Name: Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit episomalen Vektoren integrationsfreie iPS-Zellen aus menschlichen peripheren Blutzellen erzeugen. Diese effiziente Methode ermöglicht die Reprogrammierung für Stammzellforschung und regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (2015CB964902, 2013CB966902 und 2012CB966601), der National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 und 81421002), dem GCAT-Stipendium der Loma Linda University School of Medicine (2015) und dem Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).

Alle der menschlichen PB Proben wurden von anonymen erwachsenen Spendern ohne Identifikationsinformationen von Tianjin Blood Center mit Genehmigung der lokalen Forschungsethikkommission erhalten. 1. Endo-freie Plasmid-Präparation <ol><li> Verwenden Sie eine kommerzielle Plasmidaufreinigung Maxi Kit zu episomale Vektoren von E. coli - Extrakt nach dem Protokoll des Herstellers. Für den letzten Schritt Ersatz TE-Puffer mit Endotoxin-freiem sterilem Wasser, um das DNA-Pellet aufzulösen. </li><li> Messen Sie DNA-Konzentration eines handelsüblichen UV / Vis-Spektralphotometer. Die Konzentration ist in der Regel größer als 1 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l, mit A260 / A280 und A260 / A230 Verhältnis von mehr als 1,8 bzw. 2,0. </li></ol> 2. Kultur Medien <ol><li> Bereiten Sie erythroiden Medium: Blutstammzell-Expansion Medium, ergänzt mit 100 ng / ml menschlichen Stammzellfaktor (SCF), 10 ng / ml Interleukin-3 (IL3), 2 U / ml Erythropoietin (EPO), 20 ng / mL Insulin-Wachstumsfaktor-1 (IGF1), 1 &amp; mgr; M Dexamethason und 0,2 mM 1-Thioglycerin. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. Erythroid Medium kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie iPSC Medium: DMEM / F12-Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium / Nährsalzgemisch F-12), ergänzt mit 1x L-Glutamin, 1x Penicillin / Streptomycin, 1x nicht-essentielle Aminosäuren Lösung, 50 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2 ), 1x Insulin-Transferrin-Selenit-Ergänzung (ITS) und 50 mg / ml Ascorbinsäure. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. iPSC Medium kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten MEF Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM; glucosereichem), supplementiert mit 1x Penicillin / Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. MEF Medium kann für bis zu einem Monat bei 4 ° C gelagert werden oder frisch 1x L-Glutamin vor der Verwendung. </li><li> Prepare iPSC Kryokonservierung Medium (2x): Man löst 5 g D-Trehalose in 30 ml sterilem Wasser in einem 37 ° C Wasserbad. Bringen Sie die Temperatur auf 4 ° C abgekühlt und dann wurden 10 ml FBS und 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 3 Monate 24. </li></ol> 3. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PB MNU) <ol><li> Kombinieren Sie 10 ml frisch PB Probe und 10 ml PBS-Puffer in einen 50-ml-Röhrchen und gut mischen. Bringen PBS auf RT oder 37 ° C vor der Verwendung. HINWEIS: ca. 1 - 3 x 10 6 MNC (frisch oder kryokonserviert) von 1 ml PB erhalten werden. Nach 6 d der Kultur erwarten 0,5 haben - 1 x 10 6 Zellen insgesamt durch Tod von reifen Zellen während der Kultur. Ungefähr 1 x 10 7 Zellen aus 10 ml frischem PB erhalten werden. </li><li> Fügen Sie 10 ml Ficoll mit dem Boden des Röhrchens ein 10 ml-Spritze mit einer langen Nadel befestigt werden. Diese progang sollte langsam erfolgen, um sicherzustellen, dass die Ficoll-Schicht nicht mit der PB mischt. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei einer niedrigen Beschleunigungs- und Verzögerungsrate. Nach Zentrifugation werden die PB MNCs in der weißen Schicht (buffy coat) zwischen dem PB Plasma und dem Ficoll entfernt. </li><li> Langsam ansaugen ~ 10 mL PB Plasma ohne die Leukozytenfilmschicht zu stören. Sorgfältig ernten die weiße Schicht mit einer 1 ml Pipettenspitze auf ein neues 50-ml-Röhrchen mit. 6 mL - das Gesamtvolumen der gesammelten Zellen von der weißen Schicht zwischen 3 sein. </li><li> Hinzufügen PBS um das Gesamtvolumen auf 30 ml zu bringen, und auch mit einer 10 ml Pipette mischen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in 20 ml Kulturmedium (dh Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium, IMDM) und gut mischen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min die Mehrheit der Plättchen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 