Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Gewebeprobe reproduzierbar für die Peptid-Massenspektrometrie-Bildgebung vorzubereiten. Diese Methode ermöglicht es Anfängern, ihre eigenen Arbeitsabläufe in der bildgebenden Massenspektrometrie zu entwickeln, ohne langwierige empirische Bestimmungen durchführen zu müssen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hochgradig reproduzierbar ist, einfach zu implementieren ist und kostengünstige Methoden verwendet.

Um die mit Nitrozellulose beschichteten Objektträger vorzubereiten, pipettieren Sie 40 Mikroliter flüssige Nitrozellulose auf eine Kante des leitfähigen Indiumzinnoxid-Objektträgers. Ziehen Sie die Nitrozellulose unter Oberflächenspannung mit einem normalen Objektträger aus Glas über den Objektträger, um eine gleichmäßige Dünnfilmbeschichtung zu erzeugen. Lassen Sie die Nitrozellulose 20 Sekunden lang bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie dann bis zur Verwendung bei Raumtemperatur.

Erstellen Sie als Nächstes benutzerdefinierte Dampfkammern, indem Sie ein Stück dickes Löschpapier zuschneiden, das groß genug ist, um in die untere Hälfte einer Standard-Petrischale aus Kunststoff zu passen. Schneiden Sie das Papier so ab, dass in der Mitte ein rechteckiger Streifen in der gleichen Größe wie ein Objektträger übrig bleibt. Lassen Sie so viel Überschuss übrig, dass das Papier seine Position in der Petrischale behält.

Bei FFPE-Gewebe montieren Sie die Schnitte schwimmend auf die mit Nitrozellulose vorbeschichteten ITO-Objektträger, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang in frisches Xylol, um Paraffinreste zu entfernen. Waschen Sie die entparaffierten Proben, indem Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in eine abgestufte Lösungsmittelserie tauchen, die aus einer Ethanol-Wasserlösung mit 70 Vol.-% und 100 %igem Ethanol besteht.

Tauchen Sie dann die Objektträger zwei Minuten lang in die Flüssigkeit von Carnoy. Tauchen Sie die Objektträger schließlich 30 Sekunden lang in eine Reihe von 100 % Ethanol, Reinstwasser und erneut 100 % Ethanol. Laden Sie die Objektträger in eine Kunststoff-Objektträgerbox, die bis zum Rand mit 20 Millimolar Tris HCO gefüllt ist.

Verschließen Sie die Schachtel und stellen Sie sie in ein Wasserbad mit 500 Millilitern Wasser, so dass die Schachtel den Boden der Badewanne berühren kann. Anschließend erhitzen Sie die Box 15 Minuten lang bei 120 Grad Celsius in einem Schnellkochtopf, der einen Betriebsdruck von 70 Kilopascal erreichen kann. Nehmen Sie die Objektträger heraus, lassen Sie sie abkühlen und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.

Nach der Hydrolyse beschichten Sie die Proben mit 10 Mikrolitern Trypsinlösung in Reinstwasser, indem Sie zuerst 10 Mikroliter der Lösung auf den Rand des Gewebeschnitts pipettieren. Ziehen Sie dann das Tröpfchen mit derselben Pipettenspitze unter Oberflächenspannung über die gesamte Oberfläche des Gewebes. Nachdem Sie die Proben bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen haben, montieren Sie sie mit Autoklavenband an beiden Rändern des Objektträgers oben in der zuvor konstruierten Dampfkammer.

600 Mikroliter einer Lösung, die eine Eins-zu-Eins-Volumenmischung aus 100 % Acetonitril und 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat enthält, werden vorsichtig auf den Löschpapierfinger im unteren Teil der Petrischale pipettiert, bis der Finger gleichmäßig nass zu sein scheint. Pipettieren ist von entscheidender Bedeutung, da falsches Pipettieren zur Delokalisierung Ihrer Matrix- und Oberflächenanaloide führt, wodurch die in Ihrer Probe enthaltenen räumlichen Informationen zerstört werden. Platzieren Sie die obere Hälfte der Dampfkammer auf der unteren Hälfte, stellen Sie sicher, dass der Papierfinger und der Probenobjektträger perfekt ausgerichtet sind, und versiegeln Sie die Kammer um den Äquator herum mit Paraffinfilm.

Lassen Sie die Probe über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um einen vollständigen Aufschluss zu ermöglichen. Nach der Verdauung lassen Sie den Probenobjektträger auf einer fünfstelligen mikroanalytischen Waage. Montieren Sie den Objektträger auf den Kühlfinger der Sublimationsapparatur und befestigen Sie ihn mit Kupferband auf die gleiche Weise, wie für die Dampfkammer beschrieben.

