Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebende Zellen während ihres Wachstums und ihrer Teilung mittels Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, um den Einfluss der Zellgeschichte und Abstammung auf die zelluläre Entwicklung von Bakterien untersuchen zu können. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst von einem flüssigen Medium mit relativ hohen Nährstoffkonzentrationen in ein flüssiges Nährstoff-Verarmungsmedium überführt werden. Anschließend wird ein mikroskopischer Objektträger vorbereitet, auf dem die Bakterienzellen zu einer Mikrokolonie heranwachsen.

Es wird eine Einschichtzelle vorbereitet. Anschließend wird eine zeitraffende Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahme erstellt. Abschließend wird die Aufnahme verarbeitet und die Daten werden analysiert.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Entwicklung einer einzelnen Bakterienzelle mittels zeitraffender Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie und der Standardmikroskopie besteht darin, dass sie die Beobachtung der Proteindynamik, des zellulären Verhaltens und der Entwicklung einzelner Zellen über die Zeit ermöglicht. Die Demonstration des Verfahrens wird von Cone, einem Doktoranden aus meinem Labor, durchgeführt. Um b tuus vorzubereiten, impfieren Sie Zellen von minus 80 Grad Celsius stammenden Stämmen in 10 Milliliter zeitraffender Mikroskopie-Medium oder TLM-Medium in sterilen Schüttelkolben, die gegebenenfalls mit Antibiotika ergänzt sind. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 30 Grad Celsius und 225 U/min in einem sterilen Schüttelkolben. Am folgenden Morgen verdünnen Sie die Zellen im Verhältnis von 1 zu 10 in vorgewärmtes, chemisch definiertes Medium oder CDM ohne Antibiotika. Kultivieren Sie die bee subtilsten Zellen bis zur mittleren exponentiellen Phase, was ungefähr vier Stunden dauert. Messen Sie die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern und verdünnen Sie die Zellen auf eine ungefähre A600 von 0,035.

Unter Verwendung von CDM. Dieser OD-Wert stellt sicher, dass Einzelzellen mit geeignetem Abstand zwischen den Zellen auf dem Objektträger für die Zeitraffermikroskopie aufgebracht werden. Eine Stunde bevor die Zellen das mittlere exponentielle Wachstum erreichen.

Bereiten Sie den Mikroskopobjektträger vor, indem Sie zwei Glasobjektträger mit 70 % Ethanol und Wasser reinigen. Entfernen Sie eine der Kunststoffabdeckungen von einem Genrahmen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Kunststoffabdeckung auf der anderen Seite des Rahmens nicht auseinandergebaut wird. Befestigen Sie den Genrahmen in der Mitte eines der Glasobjektträger, indem Sie ihn zuerst an einer Seite ankleben und dann den Rest mit dem Fingernagel ausrichten.

Verwenden Sie eine Mikrowelle, um 150 Milligramm hochauflösendes, niedrigschmelzendes Agarose in 10 Milliliter CDM aufzulösen. Stellen Sie sicher, dass die Agarose vollständig gelöst ist, um Hintergrundfluoreszenz zu vermeiden. Pipettieren Sie 500 Mikroliter des warmen Agarose-CDM-Gemischs in die Mitte des Genrahmens und achten Sie darauf, dass der gesamte Bereich einschließlich der Ränder vollständig bedeckt ist.

Arbeiten Sie schnell, um ein übermäßiges Austrocknen der Agarose zu verhindern. Legen Sie den zweiten Objektträger auf den mit Aros-CDM gefüllten Genrahmen, wobei Luftblasen vermieden werden sollen. Stellen Sie das Präparat in waagerechter Position 45 Minuten bei vier Grad Celsius, damit die Agarose ausreichend verfestigen kann.

