Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion eines neuronalen Proteins mit Hilfe einer genetisch kodierten, unnatürlichen Aminosäure in Neuronen optisch zu steuern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen über den Beitrag eines spezifischen neuronalen Proteins zur neuronalen Signalübertragung in der Gehirnfunktion mit räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das Potenzial hat, auf verschiedene neuronale Proteine angewendet zu werden, um eine optische Regulation verschiedener neuronaler Prozesse zu erreichen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Hippocampus-Neuronen auf Deckgläser in einer 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern Wachstumsmedium plattieren, nachdem Sie durch ein 40-Mikrometer-Nylonnetz filtriert haben. Danach inkubieren Sie die neuronale Kultur bei 35 Grad Celsius in einem mit fünf Prozent Kohlendioxid und 95 Prozent Luft befeuchteten Inkubator für 2 bis 3 Wochen. Am Tag der Transfektion wird eine frische 2,5-molare Calciumchloridlösung in doppelt destilliertem Wasser hergestellt und mit einem 0,22-Mikrometer-Filter sterilfiltriert.

Stellen Sie anschließend frisches 2X BBS bei pH 7 her und filtern Sie es mit einem 0,22-Mikrometer-Filter steril. Ersetzen Sie danach das Nährmedium durch 500 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Transfektionsmedium und entsorgen Sie das alte Wachstumsmedium nicht. Bereiten Sie die Transfektionslösung unmittelbar vor der Zugabe zur Kultur vor, indem Sie Calciumchlorid und doppelt destilliertes Wasser mischen, während Sie das Röhrchen langsam umrühren.

Rühren Sie das Röhrchen weiter und geben Sie langsam DNA in die Lösung. Fügen Sie als Nächstes 2X BBS-Puffer tropfenweise hinzu. Die Herstellung von 2X BBS-Puffer ist ein kritischer Schritt bei der Transfektion von Calciumphosophhat, und es ist eine gute Idee, den optimalen pH-Wert für 2X BBS-Puffer zwischen 6,90 und 7,15 für neue DNA-Konstrukte oder Präparate zu kalibrieren.

Geben Sie dann sofort 30 Mikroliter der Transfektionslösung auf jedes Deckglas der neuronalen Kultur. Schütteln Sie die Kulturschale einige Male, um die Lösung zu mischen, und inkubieren Sie sie bei 35 Grad Celsius für 45 Minuten bis eine Stunde. Nach etwa einer Stunde sollte eine Schicht aus feinen Calciumphosphatausfällungen beobachtet werden, die die Neuronen bedeckt.

Ersetzen Sie anschließend das Transfiktionsmedium durch 500 Mikroliter vorgewärmten Waschpuffer und inkubieren Sie es 15 bis 20 Minuten lang bei 35 Grad Celsius. Die Calciumphosphatausfällungen sollten nach dem Waschen verschwunden sein. Ersetzen Sie nun den Waschpuffer durch 500 Mikroliter frisches Wachstumsmedium.

Ersetzen Sie anschließend das Wachstumsmedium durch das gespeicherte Originalmedium. Geben Sie dann die vorgemischte, unnatürliche Aminosäure Cmn in 50 Mikrolitern warmem Wachstumsmedium in die Kultur, was zu einer Endkonzentration von einem Millimolar führt. Inkubieren Sie die transfizierte Kultur 12 bis 48 Stunden lang bei 35 Grad Celsius, bevor Sie sie aufnehmen.

Bereiten Sie bei diesem Verfahren die extra- und intrazellulären Lösungen vor. In unserem Aufbau wird die LED mit einer Emission von 385 Nanometern neben dem Mikroskop installiert, um das Licht in einem Winkel von 45 Grad bis zu einem Zentimeter vom Fokuspunkt entfernt zu liefern. Ziehen Sie dann einige Patch-Pipetten mit einer Glaselektrode mit einem Mikropipettenabzieher.

Nehmen Sie anschließend ein Deckglas aus dem Inkubator und spülen Sie es einmal in der extrazellulären Lösung aus. Füllen Sie das Rig mit extrazellulärer Lösung. Legen Sie anschließend das Deckglas mit den Standard-Patch-Klemmtechniken auf die Plattform des Elektrophysiologie-Mikroskops.

Patchen Sie ein Neuron, das mit M-Citrin-Fluoreszenzen transfiziert wurde. Zeichnen Sie als Nächstes die neuronale Aktivität mit der Stromklemmenmethode auf. Stellen Sie zunächst das Ruhepotential auf etwa minus 72 Millivolt ein.

Injizieren Sie dann einen Stufenstrom, um ein kontinuierliches Feuern von Aktionspotentialen bei fünf bis 15 Hertz zu induzieren. Geben Sie während der Aufzeichnung einzelne LED-Impulse an das Neuron ab und überwachen Sie die Veränderungen seiner Aktionspotentiale. Geben Sie dann 0,5 millimolares Bariumchlorid in das Bad, um die Aktionspotentiale wiederherzustellen.

Bei der akuten Hirnschnitt wird ein Neuron mit M-Kirsch-GFP-Fluoreszenzen aus der neokortikalen Region gepflastert. Zeichnen Sie dann die PIRK-Aktivität mit der Spannungsrampenmethode auf. Überwachen Sie insbesondere die Kir2.1-spezifischen Einströmströme bei minus 100 Millivolt.

Geben Sie dann während der Aufzeichnung einzelne LED-Impulse an das Neuron ab und überwachen Sie, ob PIRK-Proteine aktiviert sind. Sobald PIRK aktiviert ist, würden die nach innen gerichteten Ströme bei minus 100 Millivolt deutlich ansteigen. Geben Sie am Ende 0,5 millimolares Bariumchlorid in das Bad und überprüfen Sie, ob PIRK inaktiviert ist.

Hier sind beispielhafte Bilder von gesunden neuronalen Kulturen im Hippocampus von Ratten zu sehen. Und zwei gesunde Neuronen mit prallen Zellkörpern und ausgeprägten Dendriten und Axonen. Dies sind die DIC- und Fluoreszenzbilder von Hippocampus-Neuronenkulturen von Ratten in vitro, die für die PIRK-Expression ohne CMN transfiziert wurden.

In Gegenwart einer millimolaren CMN sind transfizierte Neuronen in der Lage, PIRK M-Citrin-Proteine in voller Länge zu exprimieren und somit eine grüne Fluoreszenz zu zeigen. Und hier ist ein Beispiel für einen einzelnen Lichtpuls, der die Aktivität eines PIRK-exprimierten Hippocampus-Neurons unterdrückt. Diese Fluroeszenzbilder von embryonalen kortikalen Neuronen der Maus zeigen den erfolgreichen Einbau von CMN in GFP- und Kir2.1-Proteine in vivo.

In dieser Grafik ist die lichtabhängige Aktivierung von PIRK in den Strömen dargestellt, die von den neokortikalen Neuronen der Maus aufgezeichnet wurden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Hirnerkrankungen, die durch eine Fehlfunktion bestimmter neuronaler Proteine verursacht werden, z. B. mutiertes Kir2.1 beim Andersens-Syndrom, da diese Technik dabei hilft, aufzudecken, welche Schaltkreise des Gehirns von Kir2.1-Defiziten betroffen sind. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um die Funktion neuronaler Proteine mit Licht in hoher Spezifität in lebenden Neuronen zu steuern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unnatürliche Aminosäuren in Proteine in Neuronen einbaut, um eine Photokontrolle über neuronale Proteine von Interesse zu erreichen.