Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Das übergeordnete Ziel dieses mikrofluidischen Versuchsaufbaus ist es, die Langzeitbeobachtung einzelner Bakterienzellen unter konstanten, hochgradig kontrollierten Umweltbedingungen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Physiologie zu beantworten, z. B. wie die langfristigen Reaktionsmuster einzelner Zellen auf Stress aussehen oder wie sich ein heterogener Phänotyp in einer Population mit der Zeit verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir einzelne Zelllinien über Dutzende oder sogar Hunderte von Generationen unter konstanten, einheitlichen und streng kontrollierten Umweltbedingungen beobachten können.

Nach der Herstellung des PDMS-Polymers gemäß dem Textprotokoll legen Sie einen Silikonmaster auf ein Stück unbeschädigte Aluminiumfolie in einer Petrischale aus Styropor. Gießen Sie das entgaste PDMS-Gemisch bis zu einer Tiefe von etwa fünf Millimetern über den Master. Dann entgasen Sie das Gericht für mindestens 10 Minuten.

Härten Sie das PDMS mindestens eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius im Ofen aus und kühlen Sie es auf Raumtemperatur ab. Entfernen Sie dann die Aluminiumfolie mit dem Master und dem ausgehärteten PDMS von der Platte. Schneiden Sie es vorsichtig ein und ziehen Sie die Alufolie von der Rückseite des Masters ab.

Ziehen Sie dann das PDMS vorsichtig vom Master ab. Als Wafer eignen sich typischerweise mehrere mikrofluidische Vorrichtungen mit leicht unterschiedlichen Abmessungen. Verwenden Sie ein sauberes, scharfes Skalpell, um ein einzelnes Gerät auf die richtige Größe zu schneiden.

Legen Sie ein Stück durchscheinendes Büroklebeband über die gemusterte Seite des Geräts, um die Sichtbarkeit der gemusterten Merkmale zu verbessern. Die Ein- und Auslassöffnungen sind als kreisförmige Bereiche an gegenüberliegenden Enden der sichtbaren Fluidikkanäle gekennzeichnet. Drehen Sie das PDMS-Gerät mit der Musterseite nach unten um und stanzen Sie mit einem 0,75-Millimeter-Biopsienstanzer durch das Gerät zu den markierten Punkten.

Entsorgen Sie dann die Stanzungen. Möglicherweise ist eine Pinzette erforderlich, um die Stanzungen vom Gerät zu entfernen. Setzen Sie das gereinigte und getrocknete Deckglas und das PDMS-Gerät in einen Sauerstoff-Plasmareiniger ein und behandeln Sie das Gerät mit den hier gezeigten Einstellungen.

Entfernen Sie unmittelbar nach Beendigung der Plasmabehandlung das Gerät und das Deckglas vom Plasmareiniger. Kehren Sie das PDMS um und platzieren Sie es so in der Mitte des Deckglases, dass die Musterseite das Glas berührt. Achten Sie darauf, dass die Zuführkanäle mit dem langen Zugang des Deckglases ausgerichtet sind.

Drücken Sie sehr vorsichtig nach unten, um sicherzustellen, dass das PDMS gegen das Glas abdichtet. Backen Sie das zusammengebaute Gerät mindestens eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius. Überprüfen Sie nach dem Backen manuell, ob das PDMS mit dem Glas verbunden ist, indem Sie vorsichtig auf eine Ecke des Geräts drücken.