Geben Sie 300 Milligramm CHCA-Matrix in eine Glaspetrischale am Boden der Kammer und verteilen Sie sie gleichmäßig, um eine dünne Schicht aus Matrixkristallen zu bilden. Bauen Sie den Sublimator zusammen. Und die beiden Hälften mit der Hufeisenklammer sichern.

Hängen Sie das zusammengebaute Gerät 15 bis 20 Zentimeter über einem auf 220 Grad Celsius vorgeheizten Sandbad auf, indem Sie es in einen Metallring legen, der mit einem Retortenständer verbunden ist. Schließen Sie die Kammer an die Vakuumquelle an, schalten Sie das Vakuum ein und lassen Sie es fünf Minuten lang auf etwa 25 Millitorr stabilisieren. Füllen Sie den Kühlfinger nach oben mit Eis und fügen Sie 50 Milliliter Wasser hinzu.

Lassen Sie das Gerät weitere fünf Minuten einwirken, bevor Sie fortfahren. Senken Sie die Kammer auf die Oberfläche des Ständers ab und stellen Sie sicher, dass der Sand den Boden der Kammer vollständig berührt. Lassen Sie es 45 Minuten einwirken, um eine ideale Beschichtung von 0,22 Milligramm pro Quadratzentimeter zu erhalten.

Entfernen Sie nach 45 Minuten die Kammer aus dem Sandbad, indem Sie den Metallring anheben, und entlüften Sie die Kammer. Nach der Sublimation montieren Sie den Probenobjektträger wie zuvor in der Oberseite der zuvor konstruierten Dampfkammer. Pipettieren Sie vorsichtig 600 Mikroliter einer Lösung, die eine Eins-zu-Eins-Volumenmischung aus Acetonitril und Trifluoressigsäure in Wasser enthält, auf das Löschpapier im unteren Teil der Petrischale, um eine gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten.

Bauen Sie als Nächstes die Kammer zusammen und stellen Sie sicher, dass die Papierlasche und der Objektträger perfekt ausgerichtet sind. Lassen Sie die Kammer eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Scannen Sie das Dia in einem Flachbettscanner, um ein digitales Bild zu erstellen.

Laden Sie die Probe in das Massenspektrometer und analysieren Sie sie dann mit der entsprechenden Softwareplattform. Analysieren Sie abschließend die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier ist eine korrekt verarbeitete Gewebeprobe zu sehen, die bei 50 Mikrometern abgebildet wurde und eine gute Makrostruktur und einen deutlichen Unterschied zwischen weißer und grauer Substanz aufweist.

Erfolgreich verglichene Proben zeigen eine klare Differenzierung an verschiedenen Gewebestellen. Hier gibt es einen klaren Bereich der Hochregulierung des Peptids, der durch ein Masse-Ladungs-Verhältnis von 1.085 im Bereich der weißen Substanz dargestellt wird, wie er durch weiße Bereiche dargestellt wird. Im Gegensatz dazu zeigt diese falsch vorbereitete Stichprobe ein hohes Maß an Delokalisierung.

Die Muster der Moleküle, die in den drei Panels vorhanden sind, zeigen deutlich, dass es keine klare Definition zwischen biologischen Regionen oder Unterschiede in der Häufigkeit der angezeigten Moleküle gibt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine wirklich gute Vorstellung davon haben, wie Sie Ihre eigenen Proben für die Peptid-Imaging-Analyse vorbereiten können. Mit dem richtigen Verfahren kann diese Methode innerhalb von acht Stunden über zwei Tage durchgeführt werden, was einen Verdauungsschritt über Nacht ermöglicht.

Bei der Vorbereitung dieser Methodik ist es wichtig, bei jedem Schritt vorsichtig zu sein. Jede physische Beschädigung des Gewebes zerstört die in Ihrer Probe enthaltenen räumlichen Informationen. Wir hatten die Idee zu dieser Methodik, als wir mit unseren eigenen IMS-Weltraumuntersuchungen begannen und feststellten, dass es keine anderen endgültigen Methoden gab, die veröffentlicht wurden.

Mit kleinen Modifikationen kann unsere Methodik auf die Analyse von Proteinen, Peptiden, Lipiden und anderen kleinen Molekülen angewendet werden. Nach diesem Verfahren können dann andere histologische Techniken wie Immunfluoreszenz und Hämatoxylin- und Eosin-Färbung auf Ihre Probe angewendet werden, um einen Referenzpunkt für Ihre bildgebenden Massenspektrometriedaten zu erhalten. Bei der Arbeit mit potenziell explosiven Chemikalien, wie z. B. flüssiger Nitrozellulose, ist es wichtig, die richtigen Sicherheitsverfahren einzuhalten.

Die Minimierung des Arbeitsvolumens und die sofortige Entsorgung Ihres Abfalls ist von entscheidender Bedeutung.