1 bis 2 ml IMDM. Die Zellen können f verwendet werdenoder unmittelbare Kultur oder gefroren-down für die spätere Verwendung. Für die Kryokonservierung, eine gleiche Menge an Kryokonservierung Medium hinzuzufügen. Aliquot Zellen in Kryoröhrchen (0,5-1 ml pro Fläschchen) und Transfer Kryovials zu einem -80 ° C Gefrierschrank sofort. PB MNCs kann in -80 ° C Gefrierschrank für mehrere Wochen oder übertragen zu einer flüssigen Stickstofftank für die Langzeitspeicher gespeichert werden. HINWEIS: Wenn die gefrorenen Zellen aufgetaut, obwohl unsere Kryokonservierung Medium die Lebensfähigkeit der Zellen unterstützen kann, durch die Zellzahl verringern kann während des Auftauens Prozess zum Zelltod. Es wird empfohlen, 1 bis 10 x 10 7 Zellen werden in jede Ampulle eingefroren werden. </li></ol> 4. Ausbau der PB MNU in Erythroide Medium <ol><li> Bereiten Sie 5 ml IMDM-Medium in einem 15 ml-Röhrchen. Schnell Auftauen des gefrorenen PB MNC in einem 37 ° C Wasserbad und übertragen sie dann auf das Rohr mit dem IMDM-Medium. HINWEIS: Die Zeitdauer, in Wasserbad abhängig vom Volumen der kryokonservierten Zellen und die Kryoröhrchen used. Normalerweise wird die gefrorene Zelle innerhalb von 1 min auftauen. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 - 10 min. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in erythroiden Medium. In 10 ul Trypanblau Lösung auf 10 &amp; mgr; l Zellsuspension und gut mischen. Trypanblau färbt tote Zellen innerhalb von 1 - 3 Minuten. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. </li><li> Kultur PB MNCs in einem nicht-Gewebekultur (non-TC) pro Vertiefung Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 ml Medium behandelt, bei einer Zelldichte von ca. 5 x 10 6 Zellen / ml, bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> 1 ml frisch erythroiden Medium direkt in jede Vertiefung ohne Veränderung des Mediums bei D 3 und 5. </li><li> Bei D 6, ernten die PB MNU für Nukleofektion. </li></ol> 5. PB MNC Nucleofection und Reprogrammierung <ol><li> Einen Tag vor Nukleofektion, pre-coat TC-behandelten Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine bei 37 ° C für 20 min. Thaw inaktivierten Murine Embryonale FibroExplosion (MEF) Feeder-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad und sofort in ein 15 ml-Röhrchen übertragen 5 ml MEF Medium enthält. </li><li> Zentrifuge bei 400 xg für 5 min und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie die Gelatine aus der 6-Well-Platte, Zellpellet in MEF Medium, und sie auf die Gelatine vorbehandelt 6-Well-Platte. In jede Vertiefung, Samen 2-4 x 10 5 inaktivierten MEF - Zellen in 2 ml MEF Medium suspendiert. </li><li> Kultur die MEF - Feeder - Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Am Tag der Nukleofektion absaugen MEF Medium und ersetzen Sie es mit 1 ml erythroiden Medium. Pre-Äquilibrierung für 10 der Kulturplatte - 30 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. </li><li> Hinzufügen 2 ug pEV-OCT4-2A-SOX2, 1 &amp; mgr; g pEV-MYC, 1 &amp; mgr; g pEV-KLF4 und 0,5 ug pEV-BCL-XL in einem 1,5 ml sterilen Eppendorf-Röhrchen. Erhitzen Sie das Rohr bei 50 ° C für 5 min eine Kontamination zu verhindern, und Abkühlen auf RT. Hinzufügen57 &amp; mgr; l Nukleofektion Puffer und 13 &amp; mgr; l zu ergänzen. </li><li> Ernte 2 x 10 6 kultiviert PB MNCs zu einem 5 ml - Röhrchen von 7 min bei 200 xg zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie das Plasmid und Nukleofektion Puffermischung zu dem Zellpellet. Gut mischen, indem das Röhrchen mit dem Finger schnippen. HINWEIS: So niedrig wie 2 x 10 5 Zellen können für Nukleofektion verwendet werden, aber eine geringere Umprogrammierung Effizienz sollte auch zu erwarten. </li><li> Übertragen Sie die DNA und Zellsuspension in die Küvette im Kit enthalten und die Kappe der Küvette. Wählen Sie das Programm U-008 auf der Nukleofektion Gerät. Setzen Sie die Küvette in die Halterung ein und drücken Sie OK, um die U-008-Programm bewerben. </li><li> Nehmen Sie die Küvette aus dem Halter, fügen 0,5-1 ml vorgewärmten erythroiden Medium in jeder Küvette und Transferzellen an die voräquilibriert sofort MEF Platte. Aufgrund der hohen Effizienz und Umprogrammierung Spender Variation eine unterschiedliche Anzahl von Zellen im Bereich von 1-10 x 10 5 Zellen Animpfen per gut ist sehr erwünscht. </li><li> Übertragen , um die Platte zu einer Hypoxie Kammer und Spülen der Kammer mit einem Gasgemisch