Nachdem sich der Agar sorgfältig verfestigt hat, schieben Sie das obere Glas vorsichtig ab. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge Agarstreifen von etwa fünf Millimetern Breite aus, auf denen die Bakterien wachsen werden. Pro Objektträger können maximal drei Streifen verwendet werden, die jeweils durch etwa vier Millimeter breite Zwischenräume voneinander getrennt sind.

Diese Zwischenräume sorgen für Luft, die für das Wachstum von Blu unerlässlich ist. Entfernen Sie vorsichtig die zweite und letzte Kunststoffabdeckung vom Genrahmen, um die klebrige Seite freizulegen. Geben Sie einzelne Zellen in etwa 2,5 µL Flüssigkeit auf das feste Medium, beginnend am oberen Rand des Agros-Pads, ohne dieses zu berühren.

Den Medium mit der Pipettenspitze gleichmäßig verteilen, indem man die Objektträgerplatte nach oben und unten kippt. Einen sauberen Mikroskop-Deckel auf den Genrahmen legen, um den Deckglaser vollständig anzubringen. Mit dem Fingernagel Druck ausüben, nachdem die Zellen beladen wurden.

Es ist entscheidend, lange genug zu warten, bis die Flüssigkeit vollständig getrocknet ist, damit keine schwimmenden Zellen und kein mehrschichtiges Wachstum auftreten. Wenn die Zellen hingegen zu lange getrocknet werden, haben sie Schwierigkeiten, eine mikrokoloniale Monoschicht auszubilden. Die zum Trocknen der Objektträger erforderliche Zeit hängt daher vom jeweiligen Experiment ab und kann nicht exakt bestimmt werden.

Und folglich muss man natürlich ein Gefühl dafür entwickeln. Um Fokussierungsprobleme während der ersten Stunden des Zeitrafferversuchs zu vermeiden, wärmen Sie den Objektträger eine Stunde lang auf 30 Grad Celsius vor, um die Zeitraffermikroskopie vorzubereiten. Heizen Sie die Umgebungskammer mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn vor. Wählen Sie vor Beginn des Experiments das geeignete Objektiv, die entsprechenden Filter und den Dichroischen Spiegel gemäß Ihrem experimentellen Aufbau aus.

Bei langen Experimenten sicherstellen, dass ein UV-Filter zwischen Lichtquelle und Probe angebracht ist. Außerdem, falls möglich, einen Teil des Anregungslichts mithilfe von Neutraldichtefiltern abschirmen, um die Belichtung zu minimieren. Das Experiment gemäß dem spezifischen Versuchsaufbau programmieren.

Es ist ratsam, die für spezifische Konstrukte erforderliche Lichtmenge sowie die Einstellungen für die Autofokusfunktion bei anderen Zeitraffermikroskopen oder Bakterien vor dem eigentlichen Experiment zu bestimmen. Kürzere Belichtungszeiten und geringere Anregungslichtintensitäten minimieren das Ausbleichen und phototoxische Effekte. Verwenden Sie Scoplicht für die Autofokusfunktion. Schließlich platzieren Sie die vorbereitete Probe in der vorgewärmten Umgebungskammer des Mikroskops und beobachten das Wachstum einzelner Zellen zu einer mikrokolonialen Monoschicht bei 30 °C.

Ein erfolgreicher Zeitrafferversuch mit Fluoreszenz liefert eine Mikrokolonie-Monoschicht, die vollständig innerhalb des Sichtfeldes liegt. Am Ende des Experiments in diesem Film ist das Hellfeld links zu sehen, während die Fluoreszenz rechts sichtbar ist.

Hier ist ein Beispiel einer B Subtles-Mikrokolonie, bei der einige Zellen übereinander gewachsen sind, was es schwierig macht, ihre Entwicklung genau nachzuvollziehen und ihre Fluoreszenzintensitäten korrekt zu messen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mikroskopische Probe erfolgreich für die Zeitraffermikroskopie vorbereitet und wie man eine zeitliche Fluoreszenzmikroskopie durchführt. Experimentieren Sie mit BACE-Zellen.