Nachdem Sie Polymerschläuche gemäß dem Textprotokoll geschnitten haben, montieren Sie Y-Übergänge für Quetschventile, falls Sie diese verwenden, indem Sie zwei Zentimeter lange flexible Silikonschläuche abschneiden und an den oberen Widerhaken der Y und einen Zentimeter lange Silikonschläuche an der unteren Tülle der Y befestigen. Schneiden Sie anschließend 10 Zentimeter lange Polymerschläuche ab und verbinden Sie sie an einem Ende mit der Schalterverbindung, indem Sie sie in die ein Zentimeter langen Silikonschlauchsegmente einführen Verbinden Sie die Schlauchlängen am anderen Ende mit 21-Gauge-Nadeln, die von ihren Kunststoffspritzenadaptern entfernt und etwa 90 Grad etwa neun Millimeter vom Nadelende gebogen wurden. Verbinden Sie stumpfe 21-Gauge-Nadeln mit einem Ende der Schlauchsegmente, die von den Spritzen zum Schaltgerät verlaufen, indem Sie die Nadeln in den Schlauch einführen. Führen Sie die anderen Enden jedes Schlauchabschnitts in die Silikonschlauchsegmente an den Einlasstüllen der Y-Übergänge ein.

Nach dem Befüllen der Spritzen mit bakteriellem Wachstumsmedium, ergänzt mit BSA, gemäß dem Textprotokoll, verbinden Sie die geladenen Spritzen mit den vorbereiteten 21-Gauge-Nadeln, befestigen Sie sie an den Einlaufschlauch und laden Sie die Spritzen in die Spritzenpumpen. Spülen Sie die Luft aus den Einlassleitungen, indem Sie die Spritzenpumpen mit einer hohen Durchflussrate laufen lassen, die Spritzenpumpen vertikal ausrichten und die Spritzen anklopfen, um Luftblasen nach oben zu bringen. Sobald die Luft aus der Spritze gespült wurde, positionieren Sie die Spritzenpumpe horizontal und klopfen oder schnippen Sie nach und nach auf die Polymerleitungen von den Spritzen durch die Schaltvorrichtung, um alle Luftblasen zu entfernen und zu reinigen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Spritzenbank, wenn Sie das Medium wechseln. Nachdem die Luftblasen gespült wurden, stellen Sie die Phase-II-Spritzenpumpe auf 1,5 Mikroliter pro Minute ein und unterbrechen Sie dann den Durchfluss. Platzieren Sie kleine Bindemittelklammern auf den Segmenten des flexiblen Schlauchs an dem Ast der Y-Übergänge, der der zweiten Mediumphase entspricht, und fahren Sie mit der Phase-1-Pumpe fort, um das zweite Medium stromabwärts der Y-Überleitung zu spülen.

Um das PDMS-Gerät zu beladen, setzen Sie zunächst leere, dünne Mikropipettenspitzen mit Gelladung vorsichtig in die Auslasslöcher des mikrofluidischen Geräts ein. Passivieren Sie das Gerät unter Verwendung dünner Gelladespitzen mit der P200-Mikropipette, indem Sie Medium mit einem Milligramm pro Milliliter BSA in die Einlasslöcher injizieren und dabei die Spitzen und die Auslasslöcher beobachten, um die Füllung der mikrofluidischen Kanäle zu überwachen. Inkubieren Sie das Gerät etwa fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Laden Sie anschließend mit ähnlichen Spitzen jeden Kanal mit den resuspendierten Zellen mit den Spitzen im Auslasskanal, um den Fortschritt der Zellen durch das Gerät zu überwachen. Entfernen Sie vorsichtig die Gelladespitzen aus den Auslasslöchern und arbeiten Sie nacheinander, um Schäden am Gerät zu vermeiden. Zentrifugieren Sie das Gerät in einer Tisch-Mikrozentrifuge in einem geeigneten Rotoradapter bei ca. 6.000 g für 10 Minuten.

Überprüfen Sie das erfolgreiche Laden unter dem Mikroskop, ohne das Gerät jedoch am Tischeinsatz des Objektträgerhalters zu befestigen. Montieren Sie das geladene Gerät vorsichtig auf einem Tischeinsatz, indem Sie das Deckglas auf beiden Seiten des PDMS an die Unterseite des Tischeinsatzes kleben. Drehen Sie die Gerätebaugruppe um, sodass das PDMS nach oben zeigt, und legen Sie es auf eine weiche Oberfläche, z. B. ein staubfreies Tuch.