bestehend aus 92% N 2, 5% CO 2 und 3% O 2, für 1 bis 2 min bei einer Geschwindigkeit von 20 l / min. Nach dem Verschließen der Kammer Kultur der Zellen bei 37 ° C. </li><li> Bei D 2 Post-Nukleofektion, 2 ml iPSC Medium zu jeder Vertiefung direkt. </li><li> Bei D 4 post-Nukleofektion, entfernen 3 ml Medium und 2 mL frisch iPSC Medium. Bei D 4 post-Nukleofektion, werden die meisten der lebenden Zellen auf den Feeder-Schicht angebracht. </li><li> Nach D 6 post-Nukleofektion, ändern Sie das Medium alle 2 d um 500 verlassen ul verbrauchten Medium und Zugabe von 2 ml frischem E8-Medium mit 0,25 mM Natriumbutyrat bis D 14 bis 18. HINWEIS: Zusätzliche Feeder-Zellen können in den Kulturvertiefungen hinzugefügt werden, wenn die Beobachtung, dass der Feeder-Zellen abgelöst worden. Nach MEFs Auftauen (siehe 5.1 und 5.2), Zellpellet in einem kleinen Volumen von E8 Medium (dh ~ 0.2 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte) und fügen Sie dann MEFs in die Kulturvertiefungen. Etwa 2% FBS Zellanheftung zu erhöhen, können zugesetzt werden. Alternativ kann auch MEF-konditioniertes Medium verwendet werden, aber es ist mühsam. </li></ol> 6. Erweiterung der iPS-Zellen HINWEIS: In den meisten Fällen eine große Anzahl von iPS-Kolonien erscheinen bei D 8 - 10 Post Nukleofektion. Nach D 14, sind große iPSC Kolonien in der Regel bereit für die Kommissionierung. <ol><li> Vor Kolonien Kommissionierung, 500 &amp; mgr; l E8 Medium mit ROCK-Hemmer ergänzt, Y27632 (10 &amp; mgr; M), in eine Vertiefung einer Zubringer oder Matrigel beschichtet 24-Well-Platte. Verwenden Sie eine 10 oder 20 &amp; mgr; l Pipette zu kratzen und Kolonien unter dem Mikroskop holen. Übertragen die Stücke jeder Kolonie in die Vertiefungen des Kulturmediums enthält. HINWEIS: Die Konzentration an Matrigel unterscheidet sich von einer Charge zur anderen. Normalerweise verwenden wir 1: 100 Verdünnung von Matrigel. <ol><li> Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, wählen SieKolonien, die von anderen großen und gut voneinander getrennt sind. Kultur iPSCs bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. HINWEIS: Es sollte beachten, dass die iPS Bevölkerung Zellmigration durch polyklonalen sein kann, wenn es Dutzende oder Hunderte von Kolonien in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte sind. </li></ol></li><li> Nicht Medium für die ersten 2 d ändern. ROCK - Inhibitor kann das Überleben von kleinen Kolonien 25 fördern. </li><li> Von D 2 ab, Medium jeden Tag ändern, indem Sie verbrauchte Medium zu entfernen und in jeder Vertiefung 500 ul frisch E8 Medium hinzufügen. </li><li> Etwa 1 Woche später, wenn die Kolonien groß genug sind, entfernen Sie das Medium und Behandlung der Zellen mit 300 &amp; mgr; l Zellablösung Lösung (0,5 mM EDTA in PBS) bei 37 ° C für 1 - 3 Minuten. Entfernen Sie die Zellablösung Lösung und fügen Sie E8-Medium, das ROCK-Inhibitor (10 uM) iPSCs auszusetzen. brechen Sie nicht Kolonien in einzelne Zellen nach unten, was zu einer übermäßigen Zelltod führen kann. Die Zellklumpen mit 5-50 Zelles sind für iPSC Durchgang geeignet. </li><li> Dann werden 50 - 100% der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12- oder 6-Well-Platte, die mit Zubringern oder Matrigel schwemmt wurde. </li><li> Für langfristige Kultur in Matrigel-beschichteten Platten (siehe Anmerkung in 6.1), ändern Sie das Medium jeden Tag. Wenn die Zelle 40 Konfluenz erreicht - 60%, zu behandeln, die Zellen mit 1 ml Zellentfernungslösung (0,5 mM EDTA in PBS) bei 37 ° C für ~ 3 min. Wenn die Kolonien zum Einrollen beginnen, entfernen Sie die Lösung Zellablösung und fügen E8-Medium, das ROCK-Inhibitor (10 &amp; mgr; M), um die iPS-Zellen einzustellen. Passage-Zellen mit einem Teilungsfaktor von 4 - 8. Der ROCK-Inhibitor hinzugefügt werden sollte, wenn die Zellen Passagierung Überleben zu erhöhen, und entfernt 1 d spätere Differenzierung zu verhindern. </li><li> Zum Einfrieren-down iPSCs, behandeln Zellen mit Zellablösung-Lösung bei 37 ° C 3 - 5 min nach dem Protokoll des Herstellers. Wenn iPSC Kolonien zum Einrollen beginnen absaugen Puffer und 0,5 hinzufügen - 1 ml E8 Medium. </li> &lt;li&gt; ein gleiches Volumen von Kryokonservierung Medium zur Zellsuspension hinzufügen und gut mischen. Gefrorene iPSCs kann in einem -80 ° C Gefrierschrank für mehrere Wochen oder in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung gelagert werden. </li></ol> 7. Auswahl von iPS-Zellen ohne