Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebende Zellen durch Wachstum und Teilung mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, so dass der Einfluss der Zellgeschichte und der Abstammung auf die zelluläre Entwicklung von Bakterien untersucht werden kann. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst von einem flüssigen Medium mit relativ hohen Nährstoffkonzentrationen in ein flüssiges Hungermedium überführt werden. Als nächstes ein mikroskopischer Objektträger, auf dem die Bakterienzellen zu einer Mikrokolonie heranwachsen.

Die Monoschicht wird vorbereitet. Anschließend wird ein Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie-Film aufgenommen. Abschließend wird der Film verarbeitet und die Daten analysiert.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Entwicklung einer einzelnen Bakterienzelle durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der Durchflusszytometrie und der Standardmikroskopie besteht darin, dass sie die Überwachung der Proteindynamik, des zellulären Verhaltens und der Entwicklung einzelner Zellen im Laufe der Zeit ermöglicht, was zeigt, dass das Verfahren in Kegel sein wird, ein Doktorand aus meinem Labor Um b tuus Zellen von minus 80 Grad Celsius zu impfen, Vorräte in 10 Millilitern Zeitraffermikroskopie oder TLM-Medium in sterilen Schüttelkolben, die bei Bedarf mit Antibiotika ergänzt werden, die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius und 225 U/min in einem sterilen Schüttelkolben züchten, um die Zellen eins bis 10 in Prewarm, chemisch definiertem Medium oder CDM ohne Antibiotika zu plündern, die feinsten Zellen der Biene bis zur mittleren exponentiellen Phase züchten, Dies dauert etwa vier Stunden. Messen Sie die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern und verdünnen Sie die Zellen auf etwa 600 von 0,035.

Mit CDM. Dieser OD stellt sicher, dass einzelne Zellen mit entsprechendem Abstand zwischen den Zellen auf dem Objektträger für die Zeitraffermikroskopie gesichtet werden. Eine Stunde, bevor die Zellen das mittlere exponentielle Wachstum erreichen.

Bereiten Sie den Objektträger vor, indem Sie zwei Objektträger mit 70 % Ethanol und Wasser reinigen. Entfernen Sie eine der Kunststoffabdeckungen von einem Genrahmen und achten Sie darauf, dass die Kunststoffabdeckung auf der anderen Seite des Rahmens nicht demontiert wird. Befestigen Sie den Genrahmen in der Mitte eines der Objektträger, indem Sie ihn zuerst zur Seite kleben und dann den Rest mit einem Fingernagel führen.

Verwenden Sie eine Mikrowelle, um 150 Milligramm hochauflösende, niedrigschmelzende Aromen aufzulösen. Stellen Sie sicher, dass das Aroma in 10 Millilitern CDM vollständig aufgelöst ist, um Hintergrundfluoreszenz zu verhindern. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des warmen Agro-CDM in die Mitte des Genrahmens und stellen Sie sicher, dass der gesamte Bereich einschließlich der Ränder vollständig bedeckt ist.

Schnelles Arbeiten, um ein übermäßiges Austrocknen der Aros zu verhindern. Platzieren Sie den zweiten Objektträger auf dem mit Aros CDM gefüllten Genrahmen und versuchen Sie, Luftblasen zu vermeiden. Legen Sie das Sandwich 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius in eine horizontale Position, damit sich das Agros ausreichend verfestigen kann.

Sobald der Aros vorsichtig fest geworden ist, schieben Sie das obere Glas ab. Schneide mit einer Rasierklinge etwa fünf Millimeter breite Agrostreifen aus, auf denen die Bakterien wachsen werden. Pro Objektträger können maximal drei Streifen verwendet werden, die auf beiden Seiten durch etwa vier Millimeter Abstand voneinander entfernt sind.

Diese Räume liefern Luft, die für das Wachstum von Blu unerlässlich ist. Entfernen Sie vorsichtig die zweite und letzte Plastikabdeckung vom Genrahmen, um die klebrige Seite freizulegen. Laden Sie einzelne Zellen in etwa 2,5 Mikrolitern Flüssigkeit auf das feste Medium, beginnend an der Oberseite des Agros-Pads, ohne es zu berühren.

Lassen Sie das Medium mit der Pipettenspitze gleichmäßig verteilen, indem Sie den Objektträger nach oben und unten kippen. Setzen Sie eine saubere Mikroskopabdeckung auf den Genrahmen, um das Deckglas vollständig zu befestigen. Verwenden Sie einen Fingernagel, um Druck auszuüben, also nachdem die Zellen geladen wurden.

Es ist wichtig, lange genug zu warten, bis die Flüssigkeit getrocknet ist, damit Sie keine schwimmenden Zellen und Wachstum in mehreren Schichten erhalten. Wenn die Zellen jedoch zu lange getrocknet werden, haben sie Probleme, zu einer Mikro-Cholon-Monoschicht heranzuwachsen. Die Zeit, die zum Trocknen Ihrer Objektträger benötigt wird, hängt also vom Experiment ab und kann nicht gemessen werden.

Und folglich muss man natürlich ein Gefühl dafür bekommen: Um Autofokus-Probleme zu vermeiden, wird der Objektträger in den ersten Stunden des Zeitraffer-Experiments eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius vorgewärmt, um sich auf die Zeitraffermikroskopie vorzubereiten. Die Klimakammer mindestens zwei Stunden vorwärmen. Wählen Sie vor Beginn des Experiments die geeigneten Objektivfilter und den dichroitischen Spiegel entsprechend Ihrem Versuchsaufbau aus.

Achten Sie bei langen Experimenten darauf, dass ein UV-Filter zwischen der Lichtquelle und der Probe platziert wird. Blockieren Sie außerdem, wenn möglich, einen Teil des Anregungslichts mit Neutraldichtefiltern, um die Belichtung zu minimieren. Programmieren Sie das Experiment entsprechend dem spezifischen Versuchsaufbau.

Es ist ratsam, die für bestimmte Konstrukte erforderliche Lichtmenge sowie die Autofokus-Einstellungen für andere Zeitraffermikroskope oder Bakterien vor dem eigentlichen Experiment zu bestimmen. Kürzere Belichtungszeiten und geringeres Anregungslicht minimieren das Ausbleichen und die Phototoxizität Verwenden Sie skopisches Licht für die Autofokus-Funktion. Legen Sie schließlich den vorbereiteten Objektträger in die vorwarme Klimakammer des Mikroskops und überwachen Sie das Auswachsen einzelner Zellen zu einer Mikrokolonie-Monoschicht bei 30 Grad Celsius.

Ein erfolgreiches Zeitraffer-Fluoreszenzexperiment wird eine Mikrokolonie-Monoschicht erzeugen, die sich vollständig im Sichtfeld befindet. Am Ende des Experiments in diesem Film befindet sich das Hellfeld auf der linken Seite und die Fluoreszenz ist zu sehen. Rechts.

Hier ist ein Beispiel für eine B-Subtles-Mikrokolonie, in der einige Zellen übereinander wuchsen, was es schwierig machte, ihre Geschichte genau zurückzuverfolgen und ihre Fluoreszenzwerte korrekt zu messen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mikroskopische Probe erfolgreich für die Zeitraffermikroskopie vorbereiten und wie Sie eine Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie durchführen. Experimentieren Sie mit BACE-Zellen.