bilanzstichtag Signalisierung und Zytoskeletts Umbau werden dann durch genetisch codierte fluoreszierende Reporter überwacht. Zwei Photoactivatable Versionen von Antigenen Peptide, Motte Cytochrom C88-103 (MCC) und Ovalbumin257-264 (OVA), die im Zusammenhang mit der Klasse II MHC-Ek und die Klasse ich MHC H2-Kb, bzw. vorgestellt werden, wurden entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Analyse der beiden CD4+ T-Zellen spezifisch für MCC-I-E-k (mit dem Ausdruck der 5 C. C7, 2B4, oder AND TCR) und CD8+ T-Zellen spezifisch für OVA-H2-Kb (mit dem Ausdruck der OT1 TCR).
Im letzten Jahrzehnt ist der TCR photoaktivierungen und Imaging-Ansatz, die präzise Kinetik der frühen TCR Signalisierung Schritte zu etablieren und zu identifizieren, die molekulare Wege polarisiert Zellskelett Umbau5, EZB verwendet worden 6 , 7 , 8 , 9 , 10. beispielsweise der Test war maßgeblich bei der Bestimmung, dass Centrosome Neuorientierung in Richtung der APC wird durch eine lokalisierte Steigung von Lipid zweite Bote Diacylglycerol zentriert auf den IS vermittelt. Es wird erwartet, dass diese Methodik wird weiterhin wertvoll für Anwendungen, die hochauflösenden bildgebenden Analyse des T-Zellfunktion zu fordern.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>muss biotinyliertes Poly-L-Lysin</td></tr><tr><td>EZ-Link herstellen NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td> muss <td>biotinyliertes Poly-L-Lysin</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>herstellen Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA Biotin-Protein-Ligase-Standardreaktionskit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>wird zur Biotinylierung von Proteinen verwendet</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Hb I-EK&nbsp; </td><td></td><td></td><td>Zur Proteinfaltung siehe Referenz 6. Für die Biotinylierung verwenden Sie das BirA-Kit</td></tr><tr><td>Biotinyliertes NPE-MCC I-EK&nbsp; </td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) kann bei Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated & alpha; H2-Kk Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierte NPE-OVA H2-Kb</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) können von Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinyliert KAVY H2-Db&nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom synthetisiertes Protein (KAVYDFATL) kann von Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&nbsp;</td> erworben werden.<td></td><td></td><td>Zur Proteinfaltung siehe Referenz im Protokoll. Verwenden Sie für die Biotinylierung das BirA-Kit</td></tr><tr><td>Tragbare UV-Lampe</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Die Lampe wird < 1 cm von der Probe entfernt.&nbsp; 30 s 365 Licht sind ausreichend für das nachweisbare Deaktivieren, 20 min für das quantitative Deaktivieren.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF-System.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Weitere Informationen zum Bildgebungssystem finden Sie in Abbildung 6</strong</td></tr><tr><td>>Mosaic Digital Diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook-Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

räumliche und zeitliche steuerung der t-zell-aktivierung mit hilfe einer photoactivatable-agonist

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

T-Lymphozyten engagieren sich in schnellen, polarisierte Signale, tritt innerhalb von Minuten nach der Aktivierung des TCR. Dies induziert Bildung der immunologischen Synapse, eine stereotype Zell-Zell-Kreuzung, die T-Zell-Aktivierung reguliert und direktional richtet sich an Effektor Antworten. Um diese Prozesse effektiv zu studieren, ist ein bildgebender Ansatz, der zugeschnitten ist zur Erfassung schneller, polarisierter Antworten notwendig. Dieses Protokoll beschreibt ein solches System, basiert auf einer Photoactivatable Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC), das nicht-stimulierende bis UV-Licht ausgesetzt ist. Gezielte decaging von diesem Reagens während Videomicroscopy Experimente ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-Aktivierung und hochauflösende Überwachung der anschließende zelluläre Reaktionen der Totalreflexion (TIRF) imaging. Dieser Ansatz ist auch kompatibel mit genetischen und pharmakologischen Störung Strategien. Dies ermöglicht die Montage von klar definierten Molekulare Signalwege, die TCR-Signalisierung link zur Bildung der polarisierten Zellskelett Strukturen, die die immunologische Synapse zugrunde liegen.

