Name: Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Lernen Sie einen zellbasierten Immunfluoreszenz-Assay zur Detektion von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptoren in Patientenplasma. Diese Methode mit HEK293-Zellen ermöglicht eine einfache und zuverlässige Screening-Diagnostik bei Verdacht auf autoimmune Enzephalitis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von der Chang Gung Medical Foundation (Grant-Nummer CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 und CMRPG3E0633) unterstützt.

Die Studie wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3) genehmigt.
1. Vorbereitung des Plasmids NR1-GFP Expression
<ol><li>Mix 10 ng NR1-GFP Plasmids mit 100 µL Escherichia coli kompetente Zellen Stamm DH5α in eine sterile 1,5 mL Röhrchen pipettieren die Mischung sanft bis Zentrifugieren und ab 4 bis 6 Mal, und das Rohr auf dem Eis für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr bei 42 ° C für 1 min in einem Wasserbad, nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad, fügen Sie 1 mL Lysogeny Brühe (LB) Medium in das Rohr und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Inkubator mit Schütteln für 1 h.</li>
	<li>50 µL der Mischung auf eine LB-Agar-Platte mit Ampicillin (0,1 mg/mL) zu verbreiten, und über Nacht die LB Nährbodenplatte bei 37 ° C in einem Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzige Kolonie von der Übernachtung LB-Agar-Platte mit einer sterilen Spitze, und schwenken Sie die Spitze in einer in einer Bakterienkultur Tube mit 5 mL LB-Medium und Ampicillin (0,1 mg/mL). Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Inkubator mit schütteln über Nacht.</li>
	<li>Aliquoten 3 mL die Übernachtung Bakterienkultur in einem 500 mL-Flasche, die sterile 250 mL LB-Medium und Ampicillin (0,1 mg/mL) enthält. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C mit schütteln. Überprüfen Sie regelmäßig die optische Dichte (OD) der bakteriellen Kultur bei Wellenlänge von 600 nm mit einem Spektrometer, bis die OD600 0,6-1,0 erreicht. Hinweis: Mischen Sie gut 800 µL über Nacht Bakterienkultur mit 200 µL Glycerin zur Vorbereitung der Glycerin-Lager- und Glycerin Lager unter-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
	<li>NR1-GFP Expressionsplasmid aus der 250 mL Bakterienkultur vorbereiten<ol>
<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Aufschwemmen der Bakterien Pellet in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer mit RNase A; Vortex gründlich, bis keine Klumpen zu sehen ist.</li>
		<li>Die Bakteriensuspension 10 mL Lyse Puffer hinzu, sanft invertieren Sie die Mischung 4 - 6 Mal, und inkubieren Sie die lysate bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.</li>
		<li>Die lysate 10 mL vorgekühlt Niederschlag Puffer hinzu, invertieren Sie sanft die Mischung 4 - 6 Mal.</li>
		<li>Gießen Sie die lysate in den Lauf der Filterpatrone mit der Kappe auf; warten Sie 10 min bei RT</li>
		<li>Entfernen Sie die Kappe von der Patrone Austrittsdüse, legen Sie einen Kolben in die Patrone und sanft drücken Sie den Kolben. Sammeln Sie die gefilterten lysate in ein 50 mL-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie 2,5 mL proprietäre Puffer vom Hersteller, die gefilterte lysate hinzu, mischen Sie die Mischung durch das Rohr ca. 10 mal umdrehen und inkubieren Sie die Mischung für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Wenden Sie die gefilterten lysate Mischung auf eine Filterspalte, die bereits mit 10 mL Gleichgewichtherstellung Puffer equilibriert war. Lassen Sie die Spalte durch die Schwerkraft ablaufen.</li>
		<li>Die Spalte mit 30 mL Waschpuffer zweimal waschen, dann DNA aus der Spalte mit 15 mL Elution Puffer eluieren.</li>
		<li>Der eluierten DNA-Puffer 10,5 mL (0,7 Bände) Isopropanol hinzufügen, gut mischen und die Mischung bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° c zentrifugiert</li>
		<li>Den Überstand vorsichtig abgießen, das DNA-Pellet mit 5 mL Endotoxin-freie 70 % Ethanol einmal waschen und 20.000 x g für 10 min zentrifugieren.</li>
		<li>Dekantieren Sie des Überstandes, trocknen Sie das Pellet 5-10 min in einer chemischen Kapuze und lösen Sie das Pellet in 300-500 µL Endotoxin-freie Puffer zu.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Plasmid-Konzentration durch Messung der Absorption der Lösung bei UV-260/280 nm mit einem Spektralphotometer. Hinweis: Bereiten Sie das Expressionsplasmid GFP, die dasselbe Protokoll verwenden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Transfektion von HEK293 Zellen mit NR1-GFP Expressionsplasmid
