Name: Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Lernen Sie die optische Kontrolle neuronaler Proteine mit genetisch kodierten unnatürlichen Aminosäuren in Hippocampus-Neuronen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Signalwege mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

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Wir danken Dr. S. Szobota für die hilfreiche Diskussion über Neuronenkultur und Ca-P-Transfektion. L.W. dankt für die Unterstützung durch den Salk Innovation Grant, das California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1) und die National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Alle Verfahren in der aktuellen Studie wurden unter Verwendung von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt Protokolle für die Behandlung der Tiere für biologische Studien, La Jolla, CA am Salk Institute genehmigt 1. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des resultierenden PIRK in den Primary Neuronal Culture <ol><li> DNA-Konstruktion <ol><li> Wählen Sie eine Zielstelle von Kir2.1 für Uaa Einbau. Exploit vor Wissen und Informationen über Struktur und Funktion von Kir2.1, so dass der gewählte Standort mit dem photoresponsive Uaa Incorporated ermöglicht eine optische Modulation von Kir2.1 - Funktion 21. </li><li> Konstruieren Sie eine rekombinante DNA, die für Kir2.1-Gen mit dem gewählten Standort der TAG-Amber-Stopcodon mutiert. Verwenden Sie die Standard - Klonierungstechniken 25 der Kir2.1-TAG - DNA in einem Säugetier - Expressionsplasmid zu klonen. </li><li> Clone tRNA / Synthetase-Gene, die für die Uaa spezifisch sind und übernehmen die Uaa als Reaktion aufdas TAG - Stopcodon in ein anderes Säugetier - Expressionsplasmids 21. Anmerkung: Für optimale Uaa Inkorporation unterschiedliche Promotoren und Kombinationen von Genkassetten (für tRNA-Synthetase und Kir2.1) können in verschiedenen Plasmiden getestet werden. </li><li> Erhalten Sie qualitativ hochwertige Plasmid-DNA unter Verwendung von Miniprep oder Maxipräp kommerzielle Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers. Etwa 1,9 des 260/280 Verhältnis ist optimal für die gereinigte DNA. Wenn nötig, führen Sie eine Agarose - Gelelektrophorese 25 Reinheit der prepped DNA zu überprüfen. Supercoiled Plasmid-DNA mit hoher Reinheit sind am besten für die neuronale Transfektion. </li></ol></li><li> Kultur Ratten-Hippocampus Primary Neurons <ol><li> Platz Glasplättchen (Kreise, 12 mm Durchmesser) in 24-Well-Platten, ein Deckglas auf jede Vertiefung und jede Schicht gut mit 250 ul von 0,5 mg / ml Poly-D-Lysin (in 100 mM Boratpuffer: 1,24 g Borsäure Säure und 1,90 g Natriumtetraborat in 400 ml H 2 O oder ddH 2 destilliertes deionisiertes </sub&gt; O bei pH 8,5) über 10 Stunden bei Raumtemperatur, abgedichtet. Bereiten Sie etwa 10-12 beschichtete Deckgläser pro Welpe. </li><li> Am Tag der Dissektion, sammeln neonatalen Gehirn von postnatalen Rattenjungen (1-4 postnatalen Tag), nachdem sie mit Isofluran und enthaupten anesthetizing. Anesthetize die Welpen in einer anesthetization Kammer mit Isofluran (2-4%). Warten Sie, bis sie das Bewusstsein verlieren und nicht auf taktile Reize zu reagieren und der Pfoten zu kneifen. </li><li> Unter Verwendung der Standardtechnik 26, sezieren Hippocampi aus dem Gehirn in warmer (~ 37 ° C) Kochsalzlösung (10 mM HEPES und 20 mM D-Glucose zugesetzt in Hanks balanced salt solution), und sammeln Hippocampi in einem konischen Röhrchen mit 4,5 ml warmem saline . </li><li> Hinzufügen 500 ul 2,5% Trypsin in die Hippocampi (0,25% Trypsin endgültige Konzentration), und inkubiere für 10 min in einem Wasserbad bei 37 ° C. </li><li> Spülen Sie das Gewebe mit einer Kochsalzlösung (3 x 10 ml) und verreiben. </li><li> Recover die dissoziierten Neuronen in 1 ml wArm Nährmedien Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) enthält, 21,2 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 2% B-27 und 0,1% Serum-Extender. Hinweis: In L-Glutamin und B-27 am Tag der Dissektion frischen Wachstumsmedien herzustellen. </li><li> Zähle die Neuronen mit einem Hämozytometer und Platten sie auf Deckgläschen in 24-Well - Platten bei 1,0-1,5 x 10 5 Zellen / well Dichte mit 500 &amp; mgr; l Wachstumsmedium , nachdem es durch einen 40 um Nylon - Mesh filtriert. </li><li> Inkubiere die neuronale Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 2-3 Wochen. Für das beste Ergebnis zu vermeiden, so