Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist der Nachweis von Autoantikörpern gegen den NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht auf autoimmune Enzephalitis. Die Messung hilft, die zentralen Fragen der Differentialdiagnose von Patienten mit akuten neuropsychiatrischen Symptomen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache und zuverlässige Screening-Maßnahme handelt.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie mit Gelatine beschichtete Kulturplatten vorbereiten. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter einer 2%igen Gelatinelösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten aspirieren Sie die Gelatinelösung aus den Vertiefungen.

In jeder Vertiefung 5 mal 10 bis 4. HEK293 Zellen in 200 Mikroliter Zellkulturmedium aussäen, das 10% FBS enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxid versorgt ist. Ersetzen Sie am nächsten Tag das verbrauchte Nährmedium in jeder Vertiefung durch 200 Mikroliter frisches Nährmedium mit 10 % FBS.

Skalieren Sie entsprechend der Gesamtzahl der Vertiefungen im Experiment, Bereiten Sie Lösung A vor, indem Sie das NR1-GFP-Plasmid mit dem Kulturmedium mischen. Lösung B wird durch Mischen des Transfektionsreagenzes mit dem Nährmedium hergestellt. Lösung C wird durch Mischen von Lösung A und Lösung B hergestellt und die Mischung 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Als nächstes aliquotieren Sie 40 Mikroliter Lösung C in jede Vertiefung, die die HEK293-Zellen enthält. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxid versorgt wird, über Nacht. Überprüfen Sie die Expression des rekombinanten Proteins NR1-GFP in den Wirtszellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 40- bis 200-facher Vergrößerung, bevor Sie mit dem zellbasierten Immunfluoreszenz-Assay fortfahren.

Um diesen Assay zu beginnen, aspirieren Sie zuerst das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der Kulturplatte und waschen Sie dann jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern PBS. Geben Sie 200 Mikroliter 4%ige Paraformaldehydlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Paraformaldehydlösung aus den Vertiefungen und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern PBS.

Geben Sie anschließend 200 Mikroliter 10%ige Magermilch in PBST-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln eine Stunde lang. Aspirieren Sie die 10%ige Magermilch in PBST-Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 200 Mikrolitern PBST. Inkubieren Sie die Vertiefungen mit Plasma, das eine bis 100 in PBST als Primärantikörper verdünnt ist, und schütteln Sie es eine Stunde lang leicht bei Raumtemperatur.

Nach einer Stunde aspirieren Sie das verdünnte Plasma aus den Vertiefungen und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern PBST. Geben Sie in jede Vertiefung 200 Mikroliter Anti-Human-IgG, konjugiert mit Alexa Fluor 594, und inkubieren Sie die Kulturplatte bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln eine Stunde lang. Als nächstes aspirieren Sie das mit Alexa Fluor 594 konjugierte Anti-Human-IgG und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 Mikrolitern PBST.

Nach der dritten PBST-Wäsche 100 Mikroliter Glycerinlösung, die DAPI enthält, in jede Vertiefung geben. Beobachten und abbilden Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem richtigen Filter für jeden Farbstoff und einem 10-fach-Okular mit vierfachen, 10-fachen und 20-fachen Objektiven. Diese repräsentativen Bilder, die 24 bis 30 Stunden nach der Transfektion aufgenommen wurden, zeigen HEK293-Zellen, die NR1-GFP exprimieren.

Etwa 30% der Zellen hatten unter dem Fluoreszenzmikroskop das grüne Signal. In den entsprechenden Alexa Fluor 594-Bildern zeigt das rote Signal in Panel B die Bindung der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper an das in den HEK293-Zellen exprimierte NR1 an. Das schwache rote Signal in Feld E zeigt das Hintergrundrauschen der Alexa Fluor 594-Bilder an.

Die Zellen, die NR1-GFP exprimieren, wurden zum Screening des Vorhandenseins von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörpern in einer humanen Plasmaprobe verwendet. In diesen zusammengefügten Bildern zeigt die gelbe Farbe eine Kolokalisation der NR1-GFP- und Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper an. Die Pfeile zeigen Beispiele für Zellen mit ausgeprägter Kolokalisation.

Eine Plasmaprobe, die eine Überlappung von mehr als 30 % der grünen und roten Signale zeigt, wird in diesem Fall als positiv interpretiert. Im zusammengeführten Bild der Negativkontrolle gibt es nur eine geringe Überlappung von grünen und roten Signalen, was die spezifische Bindung der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper an den NR1-GFP im Assay bestätigt. Einmal gemeistert, kann die Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich nur um eine Screening-Maßnahme handelt. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Messungen wie die Western-Blot-Analyse und die gewebebasierte Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Spezifität positiver Fälle zu beantworten. Nach der Entwicklung ebnete die Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Psychiatrie, um die Differentialdiagnose von Patienten mit akuten psychischen Notfällen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Assay durchführen, um im Blut nach Autoantikörpern gegen den NMDA-Rezeptor zu suchen.