Name: Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zur Beobachtung lebender Bakterienzellen während Wachstum und Teilung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Protein Dynamik und Zellverhalten bei Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae.

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Die Arbeit in der Gruppe der JWV wird von einem EU Marie-Curie Reintegration Fellowship, ein Sysmo2 Grant (NWO-ALW/ERASysBio), eine Horizon-Stipendium (ZonMw) und durch eine VENI Gemeinschaft (NWO-ALW) unterstützt. Die Gruppe der OPK wird von mehreren Standard-Zuschüsse (NWO), ein SYSMO1 (IGdeJ) und SYSMO2 gewähren, eine ESF Eurocores SynBio gewähren (SynMod) und durch die Kluyver Center for Genomics of Industrial Fermentation und die Top-Instituts für Lebensmittel und Ernährung unterstützt.

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<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li>
<li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSICIC%3A+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li>
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<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Gegensatz zu vielen anderen einzelnen Zelle Techniken kann der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hier beschriebene Methode verwendet, um die Geschichte einer bestimmten Zelle mit Hinweis auf seine Vorfahren, sein Verhalten und Division Veranstaltungen folgen werden. In Kombination mit fluoreszenzmarkierten Ziel Promotoren oder Proteine, können umschriebene Entwicklungsstörung Stoffwechselwegaktivierung in Zeit-und Protein-Lokalisierung sowie Protein Dynamik kann während bakterielle Entwicklung beobachtet werden folgen. Wie bereits erwähnt, können Studien konzentriert sich auf verschiedene Bakterienarten durch die Anpassung der Wachstumsbedingungen nach den Anforderungen für ein bestimmtes Bakterium durchgeführt werden. Die einzigen Einschränkungen stießen wir an die Wachstumsbedingungen und Stichprobengröße zusammen. Aufgrund einer geschlossenen Umgebung können mittlere Bedingungen nicht während des Experiments geändert werden. Darüber hinaus kann ein Maximum von vier Stämme pro Experiment effizient überwacht werden. Angesichts einige kritische Schritte beschrieben, die einzelne Zelle Analyseverfahren kann hier leicht unter Verwendung eines automatisierten Mikroskop werden. Im Folgenden wird ein Überblick über diese wichtigen Schritte gegeben werden. Detaillierte Informationen finden Sie im Haupttext zu finden Allgemeine Vorbereitung:. Es ist ratsam, den Autofokus-Einstellungen für ein bestimmtes Bakterium vor dem Experiment erforderlich zu überprüfen. Ebenso sollte in etwa die optimalen Einstellungen für die Visualisierung von Fluoreszenz im Voraus bestimmt werden, wenn möglich. Darüber hinaus folgt eine vorbereitete time-line hilft, alle wesentlichen bereit, in der Zeit verwenden (Vorwärmen des Mikroskops Kammer, die Programmierung der Einstellungen des Mikroskops, die Vorbereitung der Folie 1 Stunde, bevor die Zellen in der gewünschten Wachstumsphase befinden, siehe Abbildung 1) haben . Das Wachstum der B. subtilis in TLM und CDM: TLM und CDM sind chemisch Hunger Medien definiert, in dem B. subtilis wächst nur langsam. Der Zeitraum, in dem die Zellen in den Medien angebaut werden müssen möglicherweise verlängert abhängig von der spezifischen Belastung werden. Das langsame Wachstum verhindert, dass Zellen häufen sich gegenseitig Vorbereitung des Mikroskops Probe:. Luftblasen zwischen den Gen-Rahmen, den Objektträger und dem Deckglas müssen verhindert werden, um umfangreiche Trocknen der Agarose-basierte Medium zu verhindern. Das gleiche gilt für das Medium / Deckglas-Schnittstelle. Es ist unverzichtbar, dass die Zellen genügend trocken, zum Schwimmen und / oder mehrschichtigen Wachstum zu verhindern Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie:. Vorwärmen der Folie sowie die Klimakammer ist entscheidend für die großen Autofokus Probleme zu vermeiden. Die Zellen sind in der Mitte einer Agar-Pad gewählt werden, da diese die höchste Chance, in Feld und Fokus während des Experiments (vorausgesetzt, die Probe wurde gut genug getrocknet) zu bleiben. Es können maximal 10 Stellen pro Experimente noch einwandfrei funktioniert. Nachdem Sie die erste Zelle des Interesses nur die Software, um den Fokus einzustellen (siehe Text für Details). Prüfen Sie, ob die Zellen noch in Fokus in den ersten Stunden des Versuches in 30 min Abständen Analyse:. Es ist wichtig, vor der erweiterten Analyse-Verfahren zu überprüfen, ob der Hintergrund des Mediums ähnliche Werte hat in der Fluoreszenz-Kanäle. Kleine Staubpartikel, mittel-Komponenten, verschmutzte Linsen oder winzige Agarose Klumpen können lokal erhöhte Fluoreszenz beitragen, dass der Film schwer oder unmöglich zu Trouble Shooting zu analysieren:. Wenn die Zellen auf der jeweils anderen zu wachsen, könnte dies entweder darauf hin, dass das Deckglas wurde angebracht zu früh oder dass das Medium nicht für das Wachstum von Mikrokolonien Monoschichten geeignet. Wenn Zellen von Interesse kontinuierlich vorzeitig sterben, während andere Zellen auf dem Objektträger glücklich zu teilen, möchten Sie vielleicht zu prüfen, ob Sie die UV-Filter setzen in Position. Es könnte auch dazu beitragen, die Belichtungszeit oder die Lichtintensität während der langen Experimenten zu verringern.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gene Rahmen </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> hochauflösende niedrig schmelzenden Agarose </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> großen Deckglas </td><td> mehrere </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> wenn gewünscht, Membran-Farbstoff, z. B. FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> andere Membran Farbstoffe sind ebenfalls erhältlich: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Zeitraffer-Mikroskop mit Klimakammer </td><td> mehrere </td><td></td><td> Details für unser Gerät in den entsprechenden Abschnitten </td></tr></tbody></table>