Rest episomalen Plasmiden <ol><li> Nach dem Durchgang 5, Ernte iPSCs und extrahieren genomischer DNA. HINWEIS: In der Regel nach 5 Passagen der Kultur, Rest episomalen Plasmiden nicht nachweisbar sind. Somit fast alle der iPSC Kolonien Passagen über 5 (dh Durchgang 10) fehlen Rest episomalen Plasmiden. </li><li> Verwenden genomische DNA aus nicht-transfizierten PB MNCs als negative Kontrolle. In 1,6 pg pEV-OCT4-2A-SOX2 Plasmid in 1 ug negativen Kontroll-DNA zu imitieren Zellen mit einer Kopie von pEV Plasmid pro Zelle. </li><li> In 9 &amp; mgr; l PCR-grade Wasser einschließlich 100 ng genomischer DNA und 1 &amp; mgr; l-spezifische Primer (10 &amp; mgr; M jeweils von Vorwärts- und Rückwärts-Primer) in 10 ul Hoch Fidelity PCR Master Mix. Normalisieren der Uhrount von DNA von GAPDH. Verwenden Sie die folgenden Primer für die PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE-R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 98 ° C für 60 s; von 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s. Nach 30 Zyklen; die Reaktion bei 72 ° C für 5 min verlängern. </li><li> Last 5 &amp; mgr; l PCR-Produkte in jeder Vertiefung einer 1% igen Agarosegel. Führen Sie das Gel für 20 - 30 min bei 100 V die iPS-Klone Wählen Sie mit einer nicht nachweisbaren Banden für EBNA1 und WPRE für die weitere Kultur und Downstream-Analyse. </li></ol> 8. Flow Cytometry <ol><li> Ernte iPSCs indem sie mit Accutase bei 37 ° C für 3 Behandlung - 5 min eine Einzelzellsuspension zu erhalten. 1 &amp; mgr; l PE-konjugiertem anti-TRA-1-60 oder eFluor 570-konjugiertem anti-SSEA4 oder isotypische Antikörper auf 100 ul der Zellsuspension (1 - 5 x 10 5 Zellen) In 5 ml-Röhrchen. Die Röhrchen in einem dunklen Ort bei RT für 20 min. </li><li> Nach der Färbung bei RT für 20 min, 2 mL PBS und Zentrifuge bei 400 xg für 5 min. Die Zellen in 300 &amp; mgr; l PBS für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse eine Durchflusszytometrie Zell Analyzer. 23,26 </li></ol> 9. Die konfokale Imaging <ol><li> Seed iPSCs in Matrigel beschichtete Kammer gleitet. </li><li> Nach 3 bis 4 d der Kultur, das Wachstumsmedium zu entfernen und zu beheben mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 30 min. Wasche die Zellen zweimal mit PBS. Hinweis: PFA giftig und schädlich ist. </li><li> Behandlung der Zellen mit 0,1% Triton X-100 in PBS (PBS-T) bei RT für 30 min. Wasche die Zellen zweimal mit PBS. </li><li> Blockieren der Zellen mit Blockierungspuffer (5% Ziegenserum in PBS, V: V) bei RT für 1 h. </li><li> Während der Blockierungsschritt, verdünne den primären Antikörper (100x) in Blocking-Puffer. HINWEIS: Die Antikörper Informationen werden in der Tabelle der Materialien aufgeführt / Ausrüstung. </li><li> Inkubiere Zellen mit verdünntem Antikörper bei 4 ° CO / N. </li><li> Zweimal waschen mit PBS-T für 15 min, gefolgt von zweimal mit PBS für 15 min. </li><li> Inkubiere Zellen mit einer verdünnten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper bei RT für 2 h. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS-T für 15 min, gefolgt von zweimal mit PBS für 15 min. </li><li> Beflecken den Kern mit DAPI (1 ug / ml) in PBS bei RT für 10 min. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS für 15 min. </li><li> Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop. 23,27 </li></ol> 10. Teratoma Assay Ernte 1 x 10 6 iPSCs mit Zellentfernungslösung (0,5 mM EDTA in PBS) und resuspendieren Zellen in 200 &amp; mgr; l DMEM / F12 , verdünnt (1: 1) Matrigel. <ol><li> Subkutan-Zellen in den hinteren haunch von NOD / SCID immundefizienten Mäusen injiziert. </li><li> Bei 8 - 12 Woche nach iPSC Injektion, sezieren und Teratome in 10% Formalin fixieren. 28 </li><li> Nach Mikroabtrennen undAnfärben mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E), zu analysieren Proben. 29 </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden oder widerstreitenden Interessen offenzulegen.

Der Erwerb von Blutproben von gesunden Spendern oder Patienten ist bequem und nicht-invasive, es eine attraktive Zellquelle für die Grundlagenforschung und klinische Zelltherapie zu machen. Hier haben wir ein Protokoll für die hocheffiziente Erzeugung von Integration freien iPSCs aus peripheren Blutproben beschrieben. Das reproduzierbare und kostengünstige Ansatz sollte das iPSC Bereich profitieren. Wir haben berichtet , dass es zwei kritische Faktoren , die für die hocheffiziente PB Umprogr...

