Gleichzeitige Unterscheidung der Konkurrenzsituation und gemischte DFS70 Muster bei ANA-Screening mit einem neuartigen HEp-2 ELITE/DFS70 Ko-Substrat

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen verbesserten, indirekten Immunfluoreszenz-Assay zu demonstrieren, der ein neuartiges HEp-2-Knockout-Substrat verwendet, um antinukleäre Autoantikörper zu screenen und gleichzeitig monospezifische und gemischte dichte fein gesprenkelte 70-Muster zu bestätigen. Das neuartige HEp-2-Substrat verwendet ein indirektes Standard-Immunfluoreszenzverfahren und Interpretationskriterien für das Screening klinisch relevanter antinukleärer Antikörper, die auch als ANAs bezeichnet werden. Der Hauptvorteil besteht darin, dass das dichte fein gesprenkelte 70-Muster im Screening-Schritt von krankheitsassoziierten, homogenen gesprenkelten oder schwierigen Mischmustern unterschieden werden kann.

Das Verfahren wird von Sofia Badanin, einer Technikerin unseres Qualitätskontrolllabors, vorgeführt. Verwenden Sie für Substrat-Objektträger Glas-Objektträger mit 12 Vertiefungen auf jedem Objektträger, die entweder die herkömmlichen HEp-2-Zellen oder eine Mischung aus herkömmlichen und dichten, fein gesprenkelten 70 Knockout-HEp-2-Zellen enthalten. Lassen Sie die Beutel mit den Substratobjektträgern auf Raumtemperatur ausgleichen, um eine optimale Leistung zu erzielen und die Kondensation von Feuchtigkeit auf der Objektträgeroberfläche vor der Probenzugabe zu verhindern.

Dies sollte zwischen 10 und 15 Minuten dauern. Sobald sie auf Raumtemperatur ausgeglichen sind, entfernen Sie die Objektträger vorsichtig mit den Fingern und vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Objektträgern und den Seiten des Beutels. Beschriften Sie die Objektträger und legen Sie sie in eine Inkubationskammer, die mit angefeuchteten Papiertüchern ausgelegt ist, um ein Austrocknen der Objektträger während der Proben- und Konjugatinkubation zu verhindern.

Geben Sie etwa 50 Mikroliter der Negativ- und Positivkontrolle sowie der verdünnten Patientenseren in einzelne Objektträgervertiefungen, bevor Sie die Objektträger in die Inkubationskammer legen. Der ANA-Test ist der erste Schritt beim Screening auf eine Autoimmunerkrankung. Es ist wichtig, dass eine Kreuzkontamination von Patientenproben auf dem Objektträger vermieden wird, um falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu minimieren.

Um eine Kreuzkontamination der Bohrlöcher zu vermeiden, vermeiden Sie eine Überfüllung der Vertiefungen. Legen Sie den Deckel auf die Inkubationskammer und inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn im Serum des Patienten ANA vorhanden ist, bindet es während dieser Zeit an die Zellen, die in jedem Testament vorhanden sind.

Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, nehmen Sie den Objektträger aus der Inkubationskammer. Halten Sie den Objektträger am Ende der Lasche und spülen Sie ihn vorsichtig 10 bis 15 Sekunden lang vorsichtig mit etwa 10 Millilitern des rekonstituierten phosphatgepufferten Kochsalzlösungs-Waschpuffers aus. Den Objektträger sofort in ein Coplin-Glas mit PBS-Waschpuffer geben und 10 Minuten einweichen.

Wiederholen Sie den Vorgang mit allen verbleibenden Objektträgern. Nehmen Sie jeweils nur einen Objektträger aus dem Coplin-Glas. Um den überschüssigen PBS-Waschpuffer von der Objektträgerin zu entfernen, klopfen oder tupfen Sie die Objektträgerin vorsichtig auf ein Papiertuch.

Tragen Sie vorsichtig einen Tropfen Fluoresceinisothiocyanat auf jede Vertiefung auf, das als Anti-Human-IgG-Fluoreszenzkonjugat markiert ist. Inkubieren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang in der geschlossenen Färbe-Inkubationskammer. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, nehmen Sie den Objektträger aus der Inkubationskammer.

Halten Sie den Schieber am Laschenende und spülen Sie ihn vorsichtig wie zuvor mit ca. 10 Millilitern PBS-Waschpuffer aus. Den Objektträger sofort in ein Coplin-Glas mit PBS-Waschpuffer geben und 10 Minuten einweichen. Legen Sie die im Set enthaltenen Deckgläser auf ein trockenes Papiertuch.

Tragen Sie bis zur Unterkante des Deckglases zwischen 3 und 4 Tropfen des Eindeckmediums in einer Linie auf. Nehmen Sie als Nächstes jeweils einen Objektträger aus dem Coplin-Tiegel mit dem Waschpuffer. Um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, klopfen oder tupfen Sie den Objektträger vorsichtig auf das Papiertuch.