live cell imaging von bacillus subtilis und streptococcus pneumoniae verwendung von automated zeitraffer-mikroskopie

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

In den letzten Jahren beschäftigen sich Wissenschaftler zunehmend bewusst, dass die durchschnittlichen Daten von mikrobiellen Population basierten Experimenten nicht repräsentativ für das Verhalten, Status oder Phänotyp der einzelnen Zellen. Aufgrund dieser neuen Erkenntnisse die Anzahl der einzelnen Zelle Studien steigt kontinuierlich (neuere Übersichten siehe 1,2,3). Allerdings wissen viele der einzelnen Zelle angewandten Techniken nicht zulassen, dass die Überwachung der Entwicklung und das Verhalten einer bestimmten Zelle in der Zeit (zB Durchflusszytometrie oder Standard-Mikroskopie). Hier bieten wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung eines Mikroskopie-Methode in mehreren neueren Studien 4, 5, 6, 7, die nach und Aufzeichnung (Fluoreszenz) einzelnen bakteriellen Zellen von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae durch Wachstum und Teilung für viele Generationen ermöglicht werden. Die resultierenden Filme können verwendet werden, um phylogenetische Stammbäume durch Rückverfolgung der Geschichte einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population, die von einem gemeinsamen Vorfahren entstanden zu konstruieren. Das Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie Methode kann nicht nur verwendet werden, um Wachstum, Teilung und Differenzierung der einzelnen Zellen zu untersuchen, sondern auch um die Wirkung von Zelle Geschichte und Abstammung auf spezifische zelluläre Verhalten zu analysieren. Darüber hinaus ist Zeitraffer-Mikroskopie ideal geeignet, um die Genexpression Dynamik und Proteinlokalisierung während der bakteriellen Zellzyklus zu untersuchen. Die Methode wird erläutert, wie die Bakterienzellen vorbereiten und bauen den Objektträger zu den Auswuchs von einzelnen Zellen in eine Mikrokolonie ermöglichen. Kurz gesagt, sind einzelne Zellen auf einem semi-feste Oberfläche aus Wachstumsmedium mit Agarose, auf dem sie wachsen und sich teilen unter dem Fluoreszenzmikroskop in einem temperierten Klimakammer ergänzt gesichtet. Die Bilder werden in bestimmten Abständen erfasst und später analysiert mit dem Open-Source-Software ImageJ.