viel wie möglich während der Inkubation der Kultur zu stören. </li></ol></li><li> Calciumphosphat (Ca-P) Transfektion von primären neuronalen Kultur <ol><li> Make - Stammlösungen und lagern bei 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -Bis [2-Hydroxy-ethyl] -2-aminoethansulfonsäure) Puffer (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); sterile ddH 2 O; steril 1 N NaOH. </li><li> Am Tag der Transfektion machen frisch 2,5 M CaCl 2 -Lösung in ddH 2 O und Sterilfilter mit 0,22 &amp; mgr; m - Filter. Machen frisch 2x BES-gepufferter Salzlösung (BBS) Puffer, der 50 mM BES, 1,5 mM Na 2 HPO 4 und 280 mM NaCl bei pH 7,00 (pH - Einstellung mit NaOH) und Sterilfilter mit 0,22 &amp; mgr; m - Filter. Hinweis: Berechne die Menge an CaCl &amp; sub2 ; -Lösung und BBS - Puffer für die Anzahl der Deckplättchen je transfiziert werden. Schauen Sie auch bei 1.3.4. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturwachstumsmedium mit 500 &amp; mgr; l frisch Transfektion Wachstumsmedien vorgewärmten. (Transfektionsmedien mit MEM und 21,2 mM D-Glucose hergestellt werden). Hinweis: Verwenden Sie nicht das alte Medien wegwerfen. </li><li> Berechnen Sie die Menge von ddH 2 O und Vorbereitung zu geben, um die Transfektion Lösung (33 &amp; mgr; l pro jedes Deckglas) mit 1,65 ul CaCl 2, 0,7 ug DNA zu machen, und 16,5 &amp;# 181; l 2x BBS. </li><li> Bereiten Sie die Transfektionslösung, unmittelbar bevor es zu der Kultur hinzugefügt wird. Zur Vorbereitung ersten CaCl 2 und ddH 2 O verbinden , während sie langsam das Rohr gerührt. Weiter Rühren und langsam DNA in die Lösung hinzufügen. Schließlich fügen Sie 2x BBS-Puffer tropfenweise unter Rühren. </li><li> Sofort 30 ul der Lösung in jedes Deckglas neuronaler Kultur Transfektion hinzuzufügen. </li><li> Rock the Kulturschale ein paar Mal die Lösung zu mischen und bei 35 ° C in einem 5% CO 2 inkubieren: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 45 min-1 Std. Nach Neuronen mit der Transfektion Lösung inkubiert werden, sehr feine Ca-P-Ausscheidungen würde eine Schicht bedeckt Neuronen bilden. </li><li> Ersetzen die Transfektionsmedium mit 500 &amp; mgr; l vorgewärmten Waschpuffer (135 mM NaCl, 20 mM HEPES, 4 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 10 mM Glucose bei pH 7,3, sterile bei 35 gefiltert mit 0,22 &amp; mgr; m-Filter) und Inkubation6; C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 15-20 min. Ca-P-Ausscheidungen würden nach dem Waschschritt verschwinden. </li><li> Ersetzen Sie den Waschpuffer mit 500 ul frischem Wachstumsmedium. Auch das Wachstumsmedium mit dem gespeicherten Original-Medien ersetzen. </li><li> Fügen Sie die Uaa Cmn (vorgemischt in 50 &amp; mgr; l warme Wachstumsmedien) zu der Kultur 1 mM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Inkubieren der transfizierten Kultur bei 35 ° C in einem 5% CO 2: 95% Luft befeuchteten Inkubator für 12-48 h vor Assays. </li></ol></li><li> Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung <ol><li> Bereiten Sie extra / intrazellulären Lösungen. Die intrazelluläre Lösung enthält 135 mM Kaliumgluconat, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2,56 mM K 2 ATP und 0,3 mM GTP Li 2 bei pH 7,4. Die extrazelluläre Aufzeichnungslösung enthält 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 10 mM HEPES bei pH 7,4. </li><liMikroskop ausgestattet mit 4-fach und 20-fach Ziele, Differentialinterferenzkontrast (DIC) und mCitrine Filter:&gt; die Elektrophysiologie Rig für whole-cell Patch-Clamp-Set up (Anregung: 495/10 nm, Emission: 525/25 nm); Manipulator; Patch-Clamp-Verstärker; Digitalisierer; Datenerfassungs und Analyse-Software. <ol><li> Installieren einer Leuchtdiode (LED) mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop an der rig Licht von 1 cm entfernt in einem Winkel von 45 ° auf den Brennpunkt zu liefern. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser. </li></ol></li><li> Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen. Folgen Sie Anweisungen des Herstellers der Mikropipette Puller einzurichten. <ol><li> Um zu testen, Pipette Widerstand, füllen Sie zuerst die Pipette mit der intrazellulären Lösung und positionieren Sie es auf dem Elektrodenhalter. Tauchen Sie die Pipette in eine 35-mm-Kulturschale mit der extrazellulären Lösung gefüllt ist, platziert auf dem Mikroskop platform. Tauchen eine Masseelektrode in die Schale, eine Schaltung zu vervollständigen. </li><li> Schalten Sie den Verstärker / Digitalisierer und eine Datenerfassungs-Software starten. Monitor-Pipette Widerstand mit einem Membran-Testprotokoll. