Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochstandardisierte und reproduzierbare Organoide vom Vorderhirntyp aus humanen pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung von Mechanismen neu entwickelter NTZs. Insbesondere kann sie dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der frühen kortikalen Genese des Menschen zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die standardisierte und zeiteffiziente Erzeugung von menschlichem kortikalem Gewebe mit geringen Variationen zwischen einzelnen Organoiden und Organoid-Chargen ermöglicht. Die Organoid-Technologie kann Einblicke in die Entwicklung, Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns geben, insbesondere für Aspekte, die in Gehirnmodellen niederer Spezies nicht zu finden sind. Um pluripotente Stammzellaggregate zu erzeugen, geben Sie bei einer Konfluenz der Stammzellkulturen von 70 bis 90 % 500 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz in eine Vertiefung der sechs Vertiefungen der Kulturplatte, um die Zellen abzulösen.

Induzierte pluripotente Stammzellen, die an Monolayer-Kulturbedingungen angepasst sind, sind ein guter Zelltyp zur Erzeugung von Aggregaten, da sie während des Dissoziations- und Aggregationsverfahrens weniger anfällig für stressinduzierten Zelltod sind. Nach fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern DMEM/F-12 vom Boden der Vertiefung aus. Übertragen Sie die resultierende Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und erhöhen Sie das Volumen der Zelllösung auf 10 Milliliter mit mehr DMEM/F-12-Medium.

Nach der Zählung 4,5 mal 10 Zellen pro pluripotentem Stammzellaggregat in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Wir suspendieren das Pellet in dem entsprechenden Volumen an pluripotentem Stammzellmedium, ergänzt mit 50 mikromolaren Gesteinsinhibitoren, um eine 4,5-fache 10-fache 10-fache Konzentration pro 150 Mikroliter mittlerer Konzentration zu erreichen. Geben Sie als Nächstes 150 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte mit geringer Bindung und platzieren Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator.

Zur Überwachung der Induktion des anterioren Neuroektoderms verwenden Sie ein Gewebekulturmikroskop, um die morphologischen Veränderungen der pluripotenten Stammzellaggregate jeden Tag bei geringer Vergrößerung genau zu beobachten. Am ersten Tag sollten Zellaggregate mit klaren Grenzen beobachtet werden. Am zweiten Tag aspirieren Sie vorsichtig etwa zwei Drittel des Mediums, ohne die Zellaggregate am Boden jeder Vertiefung zu stören, und ersetzen Sie das verworfene Medium durch 100 Mikroliter frisches pluripotentes Stammzellmedium.

Zwischen vier und sechs Tagen später, wenn die Zellaggregate einen Durchmesser von 350 bis 450 Mikrometern erreichen und glatte Kanten aufweisen, verwenden Sie eine modifizierte 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um bis zu 20 Aggregate in eine einzelne sechs Zentimeter lange Kulturplatte mit niedrigem Anhaftungsgrad zu überführen, die fünf Milliliter kortikales Induktionsmedium enthält. Ersetzen Sie das kortikale Induktionsmedium alle drei Tage durch frisches Medium und überwachen Sie die Morphologie der Aggregate täglich unter dem 4X-Ziel. Nach vier bis fünf Tagen im kortikalen Induktionsmedium sollten die Ränder der Zellaggregate an der Oberfläche aufzuhellen beginnen, was auf eine neuroektodermale Differenzierung hinweist und die radiale Organisation eines pseudostratifizierten Epithels hervortreten sollte.

Um die neuroektodermalen Aggregate in ein Matrixgerüst einzubetten, tauen Sie den Basalmembranextrakt für zwei bis drei Stunden auf Eis auf. Während der Extrakt auftaut, schneiden Sie mit einer sterilen Schere Kunststoffparaffinfolie in eine vier mal vier Quadratzentimeter große Folie pro 16 Organoide und legen Sie jedes Stück Folie über eine leere 100-Mikroliter-Mikropipettenspitze. Drücken Sie die Paraffinfolie mit einer behandschuhten Fingerspitze, so dass kleine Grübchen entstehen, und reinigen Sie die Folie mit 70% Ethanol.

Nach 30-minütiger UV-Bestrahlung in einer geschlossenen, sterilen Biosicherheitswerkbank können Sie mit einer modifizierten 100-Mikroliter-Pipettenspitze mit einer Öffnung von eineinhalb bis zwei Millimetern jedes Zellaggregat in ein Grübchen in der Folie übertragen. Wenn alle Aggregate übertragen wurden, verwenden Sie eine ungeschnittene 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Medium vorsichtig aus jedem Grübchen abzusaugen, und fügen Sie 40 Mikroliter unverdünnten Basalmembranextrakt zu jedem Zellaggregat hinzu. Achten Sie darauf, die Organoide nicht durch grobe Manipulation oder Aspiration in die Pipettenspitze zu beschädigen, da dies das sich entwickelnde Neuroepithel schädigen würde.