Nach forcierter Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren (Dh OCT4, SOX2, MYC und KLF4) können somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS - Zellen) umprogrammiert werden, die für Anwendungen ein großes Versprechen halten in der regenerativen Medizin und Zellersatztherapie 1-3. Bisher wurden verschiedene Methoden entwickelt , um die Erfolgsrate der Umprogrammierung 4-7 zu erhöhen. Virale Vektoren induzierte Reprogrammierung ist für eine effiziente Erzeugung von iPS-Zellen weit verbreitet, weil die virale Integration führt zu einem hohen Niveau, eine stabile Expression der Umprogrammierung Faktoren. Eine permanente Integration der Vektor - DNA in das Zellgenom induzieren Insertionsmutagenese 5. Darüber hinaus kann unzureichende Inaktivierung von Reprogrammierungsfaktoren iPSCs Differenzierung 8 stören. Als solches ist der Einsatz von iPS-Zellen ohne Integration von Reprogrammierungsfaktoren zwingend notwendig, vor allem für den Einsatz in der Zelltherapie-Anwendungen. <p class="jove_content"&gt; Episomale Vektoren (EVs) sind bei der Erzeugung von Integrationsfreien iPSCs weit verbreitet. Das am häufigsten verwendete EV ist ein Plasmid , zwei Elemente enthält, die Herkunft der viralen Replikation (oriP) und EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), von dem Epstein-Barr (EB) -Virus 9. Das oriP-Element fördert Plasmidreplikation in Säugetierzellen, während das EBNA1 Element den oriP-enthaltenden Plasmid-DNA in die chromosomale DNA anbindet, die für die Unterteilung des Episom während der Teilung der Wirtszelle ermöglicht. Im Vergleich zu anderen Integrationsfreien Ansätze, einschließlich Sendai - Virus (SV) und RNA - Transfektion besitzen EVs mehrere Vorteile 5,6,10. Als Plasmid-DNA kann EVs leicht im Haus hergestellt und modifiziert werden, so dass sie äußerst erschwinglich zu machen. Darüber hinaus mit EV Umprogrammierung ist eine weniger arbeitsintensiver Prozess, da eine einzelne Transfektion mit EVs für iPSC Generation ausreichend ist, während mehrere RNA-Transfektionen für die erfolgreiche Reprogrammierung notwendig sind. Dermal Fibroblasten wurden in vielen Umprogrammierung Studien verwendet worden. Allerdings ist Hautbiopsie nicht nur eine invasive und schmerzhafter Prozess, sondern auch zeitaufwendig für Zellen zu ausreichenden Mengen für eine Neuprogrammierung zu erweitern. Von größerer Bedeutung, Hautzellen von erwachsenen Spendern haben oft zu langfristigen UV - Licht - Strahlung ausgesetzt worden, die zu Mutationen , die mit Tumoren führen kann, so dass die Anwendungen für aus Fibroblasten der Haut 11,12 abgeleitet iPSCs begrenzen. Kürzlich ist berichtet worden , dass normale menschliche Hautzellen und somatische Mutationen multiple Krebsgene ansammeln, einschließlich die meisten der Schlüsselfaktoren der kutanen squamösen Zellkarzinomen, sind unter starkem positiven Selektions 13. Im Gegensatz zu Hautfibroblasten, peripherem Blut (PB) Zellen eine bevorzugte Quelle von Zellen für eine Neuprogrammierung sind, weil 1) Blutzellen, können leicht durch eine minimal-invasive Verfahren, 2) periphere Blutzellen sind die Nachkommen von hämatopoetischen Stammzellen erhalten werden,im Knochenmark mit Wohnsitz, also vor schädlicher Strahlung geschützt. Periphere mononukleäre Blutzellen (PB MNCs) können in einer Stunde aus der buffy coat-Schicht nach einem einfachen Gradientenzentrifugation gesammelt werden unter Verwendung von Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Die erhaltenen PB MNU sind aus Lymphozyten bestehen, Monozyten und einigen hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPC) 14. Obwohl menschliche T - Lymphozyten eine der Hauptzelltypen in PB sind, reifen T - Zellen enthalten Neuanordnungen der T - Zell - Rezeptor (TCR) Gene und fehlt somit eine intakte Genom ihr Potential für Anwendungen Begrenzungs 15,16. Kann die Verjüngung von T - Zellen über iPSC Generation haben jedoch potenzielle Anwendungen in chimären Antigenrezeptoren (CAR) T-Zell - Therapie 17-19. Im Vergleich dazu haben HPCs eine intakte Genom und sind leicht umprogrammierbar. Obwohl nur 0,01-0,1% der Zellen in den peripheren Kreislauf HPCs sind, können diese Zellen ex vivo in erythroiden Medium erweitert werden , die Proliferation von erythr begünstigtoid Vorläuferzellen 14. In unserer früheren Studie haben wir den Faktor BCL-XL zusätzlich zu den Yamanaka Faktoren (OCT4, SOX2, MYC und KLF4), die in einem 10 - fach Anstieg der PB Umprogrammierung efficency 20 geführt. BCL-XL, die auch als BCL2L1 bekannt, ist ein potenter Inhibitor der Zelltod durch 21,22 Aktivierung von Caspasen hemmen. Aber BCL-XL kann auch eine wichtige Rolle spielen Pluripotenz 21,22 aufrechtzuerhalten. Vor kurzem haben wir unsere EV Umprogrammierung System mit zwei Vektoren durch separat exprimierenden MYC und KLF4 optimiert, was in Umprogrammierung Wirkungsgrad 23 auf eine etwa 100 - fache Steigerung führt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird die Umprogrammierung Effizienz, definiert durch Koloniezahl geteilt durch die Zellzahl bei der Transfektion ausgehend ist 0,2-0,5% von gesunden Spendern. Wie folgt beschreiben wir die detaillierte experimentelle Verfahren zur Erzeugung von Integration freien iPSCs von PB.