Stellen Sie die Durchflussmenge der Phase-1-Spritzenpumpe auf 35 Mikroliter pro Minute ein. Arbeiten Sie dann mit einer Bahn nach der anderen, indem Sie die Einlaufnadel und dann die Auslassnadel einführen, die zum Abfallbecher führt. Nachdem Sie das Gerät visuell auf Undichtigkeiten untersucht haben, untersuchen Sie den Auslassschlauch auf das Auftreten von überschüssigen Zellen, die als trüber Streifen im mittleren Meniskus erscheinen und sich langsam in Richtung des Abfallbechers bewegen.

Sobald das Gerät etwa 15 Minuten lang gelaufen ist, stellen Sie die Phase-1-Spritzenpumpe auf 1,5 Mikroliter pro Minute ein und unterbrechen Sie den Durchfluss. Bringen Sie die gesamte Pumpe und den Geräteapparat an ein inverses Fluoreszenzmikroskop und starten Sie den Phase-1-Mediumfluss mit 1,5 Mikrolitern pro Minute neu. Montieren Sie den Tischeinsatz mit dem Gerät vorsichtig am Mikroskop und verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um den Einlass- und Auslassschlauch zu verlegen.

Suchen Sie die entsprechenden Positionen am Gerät für die Bildgebung, und beginnen Sie wie gewünscht mit der Bildgebung. Beachten Sie, dass die Zellen in der Regel einige Stunden benötigen, um das exponentielle Phasenwachstum im stationären Zustand zu lesen, und dass der Beginn der Bildaufnahme wie gewünscht verzögert werden kann, so dass die Bildgebung nach der Äquilibrierungsphase beginnt. Um das Medium zwischen aufeinanderfolgenden Bildgebungsrunden zu wechseln, unterbrechen Sie den Durchfluss der Phase-1-Spritzenpumpe, lösen Sie vorsichtig die Bindemittelklammern vom Phase-2-Silikonschlauch und bewegen Sie sie jeweils zum Silikonschlauch am Phase-1-Zweig des Y-Übergangs, unterbrechen Sie dann den Fluss der Phase-2-Spritzenpumpe und fahren Sie mit der Bildgebung fort.

Wie durch Phasenkontrastmikroskopie beurteilt, würde die anfängliche Zellbeladung vor dem Anbringen der mikrofluidischen Rohrleitungen an das Gerät als erfolgreich angesehen werden, wenn alle oder fast alle mikrofluidischen Seitenkanäle eine oder mehrere Bakterienzellen enthielten. Sobald das Gerät zum ersten Mal beladen ist, wird es mit einer relativ hohen Durchflussrate äquilibriert. Wie hier gezeigt, sollte die mikroskopische Untersuchung eines äquilibrierten Geräts einige Zellen in den meisten Seitenkanälen in einer einzigen Reihe zeigen.

Sobald ein äquilibriertes Gerät unter einem Fluss von 1,5 Mikrolitern pro Minute bei 37 Grad Celsius auf das Mikroskop gelegt wird, nehmen die Zellen im Laufe von etwa zwei Stunden ein gleichmäßiges und konstantes exponentielles Phasenwachstum wieder auf. Zellen, die das exponentielle Phasenwachstum wieder aufgenommen haben, können mit Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie mindestens 24 Stunden lang zuverlässig abgebildet werden. Die Einführung eines Mediumschalters erweitert das Spektrum der durchführbaren Experimente, erhöht aber auch die Häufigkeit katastrophaler Zelltodereignisse durch das Vorhandensein von Luftblasen oder Zellclustern am Einlass, die sich lösen und den Fütterungskanal passieren.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Durch die Anwendung dieses Verfahrens mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reportern, Stämmen und Umweltbedingungen kann eine Vielzahl physiologischer Phänomene untersucht werden, einschließlich sehr seltener oder vorübergehender Ereignisse.