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Deckglas des Neurons Kultur aus dem Inkubator heraus und spülen Sie einmal in der extrazellulären Lösung. Mit Vakuumfett, halten Sie das Deckglas in der Mitte einer 35 mm Kulturschale mit dem frischen extrazellulären Lösung gefüllt. </li><li> Legen Sie das Deckglas / Schale auf dem Elektro Mikroskop-Plattform. </li><li> Unter Verwendung der Standard - Patch - Clamp - Techniken, Patch ein Neuron mit mCitrine Fluoreszenz 27. Nehmen Sie die neuronale Aktivität mit Stromzange (I-Klemme) -Methode. Zuerst stellen Sie die Ruhepotential auf etwa -72 mV durch einen kleinen Strom zu injizieren. Dann einen Schritt Strom (10-200 pA) injizieren Dauerfeuer (5-15 Hz) der Aktionspotentiale zu induzieren. </li><li> Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, einen Impuls (a sin blinkengle Puls sec Dauer 100 ms -1) der LED mit dem Neuron Licht während der Aufnahme, und sehen , ob Aktionspotentiale betroffen sind. </li><li> In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob Aktionspotentiale gewonnen werden. </li></ol></li></ol> 2. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des Resultierende PIRK in der embryonalen Maus - Gehirn - In Vivo <ol><li> DNA-Konstruktion <ol><li> Entwerfen Sie die Plasmid-DNA in ähnlicher Weise wie in Schritt 1.1. Für in - vivo - Expression, einen starken Promotor wie CAG (Huhn beta-Aktin - Promotor mit CMV - Enhancer) verwenden. </li><li> Reinige DNA mit einer Endotoxin-freien maxiprep kommerziellen Kit nach dem Protokoll des Herstellers. Führen Phenol-Chloroform - Extraktion , gefolgt von Ethanolfällung 25 zu erwerben , extrem hohe Qualität DNA (kondensiert 2-5 ug / ul). </li></ol></li><li> In Utero Elektroporation zur embryonalen Maus - Neocortex Hinweis: Die grundlegende technique für in utero Elektroporation wurde zuvor 28 beschrieben. <ol><li> Anesthetize eine zeitlich schwangere Maus am embryonalen Tag 14,5 (E14,5) mit Natriumpentobarbital (intraperitoneale Injektion, 50 ug pro Körpergewicht Gramm) oder Isofluran (Inhalation, 2-4%). Überwachung der Narkosetiefe durch Verlust des Bewusstseins Überprüfung und keine Reaktion auf taktile Reize und Quetschen der Pfoten. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie. aussetzen Sie vorsichtig die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen. </li><li> Injizieren etwa 1 &amp; mgr; l DNA-Lösung (2-5 ug / ul jedes Plasmids, abhängig von dem Konstrukt) in den lateralen Ventrikel jedes littermate mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. In den meisten Fällen werden etwa 60-80% der gesamten Embryos injiziert. </li><li> Elektroporation die Embryonen mit einem -Elektroporator (33-35 V, 50 ms Dauer, 950 ms Intervall, 4-8 Pulse). </li><li> Rückgabe der Uterushörner in die Bauchhöhle leicht mit fürCEPS und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen. </li></ol></li><li> Uaa Mikroinjektions <ol><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Bauchmittellinie wieder an E16.5 und sanft die Gebärmutterhörner mit einer Pinzette und Fingerspitzen aus. </li><li> Injizieren etwa 2-5 &amp; mgr; l Cmn-Ala (500 mM) zu dem elektroporierten Seite oder beiden Seiten des lateralen Ventrikels mit einer Glaspipette durch die Gebärmutterwand eingeführt. Cmn Bioverfügbarkeit, verwenden Sie das Dipeptid Cmn-Ala (CMN-Alanin) Zur Erhöhung der Cmn 21 in vivo zu liefern. </li><li> Auch hier geben die Gebärmutterhörner in die Bauchhöhle vorsichtig mit einer Pinzette und Fingerspitzen. Nähen Sie die Muskelwand und dann die Haut mit chirurgischem Naht zu ermöglichen, die Embryonen Entwicklung fortzusetzen. </li></ol></li><li> Erhalten Akute Hirnschnitten <ol><li> Machen Sie 1 L künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) , enthaltend 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,3 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl <sub&gt; 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26,2 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose bei pH 7,3. </li><li> Nehmen Sie 200 ml ACSF und Schnellgefrier bei -80 ° C für 20-30 min. Bubble der Rest ACSF mit 5% CO 2: 95% O &amp; sub2 ; -Gas bei Raumtemperatur. </li><li> Vorbereiten und chirurgische Werkzeuge sterilisieren Gehirne von