Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, iPS-Zellen aus adulten mononukleären Zellen des peripheren Blutes unter Verwendung nicht-integrierender episomaler Vektoren zu erzeugen. Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Stammzellen helfen, die iPS-Zellen für die Krankheitsüberwachung, das Wirkstoffscreening und die regelmäßige Radiomedizin erzeugen möchten. Unser Reprogrammierungsprotokoll ist sehr einfach, aber dennoch hocheffizient.

Nach diesem Verfahren kann man die Technik der Reprogrammierung von Blutzellen leicht beherrschen. Die Qualität des Plasmas ist ebenso wichtig für eine erfolgreiche Reprogrammierung. Kontaminanten können die Effizienz der Reprogrammierung verringern, daher empfehlen wir die Verwendung von Endofree-Kits zur Aufreinigung episomaler Plasmide.

iPS-Zellen sind zerbrechlicher als andere Zellen. Die Vorbereitung von Zellen auf mehr als ein Gen während des Passierens des Gens kann zu massivem Zelltod führen, insbesondere bei frühen Passagen. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Nährmedien gemäß dem beigefügten Manuskript vor.

Kombinieren Sie dann 10 ml frische PB-Probe und zehn ml PBS-Puffer in ein 50-ml-Röhrchen und mischen Sie es gut. Bringen Sie PBS vor der Verwendung auf Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius. Geben Sie als Nächstes 10 ml Ficoll auf den Boden des Röhrchens.

Dieser Vorgang sollte langsam durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass sich die Ficoll-Schicht nicht mit dem PB vermischt. Die Mischung bei 400 x g 30 Minuten lang mit geringer Beschleunigung und Verzögerung zentrifugieren. Nach der Zentrifugation befinden sich die PB MNCs in der weißen Schicht, die sich zwischen dem PB-Plasma und dem Ficoll befindet. Saugen Sie langsam 10 ml PB-Plasma an, ohne die Buff-Ficoll-Schicht zu stören.

Ernten Sie dann die weiße Schicht vorsichtig in ein neues 50-ml-Röhrchen. Das Gesamtvolumen der gesammelten Zellen aus der weißen Schicht sollte etwa drei bis sechs ml betragen. Fügen Sie danach PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 30 mL zu bringen, und mischen Sie gut.

Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 400 x g für zehn Minuten. Entfernen Sie nach zehn Minuten den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 ml Kulturmedium. Gut mischen und die Probe fünf Minuten lang bei 400 x g zentrifugieren, um den Großteil der Blutplättchen zu entfernen.

Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in ein bis zwei mL IMDM. Die Zellen können für die Sofortkultur verwendet oder für die spätere Verwendung eingefroren werden. Für die Kryokonservierung fügen Sie die gleiche Menge Kryokonservierungsmedium hinzu.

Aliquotieren Sie die Zellen in Kryoröhrchen und überführen Sie sie sofort in einen 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Bereiten Sie bei diesem Verfahren fünf ml IMDM-Medium in einem 15-ml-Röhrchen vor. Tauen Sie die gefrorenen PB MNCs schnell in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bevor Sie sie mit IMDM-Medium in die Tube übertragen.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 x g für fünf bis zehn Minuten. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in erythroidem Medium. Zählen Sie dann die Zellen unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometer.

Anschließend wurden PB-MNCs in einer Nicht-Gewebekultur mit einer Sechs-Well-Platte mit zwei ml Medium pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator kultiviert. Geben Sie an einem dritten und fünften Tag einen ml frisches erythroides Medium direkt in jede Vertiefung, ohne das Medium zu wechseln. Ernten Sie am sechsten Tag PB MNCs für die Nukleofektion.

Einen Tag vor der Nukleofektion die mit der Gewebekultur behandelte Sechs-Well-Platte mit 0,1 % Gelatine bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vorbeschichten. Tauen Sie die inaktivierten MEF-Feederzellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf und geben Sie sie sofort in ein 15-ml-Röhrchen mit fünf mL MEF-Medium. Anschließend zentrifugieren Sie sie bei 400 x g für fünf Minuten und entfernen den Überstand.

Entfernen Sie dann die Gelatine von der Sechs-Well-Platte und resuspendieren Sie das Zellpellet in MEF-Medium. Anschließend säen Sie die inaktivierten MEF-Zellen in zwei ml MEF-Medium in jeder Vertiefung einer gelatinevorbehandelten Sechs-Well-Platte aus und kultivieren sie bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Am Tag der Nukleofektion aspirieren Sie das MEF-Medium und ersetzen es durch einen ml erythroides Medium.