<table><tbody><tr><td>Hämatopoetisches Stammzellexpansionsmedium</td><td>Sigma</td><td>S0192</td><td>Bei 4 > C</td></tr><tr><td>Humaner Stammzellfaktor (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Bei -20 oder -80 &de; C</td></tr><tr><td>Interleukin-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-03</td><td>Bei -20 oder -80 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Erythropoietin (EPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Bei -20 oder -80 &de; C</td></tr><tr><td>Insulin Wachstumsfaktor-1 (IGF-1)</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td>Bei -20 oder -80 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Bei -20 oder -80 &° lagern; C</td></tr><tr><td>1-thioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>Bei -20 oder -80 &de; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Gibco</td><td>112660-012</td><td>Lagern bei 4 > C</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Bei -20 > C</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Bei -20 > lagern; C</td></tr><tr><td>Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Bei 4 > C</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Bei -20 oder -80 &de; C</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen (ITS, 100x)</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td>Bei -20 > lagern; C</td></tr><tr><td>DMEM (hoher Glukosegehalt) mittel</td><td>Thermo</td><td>SH30243.01B</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SV30087.01</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare, SIGMA</td><td>17-5442-02</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma</td><td>T9531</td><td>Store at 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Bei RT lagern, vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Endofreies Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahren IMDM</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Bei 4 > C</td></tr><tr><td>Humanes CD34+ Zell-Nukleofektions-Kit</td><td>Lonza</td><td>VPA-1003</td><td>Bei RT lagern, Nukleofektionspuffer und Supplement sollten bei 4 & Grad gelagert werden; C</td></tr><tr><td>Natriumbutyrat</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td>Bei -20 oder -80 &° lagern; C</td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor - Y27632</td><td>STEMGENT</td><td>04-0012-10</td><td>Bei -20 & deg lagern; C</td></tr><tr><td>Essential 8 Basalmedium (E8)</td><td>Gibco</td><td>A15169-01</td><td>Bei 4 > C sollte das Präparat bei -20 oder -80 °C gelagert werden; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Bei -20 oder -80 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>2x EasyTaq PCR SuperMix (+Farbstoff)</td><td>TransGen Biotech</td><td>AS111</td><td>Bei -20 > C</td></tr><tr><td>Zellablösungslösung</td><td>STEMGENT</td><td>01-0006</td><td>Bei -20 & Grad lagern; C, Accutase als Zellablösungslösung zur Gewinnung einer einzelligen Suspension</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Bei 4 oder -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Anti-Nanog AF488</td><td>BD</td><td>560791</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C, primärer Antikörper für Immunfluoreszenz, verdünnt 1/100 bei Verwendung</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>abcam</td><td>ab19857</td><td>Bei 4 & deg; C, primärer Antikörper für Immunfluoreszenz, verdünnt 1/100 bei Verwendung</td></tr><tr><td>AF488 Esel Anti-Maus</td><td>IgG Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Bei 4 & deg lagern; C, Sekundärantikörper für Immunfluoreszenz&nbsp; verdünnen 1/500 bei Verwendung</td></tr><tr><td>PE Anti-Human-Antikörper TRA-1-60-R</td><td>Biolegend</td><td>330610</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C, Antikörper für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>eFluor 570-konjugiertes Anti-SSEA4</td><td>eBioscience</td><td>41-8843</td><td>Bei 4 & deg lagern; C, Antikörper für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Isotyp-Antikörper</td><td>eBioscience</td><td>11-4011</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C, Antikörper für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase-Nachweiskit</td><td>SiDanSai</td><td>1102-100</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Genomic DNA Extraction Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-02</td><td>Bei RT aufbewahren</td></tr><tr><td>Trypan Blue Lösung</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahren Durchflusszytometrie Zellanalysator</td><td>BD</td><td>LSRII</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Konfokales Mikroskop (SDC)</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>für konfokale</td></tr><tr><td>Bildgebung Nukleofectionsgerät</td><td>Lonza</td><td>Nucleofector 2b</td><td>für die Nukleofektion von PB MNC</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4010</td><td>GE</td><td></td><td>zur Aufnahme von Fotos von AP-Färbungen in großen Mengen</td></tr></tbody></table>

die erzeugung von integration freien induzierte pluripotente stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen blutzellen mit episomale vektoren

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind äußerst viel versprechend für Krankheitsmodelle und regenerative Therapien. Wir zuvor berichtet die Verwendung von episomalen Vektoren (EV) Integration freien iPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (MNCs PB) zu erzeugen. Die episomale Vektoren verwendet werden DNA - Plasmide integriert mit oriP und EBNA1 Elemente aus dem Epstein-Barr (EB) -Virus, die für die Replikation und Langzeit retainment von Plasmiden in Säugerzellen ermöglichen, respectively. Mit einer weiteren Optimierung kann Tausende von iPS Kolonien von 1 ml peripheren Blut gewonnen werden. Zwei kritische Faktoren zur Erzielung hoher Wirkungsgrade Neuprogrammierung sind: 1) die Verwendung eines 2A &quot;Selbstspaltung&quot; Peptid zu verknüpfen OCT4 und SOX2, wodurch äquimolare Expression der beiden Faktoren zu erreichen; 2) die Verwendung von zwei Vektoren auszudrücken MYC und KLF4 einzeln. Hier haben wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung von Integration freien iP beschreibenSCs aus adulten peripheren Blutproben. Die erzeugten iPS-Zellen sind Integration frei als Rest episomalen Plasmiden nach fünf Passagen nicht nachweisbar sind. Obwohl die Umprogrammierung Effizienz der von Sendai-Virus (SV) Vektoren vergleichbar ist, sind EV Plasmiden wesentlich wirtschaftlicher sind als die im Handel erhältlichen Vektoren SV. Dieses günstige EV Umprogrammierung System hält für klinische Anwendungen in der regenerativen Medizin Potenzial und bietet einen Ansatz für die direkte Umprogrammierung von PB MNU zur Integration freien mesenchymalen Stammzellen, neurale Stammzellen, usw.