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

In den letzten Jahren wurde Wissenschaftlern zunehmend bewusst, dass Durchschnittswerte aus Experimenten mit mikrobiellen Populationen nicht ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebende Zellen während ihres Wachstums und ihrer Teilung mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, um den Einfluss der Zellgeschichte und Abstammung auf die zelluläre Entwicklung von Bakterien untersuchen zu können. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst von einem flüssigen Medium mit relativ hohen Nährstoffkonzentrationen in ein flüssiges Nährstoff-Verarmungsmedium überführt werden. Anschließend wird ein mikroskopischer Objektträger vorbereitet, auf dem die Bakterienzellen zu einer Mikrokolonie heranwachsen.Es wird eine Einschichtzelle vorbereitet. Anschließend wird eine zeitraffende Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahme erstellt. Abschließend wird die Aufnahme verarbeitet und die Daten werden analysiert.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Entwicklung einer einzelnen Bakterienzelle mittels zeitraffender Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie und der Standardmikroskopie besteht darin, dass sie die Beobachtung der Proteindynamik, des zellulären Verhaltens und der Entwicklung einzelner Zellen über die Zeit ermöglicht. Die Demonstration des Verfahrens wird von Cone, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt. Um b tuus vorzubereiten, impfieren Sie Zellen von minus 80 Grad Celsius stammenden Stämmen in 10 Milliliter zeitraffender Mikroskopie-Medium oder TLM-Medium in sterilen Schüttelkolben, die gegebenenfalls mit Antibiotika ergänzt sind. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius und 225 U/min in einem sterilen Schüttelkolben. Am folgenden Morgen verdünnen Sie die Zellen im Verhältnis von 1 zu 10 in vorgewärmtes, chemisch definiertes Medium oder CDM ohne Antibiotika. Kultivieren Sie die bee subtilsten Zellen bis zur mittleren exponentiellen Phase, was ungefähr vier Stunden dauert. Messen Sie die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern und verdünnen Sie die Zellen auf eine ungefähre A600 von 0,035.Unter Verwendung von CDM. Dieser OD-Wert stellt sicher, dass Einzelzellen mit geeignetem Abstand zwischen den Zellen auf dem Objektträger für die Zeitraffermikroskopie aufgebracht werden. Eine Stunde bevor die Zellen das mittlere exponentielle Wachstum erreichen.Bereiten Sie den Mikroskopobjektträger vor, indem Sie zwei Glasobjektträger mit 70 % Ethanol und Wasser reinigen. Entfernen Sie eine der Kunststoffabdeckungen von einem Genrahmen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Kunststoffabdeckung auf der anderen Seite des Rahmens nicht auseinandergebaut wird. Befestigen Sie den Genrahmen in der Mitte eines der Glasobjektträger, indem Sie ihn zuerst an einer Seite ankleben und dann den Rest mit dem Fingernagel ausrichten.Verwenden Sie eine Mikrowelle, um 150 Milligramm hochauflösendes, niedrigschmelzendes Agarose in 10 Milliliter CDM aufzulösen. Stellen Sie sicher, dass die Agarose vollständig gelöst ist, um Hintergrundfluoreszenz zu vermeiden. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des warmen Agarose-CDM-Gemischs in die Mitte des Genrahmens und achten Sie darauf, dass der gesamte Bereich einschließlich der Ränder vollständig bedeckt ist.Arbeiten Sie schnell, um ein übermäßiges Austrocknen der Agarose zu verhindern. Legen Sie den zweiten Objektträger auf den mit Aros-CDM gefüllten Genrahmen, wobei Luftblasen vermieden werden sollen. Stellen Sie das Präparat in waagerechter Position 45 Minuten bei vier Grad Celsius, damit die Agarose ausreichend verfestigen kann. Nachdem sich der Agar sorgfältig verfestigt hat, schieben Sie das obere Glas vorsichtig ab. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge Agarstreifen von etwa fünf Millimetern Breite aus, auf denen die Bakterien wachsen werden. Pro Objektträger können maximal drei Streifen verwendet werden, die jeweils durch etwa vier Millimeter breite Zwischenräume voneinander getrennt sind.Diese Zwischenräume sorgen für Luft, die für das Wachstum von Blu unerlässlich ist. Entfernen Sie vorsichtig die zweite und letzte Kunststoffabdeckung vom Genrahmen, um die klebrige Seite freizulegen. Geben Sie einzelne Zellen in etwa 2,5 µL Flüssigkeit auf das feste Medium, beginnend am oberen Rand des Agros-Pads, ohne dieses zu berühren.Den Medium mit der Pipettenspitze gleichmäßig verteilen, indem man die Objektträgerplatte nach oben und unten kippt. Einen sauberen Mikroskop-Deckel auf den Genrahmen legen, um den Deckglaser vollständig anzubringen. Mit dem Fingernagel Druck ausüben, nachdem die Zellen beladen wurden.Es ist entscheidend, lange genug zu warten, bis die Flüssigkeit vollständig getrocknet ist, damit keine schwimmenden Zellen und kein mehrschichtiges Wachstum auftreten. Wenn die Zellen hingegen zu lange getrocknet werden, haben sie Schwierigkeiten, eine mikrokoloniale Monoschicht auszubilden. Die zum Trocknen der Objektträger erforderliche Zeit hängt daher vom jeweiligen Experiment ab und kann nicht exakt bestimmt werden.Und folglich muss man natürlich ein Gefühl dafür entwickeln. Um Fokussierungsprobleme während der ersten Stunden des Zeitrafferversuchs zu vermeiden, wärmen Sie den Objektträger eine Stunde lang auf 30 Grad Celsius vor, um die Zeitraffermikroskopie vorzubereiten. Heizen Sie die Umgebungskammer mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn vor. Wählen Sie vor Beginn des Experiments das geeignete Objektiv, die entsprechenden Filter und den Dichroischen Spiegel gemäß Ihrem experimentellen Aufbau aus.Bei langen Experimenten sicherstellen, dass ein UV-Filter zwischen Lichtquelle und Probe angebracht ist. Außerdem, falls möglich, einen Teil des Anregungslichts mithilfe von Neutraldichtefiltern abschirmen, um die Belichtung zu minimieren. Das Experiment gemäß dem spezifischen Versuchsaufbau programmieren.Es ist ratsam, die für spezifische Konstrukte erforderliche Lichtmenge sowie die Einstellungen für die Autofokusfunktion bei anderen Zeitraffermikroskopen oder Bakterien vor dem eigentlichen Experiment zu bestimmen. Kürzere Belichtungszeiten und geringere Anregungslichtintensitäten minimieren das Ausbleichen und phototoxische Effekte. Verwenden Sie Scoplicht für die Autofokusfunktion. Schließlich platzieren Sie die vorbereitete Probe in der vorgewärmten Umgebungskammer des Mikroskops und beobachten das Wachstum einzelner Zellen zu einer mikrokolonialen Monoschicht bei 30 °C.Ein erfolgreicher Zeitrafferversuch mit Fluoreszenz liefert eine Mikrokolonie-Monoschicht, die vollständig innerhalb des Sichtfeldes liegt. Am Ende des Experiments in diesem Film ist das Hellfeld links zu sehen, während die Fluoreszenz rechts sichtbar ist.Hier ist ein Beispiel einer B Subtles-Mikrokolonie, bei der einige Zellen übereinander gewachsen sind, was es schwierig macht, ihre Entwicklung genau nachzuvollziehen und ihre Fluoreszenzintensitäten korrekt zu messen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mikroskopische Probe erfolgreich für die Zeitraffermikroskopie vorbereitet und wie man eine zeitliche Fluoreszenzmikroskopie durchführt. Experimentieren Sie mit BACE-Zellen.

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Forschung

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