Der photoaktivierungen und Imaging Ansatz ermöglicht für Beobachtung und einfache Quantifizierung von rapid, polarisierte Signalisierung Antworten. Um seine Fähigkeiten, reproduziert zu illustrieren hier ist ein Experiment, die räumlich-zeitliche Korrelation zwischen TCR-induzierte DAG Akkumulation und Centrosome Neuorientierung zu prüfen. 5 C. C7 T Zelle Blasten waren retrovirally mit zwei Leuchtstoffröhren Reporter ausgestrahlt: ein DAG-Biosensor mit Tandem-C1-Domänen von Proteinkinase ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung des photoaktivierbaren Peptids MHC zur Induktion polarisierter Signalwege in T-Lymphozyten zu beschreiben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Signaltransduktion von Immunzellen zu beantworten, z. B. wie Lymphozyten schnelle lokalisierte Signale übertragen und dann polarisierte zelluläre Antworten auf diese Signale aufbauen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine räumliche und zeitliche Kontrolle der T-Zell-Signalübertragung ermöglicht.Dies geschieht durch die Festlegung des genauen Zeitpunkts und Ortes der Aktivierung des T-Zell-Rezeptors. Das Verfahren wird von Elisa Sanchez, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Zugabe von biotinyliertem Poly-L-Lysin oder Bio-PLL, verdünnt von eins bis 500 in destilliertem deionisiertem Wasser auf ein Deckglas mit acht Vertiefungen.30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation mit destilliertem entionisiertem Wasser waschen und dann zwei Stunden bei Raumtemperatur trocknen. Blockieren Sie bio-PLL-beschichtete Oberflächen mit Blockierungspuffer bestehend aus HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 2%BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer von den bio-PLL-beschichteten Oberflächen, ohne die Vertiefungen trocknen zu lassen. Dann Streptavidin hinzufügen und bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die beschichteten Oberflächen nach einer Stunde in HBS.Füllen und invertieren Sie die Vertiefungen des Kammerschiebers vier- bis fünfmal, wobei HBS aus den Vertiefungen entfernt wird. Lassen Sie die Vertiefungen nicht trocknen. Fügen Sie den bio-PLL-beschichteten Oberflächen das spezifische, biotinylierte, photoaktivierbare Peptid, die Haupthistokompatibilität, die komplexen Liganden und die Adhäsionsmoleküle für CD4-positive T-Zellen oder CD8-positive Zellen hinzu.Vor Licht schützen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation wie zuvor waschen und bis zur Aussaat in HBS belassen. Zum Schluss werden 200.000 CD4- oder CD8-positive T-Zellen, die den entsprechenden TCR exprimieren, in die richtigen Vertiefungen gegeben und die Zellen 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius adhäsieren gelassen.Sobald sich die Zellen an der Oberfläche festgesetzt und auf ihr ausgebreitet haben, sind sie bereit für die Photoaktivierung und Bildgebung. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein inverses Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer UV-kompatiblen 150X-Objektivlinse ausgestattet ist. Überwachen Sie die Sonden sowohl im grünen als auch im roten Kanal mit 488-Nanometer- bzw. 561-Nanometer-Anregungslasern.Passen Sie nach der Montage des Objektträgers mit den T-Zellen die Mikroskopeinstellungen an, um bei Bedarf eine TIRF- oder Epifluoreszenzbeleuchtung zu erhalten. Wählen Sie im Live-Modus ein Feld von Zellen aus, die die interessierenden Fluoreszenzsonden exprimieren. Richten Sie mikrometergroße Regionen für die Photoaktivierung unter einzelnen Zellen mithilfe der Softwaresteuerung ein.Starten Sie dann die Akquisition. In der Regel sind 80 Zeitpunkte mit einem Abstand von jeweils fünf Sekunden erforderlich. Damit bleibt Zeit für sequentielle Belichtungen von 488 Nanometern und 563 Nanometern bei Dual-Color-Experimenten.Nachdem Sie 10 Zeitpunkte erfasst haben, photoaktivieren Sie die ausgewählten Regionen, indem Sie den digitalen Blendenverschluss für eine bis 1,5 Sekunden öffnen. Wählen Sie nach Abschluss des Zeitraffers ein neues Zellenfeld aus und wiederholen Sie den Vorgang. Beginnen Sie mit der Bestimmung der Fluoreszenzintensität eines Hintergrundbereichs außerhalb der Zelle, der für die Hintergrundkorrektur verwendet werden soll.Zeichnen Sie einen mikrometergroßen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und erstellen Sie eine Maske. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren, Maskenstatistiken. Wählen Sie Mittlere Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.Bestimmen Sie die Fluoreszenzintensität innerhalb des photoaktivierten Bereichs für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie Maske, um den Bereich hervorzuheben, der fotoaktiviert wurde. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf Analysieren, Maskenstatistiken.Wählen Sie Mittlere Fluoreszenzintensität aus, und exportieren Sie die Werte. Ermitteln Sie die X- und Y-Koordinaten des Mittelpunkts des fotoaktivierten Bereichs, indem Sie Maske auswählen, um den Bereich hervorzuheben, der photoaktiviert wurde. Sobald der Bereich der Photoaktivierung markiert ist, wählen Sie "Analysieren", "Statistik maskieren", "Bereichsmittelpunkt" und "Werte exportieren" aus.Bestimmen Sie die X- und Y-Koordinaten der interessierenden Fluoreszenzsonde. Wählen Sie Manuelle Partikelverfolgung und klicken Sie auf die Fluoreszenzsonde, die Sie im Zeitverlauf interessieren möchten. Nachdem alle Zeitpunkte nachverfolgt wurden, wählen Sie Analysieren, Statistik maskieren, Bereichsmitte und Werte exportieren aus.T-Zellen wurden an ein gekammertes Deckglas gebunden, das photoaktivierbares MCC-IEFK enthielt. C1-GFP, eine Sonde für den Lipid Second Messenger DAG, wurde mittels TIRF-Mikroskopie und RFP-Tubulin im Epifluoreszenzmodus abgebildet. Die lokalisierte Photoaktivierung der Oberfläche unter der T-Zelle induziert die Akkumulation von DAG in der bestrahlten Zone.Darauf folgt innerhalb von Sekunden die Neuausrichtung des Zentrosoms auf den gleichen Bereich. Die C1-GFP-Akkumulation kann quantifiziert werden, indem die normierte Fluoreszenzintensität nach Hintergrundkorrektur im Zentrum des photoaktivierten Bereichs über die Zeit berechnet wird. Die Umorientierung des Zentrosoms als Reaktion auf die Photoaktivierung kann quantifiziert werden, indem der Abstand zwischen dem Zentrosom und dem Zentrum des photoaktivierten Bereichs als Funktion der Zeit berechnet wird.Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einem Tag durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. In dieser Zeit generieren wir in der Regel 15 bis 20 Zeitrafferfilme zur Analyse. Dieser Ansatz ebnete den Forschern den Weg, die genaue Kinetik und Polarisation der aktivierenden Signalübertragung in T-Zellen zu erforschen.Es wurde auch angepasst, um die inhibitorische Signalübertragung in natürlichen Killerzellen zu untersuchen. Dadurch haben wir nun ein besseres Verständnis dafür, wie kommunikative Interaktionen zwischen Immunzellen aufgebaut und aufgelöst werden.