Vermeiden Sie es, eine übermäßige Menge Waschpuffer auf dem Objektträger zu belassen, zu viel Druck auf den Deckglas auszuüben oder Luftblasen einzuführen. All dies kann sich auf die Zellmorphologie, die daraus resultierenden Fluoreszenzmuster und die Intensität der Reaktionen auswirken. Senken Sie die Folie vorsichtig auf den Deckglas ab, indem Sie die Unterkante der Folie an die Kante der Deckfolie legen.

Dadurch können die auf dem Deckglas vorhandenen Montagemedien an die Oberkante des Objektträgers fließen und die Bildung von Luftblasen minimiert werden, die das Ablesen jeder Vertiefung beeinträchtigen können. Betrachten Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Fluorescein-Isothiocyanat-Filtersets, das sich in einer Dunkelkammer befindet. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop bei einer 200-fachen Vergrößerung oder mehr auf spezifische hellgrüne Fluoreszenz, um die endgültige Interpretation in Bezug auf Positivität und Muster vorzunehmen.

Beachten Sie die Positiv- und Negativkontrollen. Die Positivkontrolle zeigt eine hellgrüne Fluoreszenz im Zellkern. Die Negativkontrolle zeigt unter einem Fluoreszenzmikroskop keine spezifische grüne Fluoreszenz an.

Notieren Sie das positive oder negative Ergebnis für jede Vertiefung und fügen Sie das ANA-Muster für positive Fälle hinzu. Das HEp-2-Substrat mit dichten, fein gesprenkelten 70 Knockout-Substraten bewahrt alle wichtigen nuklearen und zytoplasmatischen Muster. Ein dichtes, fein gesprenkeltes Muster zeichnet sich durch das Vorhandensein von gleichmäßig verteilten gesprenkelten Färbungen im gesamten Interphase-Kern und Chromatin in der mitotischen Phase aus.

Das Vorhandensein sowohl konventioneller HEp-2-Zellen, die dichtes, fein gesprenkeltes 70-Antigen exprimieren, als auch von manipulierten HEp-2-Zellen, die ohne das Antigen sind, erleichtert die genaue Unterscheidung des dichten, fein gesprenkelten 70-Musters, während alle Vorteile herkömmlicher HEp-2-Substrate erhalten bleiben. Seren, die positiv für die wichtigsten krankheitsassoziierten ANA-Muster sind, wurden zu gleichen Anteilen mit einem dichten, fein gesprenkelten 70-Muster-positiven Serum gemischt und sowohl auf konventionellen HEp-2- als auch auf den HEp-2-Substraten mit dichten, fein gesprenkelten 70 Knockout-Substraten getestet. Hier zeigen rote Pfeile Zellen in der mitotischen Phase an.

Gelbe Pfeile zeigen die konventionellen HEp-2-Kerne und blaue Pfeile die manipulierten HEp-2-Kerne an. Für alle dargestellten Reaktionskombinationen zeigt das dichte, fein gesprenkelte 70-Knockout-Substrat einen deutlichen Intensitätsunterschied zwischen den unmodifizierten Zellen und den manipulierten Zellen im gleichen Sichtfeld. Dies hilft bei der Unterscheidung von monospezifischen und gemischten, dichten, fein gesprenkelten 70-Reaktionen.

Autoantikörper gegen nukleäre und zytoplasmatische Antigene sind bei systemischen Autoimmunerkrankungen weit verbreitet. Es wurde berichtet, dass dichte, fein gesprenkelte Muster, die aus Autoantikörpern gegen DFS70, auch bekannt als PSIP1-Protein, resultieren, in gesunden Populationen weit verbreitet sind. Darüber hinaus treten diese DFS70-Autoantikörper sowohl isoliert als auch mit anderen krankheitsassoziierten ANAs auf.

Daher ist es für klinische Labore von entscheidender Bedeutung, dieses Muster genau von anderen krankheitsassoziierten Mustern zu unterscheiden. Zum Beispiel könnte ein gemischtes homogenes gesprenkeltes Muster, das mit Lupus assoziiert ist, als DFS70-Muster fehlinterpretiert werden, was mehrere Bestätigungsassays erforderlich macht. Die indirekte Immunfluoreszenzmethode mit HEp-2-Substraten gilt als Goldstandard-Screening-Methode für ANAs.

Die Genauigkeit hängt jedoch stark von der Geschicklichkeit des Technikers, der sorgfältigen Ausführung der einzelnen Schritte und der genauen Interpretation der resultierenden Muster ab. Umgekehrt zeigt die vergleichende Bewertung herkömmlicher HEp-2- und DFS70-Knockout-Substrate die Nützlichkeit dieses neuen Substrats bei der Unterscheidung des DFS70-Musters mit hoher Sicherheit beim Screening auf ANAs. Die weitere Interpretation sowohl von monopositiven als auch von gemischten DFS70-Mustern wurde mit diesem verbesserten HEp-2-Substrat relativ vereinfacht.

Das neue Substrat verwendet ein standardmäßiges, indirektes Immunfluoreszenzprotokoll und etablierte Interpretationskriterien für alle klinisch relevanten ANA-Muster.