den Embryonen zu ernten. Auch einen Eimer mit Eis vorzubereiten. </li><li> Machen Sie ~ 100 ml 4% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Lösung in einem Kolben durch Erhitzen in einer Mikrowelle. Das Abkühlen der Lösung für ca. 5 Minuten, bevor es zu erstarren beginnt. </li><li> Euthanize die Maus 12-24 Stunden nach Cmn-Ala Injektion von CO 2 Überdosierung. Machen Sie große Einschnitte in der Bauchbereich und sezieren aus die elektroporierten / mikroinjiziert Embryonen aus der Gebärmutter mit einer feinen Schere und Pinzette. </li><li> Ernte Gehirne von den Embryonen mit einer feinen Schere und Pinzette. </li><li> Legen Sie jedes Gehirn auf einer 10 cm Kulturschale auf dem Eis Eimer gelegt. Teilen Sie zwei Hemisphären eine scharfe Klinge, und legen Sie jeweilsHalbkugel auf der Schale mit der Medianebene der Boden der Schale berührt. Schnell die Agarose-Lösung über Gehirne übergießen (ca. 500 &amp; mgr; l pro Hemisphäre). </li><li> Mit einem scharfen Messer, schneiden Quadrat der Agarose um ein Gehirn ein Gehirn-embedded Agaroseblock zu machen. </li><li> Mit Gewebekleber, kleben Sie die Midsagittalebene Oberfläche des Agaroseblock an einer Halterung für Vibratom. Füllen Sie die Vibratom Kammer mit vorgekühlten ACSF und schneiden 200 um sagittalen Hirnschnitten. </li><li> Inkubieren Scheiben in acute ACSF mit 3 mM myo - Inositol ergänzt, 0,4 mM Ascorbinsäure und 2 mM Natriumpyruvat bei 33 ° C für 42 min , während sie mit 5% CO 2 sprudelnden: 95% O &amp; sub2 ; -Gas. </li><li> Nach 42 min, drehen Sie die Heizung und weiter zu brüten die Scheiben bei Raumtemperatur mit sprudelnden ab. Beginnen whole-cell Patch Aufzeichnung mindestens 15 min, nachdem die Heizung abgeschaltet wird. </li></ol></li><li> Ganze Zelle Aufnahme mit Lichtaktivierung <ol><li> Bereiten Sie die intraczellulären Lösung , enthaltend 130 mM Kaliumgluconat, 4 mM MgCl 2, 5 mM HEPES, 1,1 mM EGTA, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM Natriumkreatinphosphat und 0,1 mM Na 3 GTP bei pH 7,3 mit KOH eingestellt. </li><li> Ziehen Sie Patch-Pipetten aus Glaselektroden einen kommerziellen Mikropipette Abzieher 3-6 MOhm Pipette Beständigkeit aufweisen. </li><li> Stellen Sie die Scheibe Elektro Rig für Ganzzell-Patch-Clamping und superfuse die Aufnahmekammer mit ACSF bei 2 ml / min Rate mit einer Perfusions-Pumpe. Passen Sie die Raumtemperatur auf etwa 33 ° C. Hinweis: Die Scheibe Elektro rig ist mit einer Perfusionskammer ausgestattet, einem Wasserimmersionsobjektiv und einem Temperaturregler. Auch GFP-Filter (Anregung: 480/30 nm, Emission: 535/40 nm) und mCherry Filter (Anregung: 580/20 nm-Emission: 675/130 nm) erforderlich. <ol><li> Installieren Sie eine LED mit Emission von 385 nm durch das Mikroskop auf der Bohrinsel im 45 ° von 1 cm entfernt Licht auf den Brennpunkt zu liefernWinkel. Überprüfen Sie die Leistung der LED mit einer Lichtleistungsmesser. </li></ol></li><li> Pick vorsichtig ein Gehirn Scheibe mit einer Glaspipette und in der Perfusionskammer auf. Halten Sie die Scheibe mit einer Harfe nach unten. </li><li> Patch Ein Neuron mit mCherry / GFP - Fluoreszenz aus dem Neokortex Bereich 27. Nehmen Sie PIRK Aktivität voltage clamp mit (V-Klemme) -Methode. Erstens halten das Membranpotential bei -60 mV. Dann Rekordströme an festen negativen Membranpotentialen (-100 mV) oder Spannungsrampen (-100 mV bis +40 mV). Insbesondere überwachen Kir2.1 spezifische Einwärtsströme bei -100 mV. </li><li> Manuell oder die Datenerfassungssoftware verwenden, blinken einen Impuls (einen einzigen Impuls von sec Dauer 100 ms -1) von LED - Licht auf das Neuron während der Aufnahme, und sehen , ob PIRK Proteine ​​aktiviert werden. Sobald PIRK aktiviert ist, würde Einwärtsströme bei -100 mV deutlich erhöhen. </li><li> In 0,5 mM BaCl 2 in das Bad und überprüfen , ob PIRK wieder inaktiviert wird. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um eine effektive Photomodulations erreichen, ist der erster wichtiger Schritt, um zu entscheiden, wo das Licht ansprechende Uaa in dem Zielprotein zu integrieren. Strukturelle und funktionelle Informationen des Zielproteins ist sehr hilfreich, um die Auswahl von Kandidaten Seiten zu führen. Zugleich würde der Zweck der Lichtregulierung bestimmen, welche Seite am besten geeignet ist. Nach der Auswahl von Kandidaten - Websites, empfehlen wir die Standorte in Säugetierzelllinien wie die menschliche embryonale Nieren (HEK ...

Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation bietet Photo größere zeitliche und räumliche Auflösung bei minimaler Störung des physiologischen Systems von Proben. Seit der Demonstration Laser mit Neuronen im Jahr 1971 1, viele kreative Möglichkeiten zu stimulieren erfunden worden exogen mit Licht neuronale Aktivität zu kontrollieren. Optische Freisetzung von photoaktivierbaren Agonisten ist seit langem verwendet worden , um Liganden 2,3,4 physiologische Antwort des neuronalen Netzes zu untersuchen. Diese Technik hat Spezifität begrenzt durch Diffusion von caged-Agonisten. Genetische Spezifität wird durch ektopisch exprimieren , lichtempfindliche Opsin Kanäle erreicht und Pumpen 5,6,7, und es wurde erfolgreich zu modulieren ausgewählte neuronale Netzwerke in verschiedenen Modellorganismen eingesetzt. Allerdings würde es schwierig sein, diese Methode anzuwenden, optisch auf verschiedene andere neuronale Proteine ​​steuern, da Photoreaktivität von den Opsin Proteinen an andere Proteine ​​Pfropfung would intensiv Engineering erfordern, die die natürlichen Eigenschaften des Proteins untersuchten verändern können. Chemisch Anbindehaltung ein exogener lichtempfindlichen Ligand an ein Protein einen anderen Weg , um die Funktionalität von Kanalproteinen 8,9,10 zu steuern unter Beweis gestellt hat. Der Ligand wird präsentiert oder von der Bindungsstelle des Proteins durch die Photoisomerisierung des Azobenzoleinheit zurückgezogen. Anbinden Chemie beschränkt die Anwendung vor allem auf der extrazellulären Seite der Membranproteine, mit Ausnahme der intrazellulären Seite und intrazellulären Proteinen. Lichtempfindliche UAAs, nachdem sie in Proteine ​​eingebaut werden, eine allgemeine Strategie Proteine ​​mit Licht zu manipulieren. In frühen Bemühungen, tRNAs chemisch acyliert mit photoaktivierbaren UAAs in Xenopus - Oozyten mikroinjiziert wurden 11, die UAAs in Membranrezeptoren und Ionenkanäle zu integrieren , die das Verständnis ihrer Struktur-Funktionsbeziehungen 12,13,14 vorangebracht haben.Diese Mikroinjektions Ansatz ist vor allem auf große Eizellen begrenzt. Genetische Einbau eines Uaa umgeht die technisch anspruchsvolle tRNA Acylierung und die Mikroinjektion durch eine orthogonale tRNA / Synthetase - Paar verwenden, die die Uaa durch endogene Proteintranslation in lebenden Zellen 15,16,17,18 enthält. Uaa Einbau in neuronale Proteine ​​wurde in primären Neuronen und neuronalen Stammzellen 19,20 demonstriert. In jüngerer Zeit wurde auf Licht ansprechende Uaa genetisch in ein neuronales Protein im Gehirn von Säugetieren in vivo zum ersten Mal 21 eingebaut. Diese Fortschritte ermöglichen es, neuronale Proteine ​​mit UAAs in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal Kir2.1 ist ein starker Gleichrichter, der K + -Ströme mehr geht leicht in als aus der Zelle, und es ist wichtig bei der Regulierung der physiologischen Prozessen einschließlich Zell Erregbarkeit, Gefäßtonus, Herzfrequenz, renal Salzfluss und Insulinfreisetzung 22. Überexpression von Kir2.1 hyperpolarisiert die Membranpotential des Zielneurons, das weniger erregbar 23,24 wird. Optisch Kir2.1 in seiner nativen Zellen kontrollieren, Kang et al. Genetisch a photo-responsive Uaa in Kir2.1 inkorporiert in Säugerzellen exprimiert, Neuronen und embryonalen Maushirnen 21. Ein kurzer Lichtimpuls konnte die Uaa in einer natürlichen Aminosäure Cys, wodurch die Ziel Kir2.1-Protein aktivierenden zu konvertieren. Wenn diese fotoinduzierbaren einwärtsgleichrichtenden Kalium (PIRK) Kanalprotein in Ratten-Hippocampus primäre Neuronen exprimiert wurde, unterdrückt es neuronale Aktivität in Reaktion auf Lichtaktivierung. Außerdem wurde gemessen, die PIRK Kanal wurde in der embryonalen Maus Neocortex und das lichtaktivierte PIRK Strom in kortikalen Neuronen exprimiert. Die erfolgreiche Umsetzung der Uaa Technologie in vivo im Gehirn von Säugetieren öffnet die Tür zu optisch neuronale Proteine ​​steuernin ihrer natürlichen Umgebung, die optische Präparation neuronaler Prozesse und Mechanismen auf molekularer Ebene ermöglichen. In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur genetischen Einbau