Unter Verwendung dieses Protokolls können wir Hunderte von Kolonien erhalten , von 1 x 10 5 nucleofected PB MNCs (1A und 1B). Die Umprogrammierung Wirkungsgrad beträgt etwa 0,2 bis 0,5% und die Kolonien exprimieren Pluripotenz Marker (1C und 1D). erzeugt iPSCs sind die beschriebenen Protokoll Integration frei und haben die Fähigkeit , teratoma die drei Keimblätter (Figuren 1E und 1F)</...

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, iPS-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen von Erwachsenen unter Verwendung nicht-integrierender episomaler Vektoren zu erzeugen. Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Stammzellen helfen, die iPS-Zellen für die Krankheitsüberwachung, Arzneimittelscreening und die reguläre Radio-Medizin erzeugen möchten. Unser Reprogrammierungsprotokoll ist sehr einfach, jedoch äußerst effizient. Nach dieser Vorgehensweise kann man die Technik der Blutzell-Umprogrammierung leicht erlernen. Die Qualität des Plasmas ist ebenso wichtig für eine erfolgreiche Umprogrammierung. Kontaminationen können die Umprogrammierungseffizienz verringern, daher empfehlen wir die Verwendung von Endofree-Kits zur Reinigung episomaler Plasmide.iPS-Zellen sind empfindlicher als andere Zellen. Die Vorbereitung von Zellen für mehr als einen Gentransfer während des Passagierens kann massive Zelltoden hervorrufen, insbesondere in frühen Passagen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle erforderlichen Kulturmedien gemäß dem beigefügten Manuskript vor.Anschließend 10 mL frische PB-Probe und zehn mL PBS-Puffer in einem 50-mL-Röhrchen vereinigen und gründlich mischen. Vor der Verwendung PBS auf Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius erwärmen. Danach 10 mL Ficoll auf den Boden des Röhrchens geben.Dieser Vorgang sollte langsam durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Ficoll-Schicht nicht mit dem PB vermischt wird. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 400 x g für 30 Minuten mit niedriger Beschleunigung und Verzögerung. Nach der Zentrifugation befinden sich die PB-MNCs in der weißen Schicht zwischen dem PB-Plasma und Ficoll. Aspirieren Sie langsam 10 mL PB-Plasma, ohne die weiße Ficoll-Schicht zu stören.Entnehmen Sie anschließend vorsichtig die weiße Schicht in ein neues 50-mL-Gefäß. Das Gesamtvolumen der gesammelten Zellen aus der weißen Schicht sollte etwa drei bis sechs mL betragen. Danach PBS hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 30 mL aufzufüllen, und gründlich mischen.Anschließend die Probe 10 Minuten bei 400 × g zentrifugieren. Nach 10 Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 20 mL Kulturmedium resuspendieren. Gut mischen und die Probe 5 Minuten bei 400 × g zentrifugieren, um den Großteil der Thrombozyten zu entfernen.Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in ein bis zwei mL IMDM. Die Zellen können sofort kultiviert oder für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Zum Einfrieren geben Sie eine gleiche Menge Kryokonservierungsmedium hinzu.Geben Sie die Zellen in Aliquots in Kryoröhrchen und überführen Sie diese sofort in einen Gefrierschrank bei -80 Grad Celsius. Bereiten Sie in diesem Verfahren fünf mL IMDM-Medium in einem 15-mL-Röhrchen vor. Tauchen Sie die gefrorenen PB-MNCs kurz in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, bevor Sie sie in das Röhrchen mit dem IMDM-Medium überführen.Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 × g für fünf bis zehn Minuten. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in erythroidem Medium. Danach zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mithilfe eines Hämozytometers.Kultivieren Sie anschließend die PB-MNCs in einer nicht gewebekulturbehandelten 6-Well-Platte mit je zwei mL Medium pro Mulde bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am Tag drei und Tag fünf geben Sie je ein mL frisches erythroides Medium direkt in jede Mulde, ohne das Medium zu erneuern. Am Tag sechs gewinnen Sie die PB-MNCs für die Nukleofektion.Ein Tag vor der Nukleofektion die mit Gewebekultur behandelte 6-Well-Platte mit 0,1 % Gelatine bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten vorbeschichten. Die inaktivierten MEF-Fütterungszellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen und unmittelbar in ein 15-mL-Röhrchen mit fünf mL MEF-Medium überführen. Anschließend bei 400 × g für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand entfernen.Entfernen Sie dann die Gelatine aus der 6-Loch-Platte und resuspendieren Sie das Zellpellet in MEF-Medium. Anschließend impfen Sie die inaktivierten MEF-Zellen in je zwei mL MEF-Medium in jede Vertiefung einer mit Gelatine vorbehandelten 