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verfahren zum räumlichen-zeitlichen Steuerung der GTPase-Aktivität durch Licht beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf Rapamycin-FKBP-induzierte FRB Heterodimerisierung und Foto einschließende Systeme. Optimierung der Licht-Bestrahlung ermöglicht die raum-zeitlich kontrollierte Aktivierung der kleinen GTPasen auf subzellulärer Ebene.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Dieses Video zeigt eine Methode zum Entkoffeinieren eines photoaktivierbaren Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplexes mittels UV-Bestrahlung. Durch den Deaktivierungsprozess wird die native Peptidsequenz freigelegt, was eine präzise Aktivierung der T-Zellen ermöglicht.

Evaluierung der kontrollierten T-Zell-Aktivierung mit einem photoaktivierbaren Peptid MHC

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

In diesem Protokoll eingesperrte Proteinkinase A (PKA), ein zelluläres Signal Transduction Bioeffector, war auf einem Nanoparticle Oberfläche immobilisiert, mikroinjiziert in das Zytosol und aktiviert, indem die hochkonvertiert UV-Licht von Nah-Infrarot (NIR) Bestrahlung, Induktion nachgeschalteten Stress Faser Zerfall in das Zytosol.

Ein integriertes System aus der Ferne intrazelluläre Signaltransduktion von Großbildschirmen Nanoparticle vermittelte Kinase Photoaktivierungen auslösen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der einzelnen Kette MHC Klasse I komplexe molekulare Interaktionen in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen: Generation von veränderter antigenpräsentierende Zellen mit dem Ausdruck einzelne Kette konstruiert, Kultur der menschlichen CD8 + T Zelle Klon und T-Zell-Aktivierung-Experimenten.

Einzelne Kette MHC-Technologie zur Co-Agonismus in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen

Dieses Protokoll beschreibt die Generation der gemischten murinen Knochenmark Chimären mit spontanen autoimmune germinal Zentren, in denen, die autoreaktive Lymphozyten Photoactivatable grün fluoreszierendes Protein (PA-GFP) Reporter tragen. Dies bietet die Möglichkeit, zelluläre Lage in Geweben mit nachgeschalteten molekulare und funktionelle Analysen zu verknüpfen.

Abfragenden einzelne autoreaktive Germinal Center von Photoaktivierungen in einem gemischten Chimären Modell von Autoimmunität

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung einer technisch hergestellten Blue-Light-aktivierten allosterischen Schalterdomäne (LightR) zur reversiblen raumzeitlichen Kontrolle der Proteinaktivität. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell bietet diese Studie ein ausgeklügeltes Protokoll zur Entwicklung und Charakterisierung von lichtreguliertem Src (LightR-Src). Es zeigt die Vielseitigkeit dieses Ansatzes über Enzymklassen hinweg.

Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte zur Kultivierung primärer T-Zellen, einschließlich ihrer Isolierung, Aktivierung, Expansion und transienten Transfektion durch mRNA-Elektroporation. Zusätzlich werden ein Workflow und ein Antikörperpanel für die Durchflusszytometrie von Phänotyp, Aktivierungsmarkern, Viabilität und der Expression des chimerischen Antigenrezeptors (CAR) vorgeschlagen.

Isolierung, Kultivierung und vorübergehende Transfektion primärer menschlicher T-Zellen zur Bildung von chimerischen Antigenrezeptoren (CAR) T-Zellen

Erfahren Sie die räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit photoaktivierbarem Peptid-MHC. Diese bildgebende Methode ermöglicht präzise Untersuchungen polarisierter Signalwege in T-Lymphozyten.

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

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