von UAAs in primäre Neuronen in der Kultur und in der embryonalen Gehirn der Maus in vivo. Die photoresponsive Uaa Cmn und Kir2.1 werden verwendet, um den Prozess zu veranschaulichen. Methoden erfolgreich Uaa Einbau und optische Kontrolle der neuronalen Proteinaktivität sind vorgesehen, um beurteilen zu können. Dieses Protokoll stellt eine klare Anleitung zur genetisch kodierend UAAs in Neuronen und in vivo und in optisch neuronale Proteinfunktion über eine auf Licht ansprechende Uaa regulieren. Wir erwarten , dass dieses Protokoll , um die Annahme der in vivo Uaa Technologie für Neurowissenschaften und optogenetische biologische Untersuchungen zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Deckgläser, Kreise, 12 mm, Dicke 0,13-0,17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysin</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Irisspatel gebogen</td><td>Fine Science Tool</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermesser - feine abgewinkelte Spitze</td><td>Fine Science Tool</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro; m Zellsieb</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>LED-LICHTQUELLE &ndash; Schwarze LED 385</td><td>Prizmatix GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, niedriger Schmelzpunkt, analytische Qualität</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

optische kontrolle eines neuronal protein eine genetisch kodierter unnatürliche aminosäure in neurons verwendung

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation ist eine nicht-invasive Methode zur Kontrolle biologischer Ereignisse mit hervorragender räumlicher und zeitlicher Auflösung. Neue Methoden sind erwünscht, um endogene Proteine, die in ihrer natürlichen Umgebung exprimiert werden, zu photoregulieren. Hier stellen wir einen Ansatz vor, um die Funktion eines neuronalen Proteins direkt in Neuronen mit Hilfe einer genetisch kodierten unnatürlichen Aminosäure (Uaa) optisch zu steuern. Durch die Verwendung eines orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares zur Unterdrückung des bernsteinfarbenen Codons wird ein photoreaktives Uaa 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl-cystein (Cmn) ortsspezifisch in die Pore eines neuronalen Proteins Kir2.1, einen nach innen gerichteten Kaliumkanal, eingebaut. Das sperrige Cmn blockiert physikalisch die Kanalpore, wodurch Kir2.1 nicht leitend wird. Die Lichtbeleuchtung wandelt Cmn sofort in eine kleinere natürliche Aminosäure Cys um und aktiviert die Kir2.1-Kanalfunktion. Wir exprimieren diese photo-induzierbaren inwardly rectifying Kalium (PIRK) Kanäle in hippokampalen primären Neuronen der Ratte und zeigen, dass die Lichtaktivierung von PIRK das neuronale Feuern aufgrund des Ausflusses von K+ Strom durch die aktivierten Kir2.1 Kanäle stoppt. Mit Hilfe der In-utero-Elektroporation exprimieren wir PIRK auch im embryonalen Neokortex der Maus in vivo, was die Lichtaktivierung von PIRK in neokortikalen Neuronen zeigt. Die genetische Kodierung von Uaa unterliegt keinen Einschränkungen hinsichtlich des Zielproteintyps oder der zellulären Lokalisation, und eine Familie von photoreaktiven Uaas steht für die Modulation verschiedener natürlicher Aminosäurereste zur Verfügung. Diese Technik hat somit das Potenzial, allgemein auf viele neuronale Proteine angewendet zu werden, um eine optische Regulation verschiedener Prozesse im Gehirn zu erreichen. Das aktuelle Protokoll stellt ein zugängliches Verfahren für den komplizierten Uaa-Einbau in Neuronen in vitro und in vivo vor, um eine Photokontrolle der neuronalen Proteinaktivität auf molekularer Ebene zu erreichen.

Um genetisch eine Uaa in ein Protein in den Nervenzellen übernehmen, ist der erste wichtige Schritt ist, entsprechende Gen zu entwerfen die Gene zu liefern und zu exprimieren effizient in Neuronen. Es gibt drei genetische Komponenten für Uaa Einarbeitung: (1) das Ziel-Gen mit dem TAG amber Stop-Codon an der gewählten Stelle eingeführt für Uaa Einbau (2) eine orthogonale tRNA, die das mutierte TAG Stopcodon, und (3) eine orthogonale Aminoacyl zu erkennen -tRNA Synthetase die Uaa auf die o...