6-Loch-Platte aus und kultivieren sie bei 37 Grad Celsius in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am Tag der Nukleofektion saugen Sie das MEF-Medium ab und ersetzen es durch ein mL erythroides Medium.Präequilibrieren Sie dann die Kulturplatte 10–30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Brutschrank mit 5 % Kohlendioxid. Geben Sie zwei Mikrogramm PEV OCT4 zu Sox2, ein Mikrogramm PEV MYC, ein Mikrogramm PEV KLF4 und 0,5 Mikrogramm PEV Bcl-XL in ein steriles 1,5-mL-Röhrchen. Erhitzen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf 50 Grad Celsius, um Kontaminationen zu verhindern, und kühlen Sie es anschließend auf Raumtemperatur ab.Anschließend 57 Mikroliter Nukleofektionspuffer und 13 Mikroliter Supplementpuffer zur Probe hinzufügen. Zwei mal zehn hoch sechs kultivierte PBMNCs durch Zentrifugation bei 200 × g für sieben Minuten in ein fünf mL fassendes Röhrchen gewinnen. Danach das Überstand entfernen und die Plasmid- und Nukleofektionspuffer-Mischung zum Zellpellet hinzufügen.Danach gründlich durch leichtes Anschlagen des Röhrchens mit dem Finger mischen. Anschließend die DNA in der Zellsuspension auf die vom Kit bereitgestellte Küvette übertragen und die Küvette verschließen. Am Nukleofektionsgerät das Programm U-008 auswählen.Setzen Sie danach die Küvette in den Halter ein und drücken Sie OK. Entfernen Sie anschließend die Küvette aus dem Halter. Geben Sie 0,5–1 mL vorgewärmtes erythroide Medium zu jeder Küvette hinzu und überführen Sie die Zellen unverzüglich in die vorab angeglichene MEF-Platte. Bei einigen Proben können Sie Tausende von Kolonien aus einem Milliliter Blut erhalten.Wenn Sie eine einzelne Kolonie für eine weitere Kultur auswählen möchten, müssen Sie möglicherweise ein zusätzliches Loch mit nur einer Million Zellen besiedeln. Unmittelbar vor dem Einbringen der Hypoxiekammer in den Inkubator schwenken Sie die Kammer mehrmals vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Kulturgefäßen zu erzielen. Anschließend überführen Sie die Platte in eine Hypoxiekammer.Spülen Sie die Kammer ein bis zwei Minuten lang mit einem Gasgemisch bei einer Rate von 20 Litern pro Minute. Verschließen Sie danach die Kammer und kultivieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius. Am zweiten Tag nach der Nukleofektion geben Sie zwei mL iPSC-Medium direkt in jedes Loch. Am vierten Tag nach der Nukleofektion drei mL Medium entfernen und zwei mL frisches iPSC-Medium hinzufügen. Zu diesem Zeitpunkt haben sich die meisten lebenden Zellen an der Füttererschicht angeheftet. Ab dem sechsten Tag nach der Nukleofektion das Medium alle zwei Tage wechseln, indem 500 Mikroliter verbrauchtes Medium zurückgelassen und zwei mL frisches E8-Medium ergänzt wird, das mit 0,25 Millimolar Natriumbutyrat versetzt ist, bis zu den Tagen 14–18.Hier ist ein Schema des Protokolls zur Reprogrammierung peripherer Blutzellen dargestellt. Dieses Bild zeigt das AP in einer Schale, und dieses zeigt eine typische ESC-ähnliche iPSC-Kolonie am 14. Tag nach der Nukleofektion von PB-MNCs. Hier sind repräsentative FACS-Diagramme von iPSCs in der fünften Passage, die TRA-1-60 oder SSEA4 exprimieren.Hier sind repräsentative konfokale Aufnahmen von iPSC-Kolonien, die NANOG und OCT4 exprimieren. Die Bilder zeigen die H&E-Färbung eines Teratoms, das alle drei Keimblätter umfasst. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man integrationsfreie iPS-Zellen aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen erzeugt.Nach der Einarbeitung können innerhalb von drei Wochen große Mengen an iPS-Zellen erzeugt werden, wobei der praktische Arbeitsaufwand weniger als drei Stunden beträgt. Wir haben ein einfaches, episomales Vektorsystem für die effiziente Umprogrammierung von Blutzellen entwickelt. Wir sind der Ansicht, dass dieses kostengünstige System leicht zu übernehmen ist, insbesondere in kleinen Laboren mit begrenzten Ressourcen.Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit menschlichem Blut und Plasmen gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen müssen getroffen werden, wie beispielsweise das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln während der Durchführung dieses Verfahrens.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Erfahren Sie, wie Sie mit episomalen Vektoren integrationsfreie iPS-Zellen aus menschlichen peripheren Blutzellen erzeugen. Diese effiziente Methode ermöglicht die Reprogrammierung für Stammzellforschung und regenerative Medizin.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren (Video) | JoVE Journal

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

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