Anschließend wird die Kulturplatte 10-30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator voräquilibriert. Geben Sie zwei Mikrogramm PEV OCT4 zu Sox2, ein Mikrogramm PEV MYC, ein Mikrogramm PEV KLF4 und 0,5 Mikrogramm PEV Bcl-XL in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Erhitzen Sie das Rohr fünf Minuten lang auf 50 Grad Celsius, um eine Kontamination zu vermeiden, und kühlen Sie es dann auf Raumtemperatur ab.

Geben Sie anschließend 57 Mikroliter Nukleofektionspuffer und 13 Mikroliter Ergänzungspuffer in die Probe. Ernten Sie zweimal zehn bis sechs kultivierte PBMNCs in ein Fünf-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 x g für sieben Minuten. Entfernen Sie danach den Überstand und geben Sie die Mischung aus Plasmid und Nukleofektionspuffer zum Zellpellet.

Dann gut mischen, indem man mit einem Finger auf die Tube schnippt. Übertragen Sie anschließend die DNA in Zellsuspension auf die im Kit enthaltene Küvette und verschließen Sie die Küvette. Wählen Sie das Programm U-008 auf dem Nukleofektionsgerät.

Setzen Sie anschließend die Küvette in den Halter ein und drücken Sie OK. Nehmen Sie anschließend die Küvette aus dem Halter. Geben Sie 0,5-1 ml vorgewärmtes erythroides Medium in jede Küvette und übertragen Sie die Zellen sofort auf die voräquilibrierte MEF-Platte. Bei einigen Proben können Sie Tausende von Kolonien aus einer Million Blut erhalten.

Wenn Sie eine einzelne Kolonie für die weitere Kultur auswählen möchten, müssen Sie möglicherweise eine zusätzliche Vertiefung mit nur 1 Million Zellen aussäen. Unmittelbar bevor Sie die Hypoxiekammer in den Inkubator einsetzen, schütteln Sie die Kammer mehrmals vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Kulturvertiefungen zu erreichen. Übertragen Sie dann die Platte in eine Hypoxiekammer.

Spülen Sie die Kammer ein bis zwei Minuten lang mit einem Mischgas mit einer Geschwindigkeit von 20 Litern pro Minute. Verschließen Sie anschließend die Kammer und kultivieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius. Am zweiten Tag nach der Nukleofektion geben Sie zwei ml iPSC-Medium direkt in jede Vertiefung.

Am vierten Tag nach der Nukleofektion entnehmen Sie drei ml Medium und fügen Sie zwei ml frisches iPSC-Medium hinzu. Zu diesem Zeitpunkt haben sich die meisten lebenden Zellen an die Feeder-Schicht angeheftet. Nach dem sechsten Tag nach der Nukleofektion wechseln Sie das Medium, indem Sie 500 Mikroliter verbrauchtes Medium belassen und bis zum 14. und 18. Tag zwei ml frisches E8-Medium hinzufügen, das mit 0,25 Millimolaren Natriumbutyrat ergänzt wird.

Hier ist ein Schema des Protokolls zur Reprogrammierung peripherer Blutzellen dargestellt. Dieses Bild zeigt den AP in der Schüssel stehend, und dieses zeigt eine typische ESC-ähnliche iPSC-Kolonie am Tag 14 nach der Nukleofektion der PB-MNCs. Hier sind repräsentative FACS-Diagramme von iPSCs an der fünften Passage, die TRA-1-60 oder SSEA4 exprimieren.

Hier sind die repräsentativen konfokalen Bilder von iPS-Kolonien, die NANOG und OCT4 exprimieren. Die Bilder hier zeigen die H&E-Färbung des Terratoms, die alle drei Keimblätter umfasst. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie integrationsfreie iPS-Zellen aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes erzeugt werden können.

Einmal gemeistert, kann man in drei Wochen große Mengen an iPS-Zellen erzeugen, so dass die Hands-on-Zeit weniger als drei Stunden beträgt. Wir haben ein einfaches, episomales Vektorsystem für eine effiziente Reprogrammierung von Blutzellen entwickelt. Wir glauben, dass dieses erschwingliche System leicht eingesetzt werden kann, insbesondere in kleinen Laboren mit begrenzten Ressourcen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Blut und Plasmen gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, wie z. B. das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln, während Sie dieses Verfahren durchführen.