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion eines neuronalen Proteins mithilfe einer genetisch kodierten, unnatürlichen Aminosäure in Neuronen optisch zu steuern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Beteiligung eines spezifischen neuronalen Proteins an der neuronalen Signalübertragung bei der Gehirnfunktion mit räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie potenziell auf verschiedene neuronale Proteine angewendet werden kann, um unterschiedliche neuronale Prozesse optisch zu regulieren.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Hippocampus-Neuronen auf Deckgläser in einer 24-Loch-Platte mit 500 µL Wachstumsmedium ausplattieren, nachdem dieses durch einen 40 µm Nylon-Mesh gefiltert wurde. Anschließend inkubieren Sie die neuronale Kultur bei 35 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft für 2 bis 3 Wochen. Am Tag der Transfektion stellen Sie eine frische 2,5-molare Calciumchlorid-Lösung in zweifach destilliertem Wasser her und filtrieren sie steril mit einem 0,22-µm-Filter.Als Nächstes frisches 2X BBS bei pH 7 herstellen und mit einem 0,22-Mikrometer-Filter sterilfiltrieren. Danach das Kulturwachstumsmedium durch 500 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Transfektionsmedium ersetzen und das alte Wachstumsmedium nicht verwerfen. Die Transfektionslösung unmittelbar vor dem Zugabe zum Kulturansatz herstellen, indem Calciumchlorid und doppelt destilliertes Wasser unter leichtem Schütteln des Reaktionsgefäßes kombiniert werden.Setzen Sie die Sch&uuml;ttelung des Reaktionsgef&auml;&szlig;es fort und geben Sie langsam die DNA in die L&ouml;sung. F&uuml;gen Sie anschlie&szlig;end den 2X BBS-Puffer tropfenweise hinzu. Die Herstellung des 2X BBS-Puffers ist ein entscheidender Schritt bei der Calciumphosphat-Transfektion, und es empfiehlt sich, den optimalen pH-Wert des 2X BBS-Puffers zwischen 6,90 und 7,15 f&uuml;r neue DNA-Konstrukte oder -Pr&auml;parationen zu kalibrieren.Fügen Sie anschließend umgehend 30 Mikroliter der Transfektionslösung zu jeder Deckglasprobe der neuronalen Kultur hinzu. Bewegen Sie die Kulturschale mehrmals vorsichtig, um die Lösung zu vermischen, und inkubieren Sie sie bei 35 Grad Celsius für 45 Minuten bis eine Stunde. Nach etwa einer Stunde sollte sich eine dünne Schicht aus Calciumphosphat-Ausfällungen über die Neuronen erstrecken.Als Nächstes ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch 500 Mikroliter vorgewärmtes Waschpuffer und inkubieren Sie es bei 35 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten. Die Calciumphosphat-Fällungen sollten nach der Wäsche verschwunden sein. Ersetzen Sie nun den Waschpuffer durch 500 Mikroliter frisches Wachstumsmedium.Anschließend das Wachstumsmedium durch das aufbewahrte ursprüngliche Medium ersetzen. Danach den ungewöhnlichen Aminosäurebaustein Cmn in 50 µL warmer Wachstumsmedium vormischten und der Kultur zugeben, um eine Endkonzentration von 1 mmol/L zu erreichen. Die transfizierte Kultur vor der Aufzeichnung 12 bis 48 Stunden bei 35 °C inkubieren.Bereiten Sie bei diesem Verfahren die extrazelluläre und intrazelluläre Lösung vor. In unserer Versuchsanordnung ist die LED mit einer Emission von 385 Nanometern neben dem Mikroskop installiert, um Licht in einem Abstand von einem Zentimeter vom Fokuspunkt in einem Winkel von 45 Grad zuzuführen. Ziehen Sie anschließend einige Patch-Pipetten mit einer Glaselektrode mithilfe eines Mikropipettenzuggeräts. Anschließend nehmen Sie eine Deckglasprobe mit Neuronenkulturen aus dem Inkubator und spülen sie einmal mit der extrazellulären Lösung aus. Spülen Sie die Messanordnung gründlich mit extrazellulärer Lösung. Danach platzieren Sie das Deckglas auf der Elektrophysiologie-Mikroskopplattform unter Verwendung standardmäßiger Patch-Clamp-Techniken.Patchen Sie ein Neuron, das mit M-Citrin-Fluoreszenz markiert ist. Nehmen Sie danach die neuronale Aktivität mit der Strom-Klammer-Methode auf. Stellen Sie zunächst das Ruhepotential auf etwa minus 72 Millivolt ein.Danach injizieren Sie einen Stufenstrom, um eine kontinuierliche Feuerung von Aktionspotentialen bei fünf bis 15 Hertz auszulösen. Während der Aufzeichnung geben Sie einzelne LED-Pulse an das Neuron ab und überwachen die Veränderungen seiner Aktionspotentiale. Anschließend geben Sie 0,5 Millimolar Bariumchlorid in das Bad, um die Aktionspotentiale wiederherzustellen.Bei akuten Gehirnschnitten patchen Sie ein Neuron mit M-Cherry-GFP-Fluoreszenzen aus der neokortikalen Region. Nehmen Sie dann die PIRK-Aktivität mittels der Spannungsanstiegsmethode auf. Überwachen Sie dabei die Kir2.1-spezifischen Einwärtsströme bei minus 100 Millivolt.Dann geben Sie einzelne LED-Pulse an das