<ol><li>Aliquoten 200 µL 2 % Gelatine-Lösung zu jedem gut einer Kultur 48-Well-Platte und die Platte bei 37 ° C für mindestens 30 min inkubieren.</li>
	<li>Abzusaugen Sie die Gelatine-Lösung aus den gut und Samen 5 x 104 HEK293 Zellen in 200 µL Zellkulturmedium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in jedem Bohrloch. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht geliefert. Hinweis: Zellen gezählt mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Am nächsten Tag, ersetzen die abgebrannte Kulturmedium mit 200 µL frisches Kulturmedium mit 10 % FBS pro Bohrloch.</li>
	<li>Für jede einzelne gut, vorbereiten Lösung A durch das Mischen von 100 ng Plasmid NR1-tGFP mit 20 µL Kulturmedium und Lösung B durch das Mischen von 0,8 µL Transfection Reagens mit 20 µL Kulturmedium. Multiplizieren Sie die Anzahl der Bohrungen nötig, um das Gesamtvolumen für jedes Experiment vorzubereiten.</li>
	<li>Durch Mischen von Lösung A und Lösung B Lösung C ansetzen, und die Mischung bei RT für 20-30 min inkubieren.</li>
	<li>Aliquoten 40 µL Lösung C auch jeweils die HEK293 Zellen, die Platte vorsichtig schwenken und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht geliefert.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Ausdruck des rekombinanten Proteins NR1-GFP in den Wirtszellen unter Fluoreszenz-Mikroskop mit 40 X-200 X Vergrößerung (Anregung/Emission: 482/502 nm), und fahren Sie mit der Zell-basierte Immunfluoreszenz-Assay. Hinweis: Transfizieren Sie Expressionsplasmid GFP in HEK293 Zellen mit dem gleichen Protokoll.</li>
</ol>(3) Zell-basierte Immunfluoreszenz-Assay
<ol><li>Aspirieren der abgebrannten Mediums aus den Brunnen, dann waschen jedes gut mit 200 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) drei Mal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 4 % Paraformaldehyd Lösung in jede Vertiefung; inkubieren Sie die Platte bei RT für 15 min.</li>
	<li>Aspirieren Paraformaldehyd Lösung aus den Brunnen, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBS dreimal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 10 % Magermilch in PBST (0,1 % Tween 20 in PBS) Lösung für jedes gut und inkubieren Sie die Platte bei RT für 1 h mit sanft schütteln.</li>
	<li>Aspirieren Sie der 10 % Magermilch in PBST-Lösung aus dem Brunnen, dann einmal waschen Sie die Brunnen mit 200 µL PBST.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Brunnen mit verdünntem Plasma (1: 100 in PBST) als den primären Antikörper mit sanft schütteln bei RT für 1 h. Hinweis: Plasma ergibt sich aus dem Blut von Patienten mit Verdacht auf um autoimmune Enzephalitis zu haben.</li>
	<li>Aspirieren verdünnte Plasma aus den Brunnen, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBST dreimal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL der Ziege Anti-Human, die IgG mit Alexa Fluor 594 (1:1, 000 Verdünnung in PBST) in jede Vertiefung konjugiert und inkubieren Sie die Kultur-Platte bei RT mit sanft schütteln für 1 h.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Ziege Anti-Human-IgG mit Alexa Fluor 594 Lösung konjugiert, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBST dreimal.</li>
	<li>Jedes gut 100 µL Glycerin-Lösung (50 % Glycerin in PBS und 1: 100.000 von 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)) hinzufügen.</li>
	<li>Beobachten und Bild die Zellen unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem 10-fach Okular, und 4 X, 10 X und 20 X Ziele. Hinweis: Verwenden Sie den richtigen Filter für jede Farbe: für NR1-GLP (Anregung/Emission = 482/502 nm), für Alexa Fluor 594 (Anregung/Emission = 561/594 nm), für DAPI (Anregung/Emission = 358/461 nm). Führen Sie die negative-Kontrolle mit der HEK Zellen GFP in gleicher Weise zum Ausdruck zu bringen.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
<li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt mehrere zellbasierte immunologische Tests auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptor beschrieben, darunter live zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay11, zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay9 behoben , und Flow Cytometry-basierte assay14. Der live zellbasierte Immunfluoreszenz-Test sollte durchgeführt werden, kurz nach der Herstellung der Zellen das NR1-Protein, ectopically auszudrücken, während Flow Cytometry basierende Assays...

Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis ist eine neu erkannten Krankheit-Einheit, die bei Patienten aller Altersgruppen auftreten kann, und betrifft überwiegend weiblichen Patienten1,2. Es ist eines der am häufigsten diagnostizierten Enzephalitis bei Patienten mit initial unbekannter Ätiologie der Enzephalitis3. Patienten, die mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis in der Regel haben prodromale Symptome von Kopfschmerzen oder Fieber, gefolgt durch die schnelle Entwicklung des Bewusstseins Ebene ändern und eine Vielzahl von akuten neuropsychiatrischen Symptome, wie Unruhe, Reizbarkeit , Angst, Schlaflosigkeit, Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Aggression, bizarre Verhaltensweisen, Bewegungsstörungen, autonome Dysregulation und Beschlagnahme Angriffe4,5. Früherkennung von diesem Zustand und rechtzeitige Behandlung mit Immuntherapie sind wichtig für ein besseres Ergebnis und sogar vollständige Erholung der betroffenen Patienten6. Daher wird vorgeschlagen, dass Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis als eine wichtige Differentialdiagnose von Patienten mit akuten oder neue einsetzende psychotische Merkmale7,8betrachtet werden sollte.
Neben der klinischen Merkmale ist die Detektion von Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor in Blut oder Liquor wesentlich für die genaue Diagnose der Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis9. Die meisten der immunologischen Tests zur Erkennung von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper sind verfügbar in einigen Forschung Labors10,11, und es gibt nur einen handelsüblichen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay für das Screening der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper12. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen Inhouse zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der bequem im Labor verwendet werden kann, das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper, die klinische Forschung von Anti-NMDA-Rezeptor zu erleichtern den Bildschirm autoimmune Enzephalitis. Der NMDA-Rezeptor ist ein Heterotetramer Ionen-Kanal Proteinkomplex speziell im Gehirn ausgedrückt. Es besteht aus zwei obligatorischen NR1 Untereinheiten und die Kombination von ein oder zwei Untereinheiten NR2A, NR2B, NR2C oder NR2D13. Eine frühere Studie berichtet, dass die wichtigsten Epitop gezielt durch die Antikörper an den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit5. Daher in diesem Protokoll wir zum Ausdruck bringen des menschlichen Proteins für rekombinanten NR1-Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) in den menschlichen embryonalen Niere epithelialen Zell-Linie (HEK293), und entwickeln eine zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu erkennen der IgG-Klasse der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper im Blut.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP-markiert) - Humaner Glutamatrezeptor, ionotrop, N-Methyl-D-Aspartat 1 (GRIN1), Transkriptvariante NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>RG219368</td><td>NR1-cDNA-Klon, markiert mit C-terminalen tGFP-Sequenzen</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>PS100010</td><td>Säugetiervektor mit C-terminalem tGFP-Tag</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden, Deutschland)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Charakterisiertes fötales Rinderserum, US-Herkunft</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Human-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594-Konjugat</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Positivkontrolle: Anti-Glutamat-Rezeptor (Typ NMDA)</td><td>Euroimmun AG, L&uuml; beck, Deutschland</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun Assay Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache zellbasierte immunfluoreszenz-assay, autoantikörper gegen das n-methyl-d-aspartat-(nmda)-rezeptoren im blut zu erkennen

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

Das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper kann dazu führen, dass verschiedene neuropsychiatrische Symptome bei den betroffenen Patienten, Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis bezeichnet. Nachweis von spezifischen Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor im Blut oder Liquor cerebrospinalis (CSF) ist wichtig für die genaue Diagnose dieser Erkrankung. Der NMDA-Rezeptor ist ein Ionen-Kanal Proteinkomplex, der vier Untereinheiten, einschließlich zwei obligatorische NMDA-Rezeptor Untereinheit 1 (NR1) und ein oder zwei NMDA-Rezeptor enthält Untereinheit 2A (NR2A), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2 b (NR2B), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2C (NR2C) oder NMDA-Rezeptor Untereinheit 2D (NR2D). Das Epitop des Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper wurde berichtet, dass in den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors anwesend sein. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der als Screening-Test zum Nachweis von Autoantikörpern gegen NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors im Blut, die klinische und Forschung zu erleichtern verwendet werden kann Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis.

Im Durchschnitt konnten wir 200-300 µg Endotoxin-freie Meinungsäußerung Plasmid NR1-GFP und GFP 250 mL Bakterienkultur, die wie folgt beschrieben in Abschnitt 1 des Protokolls erhalten. Ein Betrag von 100 ng/Well des Plasmids Ausdruck war für die Transfektion der HEK293 Zellen kultiviert in der 48-Well-Platte, wie beschrieben in Abschnitt 2 des Protokolls verwendet. 24-30 h nach Transfektion, die Zellen ausgedrückt NR1-GFP und rekombinante Proteinen GFP unter Fluoreszenz-Mikroskop nachgew...

Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist der Nachweis von Autoantikörpern gegen den NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht auf autoimmune Enzephalitis. Die Messung hilft, die zentralen Fragen der Differentialdiagnose von Patienten mit akuten neuropsychiatrischen Symptomen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache und zuverlässige Screening-Maßnahme handelt.Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie mit Gelatine beschichtete Kulturplatten vorbereiten. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter einer 2%igen Gelatinelösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 30 Minuten aspirieren Sie die Gelatinelösung aus den Vertiefungen.In jeder Vertiefung 5 mal 10 bis 4. HEK293 Zellen in 200 Mikroliter Zellkulturmedium aussäen, das 10% FBS enthält. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxid versorgt ist. Ersetzen Sie am nächsten Tag das verbrauchte Nährmedium in jeder Vertiefung durch 200 Mikroliter frisches Nährmedium mit 10 % FBS.Skalieren Sie entsprechend der Gesamtzahl der Vertiefungen

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Identifizierung von Antikörpern gegen spezifische Antigene in einer Probe unter Verwendung einer neuronalen Kultur des Hippocampus der Ratte. Durch die Exposition kultivierter Neuronen gegenüber Patientenproben, die Autoantikörper enthalten, die auf N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) abzielen, wird das Vorhandensein von Autoantikörpern, die an die neuronale Oberfläche gebunden sind, durch Immunfärbung nachgewiesen.

Ein Assay zum Nachweis von Autoantikörpern in humanem Serum unter Verwendung einer neuronalen Kultur aus dem Hippocampus

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

DFS70 Autoantikörper imitieren üblichen krankheitsassoziierten Antinukleäre Antikörper-Muster machen genaue Interpretation herausfordernde Verwendung konventioneller HEp-2-Substrate. Das Protokoll beschreibt die Vorteile der neuartigen technischen HEp-2-Substrat über konventionelle HEp-2 in ANA screening und DFS70 Muster mit hohem Vertrauen in Konkurrenzsituation und gemischte ANA positive Fälle zu unterscheiden.

Gleichzeitige Unterscheidung der Konkurrenzsituation und gemischte DFS70 Muster bei ANA-Screening mit einem neuartigen HEp-2 ELITE/DFS70 Ko-Substrat

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

Zellbasierte Assays ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G. Diese Methode könnte auf klinische Diagnose und wissenschaftlichen Forschungen der Neuromyelitis-optisches Spektrum-Störungen angewendet werden.

Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Wir modellieren einen einfachen Multiplex-ECL-Assay, der 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Der Test ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere andere Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und autoimmunes polyglanduläres Syndrom 1.

Ein Hochdurchsatz-Elektrochemilumineszenz-7-Plex-Assay zum gleichzeitigen Screening auf Typ-1-Diabetes und mehrere Autoimmunerkrankungen

Autoimmunenzephalitis ist eine neue Kategorie von Antikörper-vermittelten Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Hippocampus-Neuronen können verwendet werden, um diese Antikörper zu entdecken und zu charakterisieren. Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die primäre Zellkultur und Immunfärbung zur Bestimmung von Autoantikörpern im Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten.

Hippocampus-neuronale Kulturen zum Nachweis und zur Untersuchung neuer pathogener Antikörper, die an der Autoimmunenzephalitis beteiligt sind

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Wir bieten eine Schritt-für-Schritt-Methode der Immunzytochemie (ICC) zum Nachweis von Anti-MDA5 an. Dieser Ansatz umfasst Zellfixierung, Permeabilisierung, Antikörperinkubation und bildgebende Verfahren, die den genauen Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern ermöglichen und die Diagnose einer schnell fortschreitenden interstitiellen Lungenerkrankung bei Myositis-Patienten unterstützen.

Nachweis von Anti-MDA5-Autoantikörpern mittels HeLa-Zellen und Immunzytochemie mit Lichtmikroskopie

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Immunoassay-Plattform, die auf den Prinzipien der zellfreien synthetischen Biologie und der Dot-Blot-Technik zum individualisierbaren Nachweis der Antikörperantwort in menschlichen und tierischen Seren basiert.

Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Lernen Sie einen zellbasierten Immunfluoreszenz-Assay zur Detektion von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptoren in Patientenplasma. Diese Methode mit HEK293-Zellen ermöglicht eine einfache und zuverlässige Screening-Diagnostik bei Verdacht auf autoimmune Enzephalitis.

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen (Video) | JoVE Journal

Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Weitere Videos entdecken