Positionieren Sie die Aggregate mit der Pipettenspitze in der Mitte jedes Tropfens und übertragen Sie die Paraffinfolienplatte vorsichtig mit einer sterilen Pinzette in eine 10 Zentimeter große Petrischale. Stellen Sie die Schale für 15 bis 20 Minuten in den Inkubator. Während sich der Extrakt verfestigt, geben Sie fünf Millimeter frisches kortikales Induktionsmedium in eine sechs Zentimeter große Kulturschale mit niedrigem Attachment.

Drehen Sie am Ende der Inkubation das Paraffinfolienblatt um und drücken Sie mit einer sterilen Pinzette vorsichtig bis zu 16 polymerisierte Tröpfchen in jede sechs Zentimeter große Schale. Anschließend werden die Aggregate wieder in den Zellkultur-Inkubator zurückgeführt. Am nächsten Tag werden die Organoid-Kulturschalen in einem Zellkultur-Inkubator in einen schaukelnden Zellkulturschüttler überführt, der in einem Zellkultur-Inkubator in einem Winkel von fünf Grad und 14 U/min geneigt ist, wobei die Aggregate täglich mit dem Lichtmikroskop überwacht werden, bis die Aggregate die gewünschte Differenzierungsstufe erreichen.

Verwenden Sie an Tag 20 eine modifizierte Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit einer Öffnung von drei bis dreieinhalb Millilitern, um sechs Organoide aus den Aggregatkulturen zu sammeln. Geben Sie drei der Organoide in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern PBS und waschen Sie die Organoide mit einer Fünf-Milliliter-Pipette zweimal mit 500 Mikrolitern frischem PBS pro Waschgang. Nach dem zweiten Waschen fixieren Sie die Organoide 15 Minuten lang in kaltem 4%igem Paraformaldehyd, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen in PBS bei Raumtemperatur und einer abschließenden Dehydrierung über Nacht in 30%iger Saccharoselösung bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag färben Sie die dehydrierten Organoide 10 Minuten lang mit einer Verdünnung von ein bis 50 Trypanblau vor, um die Organoide während des Kryosektionsverfahrens sichtbar zu machen, und ersetzen Sie die Saccharose durch frisch zubereitetes Einbettmedium. Erhitzen Sie die Platte auf einem 60 Grad Celsius heißen Heizkissen für 15 Minuten, um die Organoide im Einbettungsmedium auszugleichen, und bedecken Sie den Boden einer Einbettungsform pro Organoid mit frischem Einbettmedium. Legen Sie die Form auf Eis, um das Einbettungsmedium zu verfestigen, übertragen Sie die Organoide auf die Einbettungsformen und fügen Sie frisches Einbettmedium hinzu, bis jedes Organoid bedeckt ist.

Dann frieren Sie die Organoide mindestens eine Minute lang in einem 100%igen Ethanol-Trockeneis-Gefrierbad ein und verwenden Sie einen Kryostaten, um 20 Mikrometer dicke Abschnitte jedes Organoids für die immunzytochemische Analyse zu erhalten. Um Organoide vom Vorderhirntyp zu erzeugen, verwenden Sie nur IPSC-Kulturen, die sich in der Ausgangspopulation als homogene Monoschicht aus undifferenzierten Zellen präsentieren. Am zweiten Tag sollten die Aggregate kompakte Zellknospen mit glatten Kanten gebildet haben.

Aggregate an Tag 10 sollten glattes und optisch glattes und optisch durchscheinendes Gewebe auf der Außenfläche zeigen, was die Induktion des Neuroektoderms darstellt. Wenn das Protokoll genau befolgt wurde, werden hochstandardisierte Organoid-Chargen generiert, die eine Homogenität von mehr als oder gleich 90 % bei der Bildung polarisierter Neuroektoderme innerhalb und zwischen den Chargen aufweisen. Die immunzytochemische Analyse von Organoiden am Tag 20 zeigt stratifizierte neuroepitheliale Schleifen, die den neuralen Stammzellmarker Sox2, die Vorderhirnmarker Pax6 und Otx2 und den dorsalen kortikalen Marker Emx1 exprimieren.

Diese kortikalen Schleifen sind ferner gekennzeichnet durch eine apikale Lokalisation von N-Cadherin und ZO-1, von ventrikulären Zonen abgeleitete Mikrotubuli, die sich von der apikalen bis zur basalen Seite der Strukturen erstreckt, und apikal lokalisierte Teilungszellen, die positiv für phosphoryliertes Vimentin gefärbt sind. Um die Teilungsebene apikaler radialer Gliazellen zu analysieren, kann eine Doppelfärbung für Vimentin und Tpx2, ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das zur Visualisierung der mitotischen Spindel und der apikalen Prozesse während der interkinetischen Kernmigration verwendet werden kann, durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochstandardisierte und homogene Organoide vom Vorderhirntyp aus menschlichen pluripotenten Stammzellen erzeugt.

Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der humanspezifischen Aspekte von neurologischen Entwicklungsstörungen anhand eines komplexen 3D-Zellmodells, das neurogewebespezifisch angeordnet ist. Sobald die Technik beherrscht wird, können diese kortikalen Organoide für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, z. B. für neurologische Entwicklungs-, Evolutions- oder Genfunktionsstudien, einschließlich der Modellierung von Krankheiten und möglicherweise für Medikamententests oder -therapien.