Neuron ab, während Sie gleichzeitig aufzeichnen, und überwachen Sie, ob PIRK-Proteine aktiviert werden. Sobald PIRK aktiviert ist, würden die einwärts gerichteten Ströme bei minus 100 Millivolt signifikant ansteigen. Am Ende fügen Sie 0,5 Millimolar Bariumchlorid in das Bad hinzu und überprüfen, ob PIRK inaktiviert ist.Hier gezeigte exemplarische Bilder gesunder hippocampaler neuronaler Kulturen von Ratten. Und zwei gesunde Neuronen mit kugeligen Zellkörpern sowie ausgeprägten Dendriten und Axonen. Dies sind die DIC- und Fluoreszenzbilder von hippocampalen Neuronenkulturen der Ratte in vitro, die zur Expression von PIRK ohne CMN transfiziert wurden.Bei Anwesenheit von einem Millimolar CMN sind transfizierte Neuronen in der Lage, vollständige PIRK M-Citrin-Proteine zu exprimieren und zeigen somit grüne Fluoreszenz. Und hier sehen Sie ein Beispiel eines einzelnen Lichtimpulses, der die Aktivität eines PIRK-exprimierenden hippokampalen Neurons unterdrückt. Diese Fluoreszenzbilder von kortikalen Neuronen embryonaler Mäuse zeigen die erfolgreiche Einbindung von CMN in GFP- und Kir2.1-Proteine in vivo.In diesem Diagramm wird die lichtabhängige Aktivierung von PIRK anhand der Ströme dargestellt, die aus neokortikalen Neuronen der Maus aufgezeichnet wurden. Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Gehirnerkrankungen, die durch eine Fehlfunktion spezifischer neuronaler Proteine verursacht werden, beispielsweise durch mutiertes Kir2.1 bei dem Andersen-Syndrom, da diese Technik dabei hilft, aufzuklären, welche neuronalen Schaltkreise durch Kir2.1-Defizite betroffen sind. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um die Funktion neuronaler Proteine im lebenden Neuron mit hoher Spezifität durch Licht zu steuern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unnatürliche Aminosäuren in Proteine von Neuronen einbauen kann, um eine lichtgesteuerte Kontrolle über neuronale Proteine des Interesses zu erreichen.

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Controlling und Analyse von neuronalen...

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Adult-geboren Neuronen exprimiert ChR2 kann in Scheiben elektrophysiologischen Vorbereitungen manipuliert werden, um ihren Beitrag zur Funktion des olfaktorischen neuronale Schaltkreise zu untersuchen.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Nehmen Sie eine Kultur von Corynebacterium glutamicum, transformiert mit einem Plasmid, das ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts der Ribonukleinsäure-Antiterminator- oder RAT-Sequenz trägt, in einer Multiwell-Platte.Während der Transkription bildet die RAT-RNA eine Stammschleifenstruktur, die die RNA-Polymerase blockiert und die Expression des Reportergens stoppt.Das Plasmid exprimiert auch konstitutiv LicV, ein Fusionsprotein, das das RAT-RNA-bindende Protein LicT und die...

Optogenetische Kontrolle der Genexpression in Corynebacterium glutamicum

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Dieser Artikel beschreibt eine Verbesserung der konventionellen Voltage-Clamp Fluorometry (VCF), bei der fluoreszierende unnatürliche Aminosäuren (fUAA) anstelle von Maleinimidfarbstoffen verwendet werden, um strukturelle Umlagerungen in Ionenkanälen zu untersuchen. Das Verfahren umfasst Xenopus- Oozyten-DNA-Injektion, RNA / fUAA-Coinjektion und gleichzeitige Strom- und Fluoreszenzmessungen.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Die zuverlässige Kontrolle lichtempfindlicher Säugetierzellen erfordert die Standardisierung optogenetischer Methoden. Um dieses Ziel zu erreichen, skizziert diese Studie eine Pipeline von Genschaltkreiskonstruktion, Zelltechnik, optogenetischem Gerätebetrieb und Verifikationsassays, um die Untersuchung der lichtinduzierten Genexpression unter Verwendung eines optogenetischen Genschaltkreises mit negativer Rückkopplung als Fallstudie zu standardisieren.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung einer technisch hergestellten Blue-Light-aktivierten allosterischen Schalterdomäne (LightR) zur reversiblen raumzeitlichen Kontrolle der Proteinaktivität. Unter Verwendung der Src-Tyrosinkinase als Modell bietet diese Studie ein ausgeklügeltes Protokoll zur Entwicklung und Charakterisierung von lichtreguliertem Src (LightR-Src). Es zeigt die Vielseitigkeit dieses Ansatzes über Enzymklassen hinweg.

Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

Lernen Sie die optische Kontrolle neuronaler Proteine mit genetisch kodierten unnatürlichen Aminosäuren in Hippocampus-Neuronen. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Signalwege mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

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