Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kortikale Mikroglia aus neonatalen Mäusen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels Mikrodissektion kortikales Hirngewebe von neonatalen Mäusen gewonnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, gemischte Gliazellkulturen 17 bis 21 Tage lang in vitro zu kultivieren.

Anschließend werden die Mikroglia aus diesen gemischten glialen Kulturen isoliert. Der letzte Schritt besteht darin, Mikrogliazellen in Zellkulturschalen zu platzieren, um weitere Experimente durchzuführen. Letztendlich werden Immunfluoreszenzmikroskopie und ELISA verwendet, um zu zeigen, dass dieses Isolationsprotokoll das immunologische Phänotyp und die Funktionalität der Mikroglia erhält.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die bei der Mikromikrodissektion beteiligten Schritte schwer durchzuführen sind. Eine erfolgreiche Durchführung dieses Verfahrens erfordert sowohl Schnelligkeit als auch Genauigkeit. Zu langsame Arbeit verringert die Zellausbeute, während eine unvollständige Entfernung der Meningen die Gliazellkultur verunreinigt und das Wachstum der Gliazellen behindert.

Bereiten Sie zunächst das vollständige Mikroglia-Medium vor, das im Folgenden als MCM bezeichnet wird. Bereiten Sie einen Kolben pro Mauswelpen vor und inkubieren Sie diese mindestens eine Stunde lang. Dieser Äquilibrierungsschritt ist entscheidend für den Erfolg.

Danach Aliquote herstellen und auf Eis abkühlen. Alle benötigten Medien: sechs Milliliter MCM pro Wurf frisch auf Aliquote aufteilen und vor der Dissektion in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Die horizontale Luftströmwerkbank und das Dissektionsmikroskop mit 70 %igem Ethanol abwischen.

Stellen Sie anschließend die sterilisierten chirurgischen Instrumente, die für den Eingriff benötigt werden, in den Arbeitsbereich. Bereiten Sie eine sterile Schale mit Dissektionsmedium zur Aufnahme des Kopfes und eine weitere für die Dissektion vor. Geben Sie das Zerkleinerungsmedium in eine eigene Schale zur Zerkleinerung des Gehirngewebes.

Nach der Enthauptung und Entnahme des Gehirns bringen Sie das frisch isolierte Gehirn unter ein Stereomikroskop, um die Strukturen sichtbar zu machen, und achten Sie darauf, die dorsale Seite nach oben gerichtet und trocken zu halten. Sichern Sie das Gehirn, indem Sie die Spitzen der Pinzette in den Bereich des Übergangs zwischen Mittelhirn und Kortex einführen. Sobald es fixiert ist, entfernen Sie vollständig die dorsalen kortikalen Hirnhäute.

Entfernen Sie anschließend die ventralen Hirnhäute, um die Reinheit und Ausbeute von Mikrogliazellen zu maximieren. Es ist entscheidend, das gesamte Hirnhautgewebe vollständig zu entfernen. Lösen Sie die Cortexanteile vom restlichen Gehirn ab.

Entfernen Sie sorgfältig alle eventuell an der ventralen oder medialen Seite der Kortexstrukturen verbliebenen restlichen kortikalen Hirnhäute. Nach vollständiger Entfernung des Hirnhautgewebes legen Sie die Kortexstrukturen in die zuvor vorbereitete Zerkleinerungsschale. Zerkleinern Sie das Hirngewebe unter einer Sicherheitswerkbank der Klasse zwei mit einer Schere.

Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Spülen Sie sowohl die Schere als auch die Zerkleinerungsschale jeweils mit einem Milliliter Zerkleinerungsmedium aus, um die Ausbeute zu maximieren. Sammeln Sie diese Spüllösungen auf und geben Sie sie in das 15-Milliliter-Konischgefäß, das das zerkleinerte Gewebe enthält.

Lassen Sie die Gewebesuspension eine bis zwei Minuten lang ungestört, damit sich das zerkleinerte Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen kann. Entfernen Sie danach vorsichtig zwei Milliliter des Überstandes und verwerfen Sie diese, wobei darauf geachtet werden sollte, das abgesetzte, zerkleinerte Gewebe nicht aufzuwirbeln. Geben Sie drei Milliliter des zuvor erwärmten MCM zum zerkleinerten Gewebe hinzu und pipettieren Sie das Gewebe kräftig um.

Es sollte kein erkennbares festes Gewebe mehr vorhanden sein, wenn das Zerkleinern abgeschlossen ist. Geben Sie weitere drei Milliliter MCM unter Verwendung derselben Pipettenspitze hinzu, um die restlichen zerkleinerten Probenbestandteile von der Spitze aufzunehmen. Zentrifugieren Sie nach der Sammlung das zerkleinerte Gewebe, um die Zellen zu pelletieren.

Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, bringen Sie die pelletierten Zellen zurück in den biologischen Sicherheitswerkbank. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig das Überstand. Lösen Sie die Zellen vorsichtig wieder auf.

Suspendieren Sie das Zellpellet mit zwei Millilitern warmem MCM und geben Sie die Zellsuspension dann in den zuvor vorbereiteten Kolben. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang. Nach 24 Stunden klopfen Sie vorsichtig den Kolben gegen die Handfläche, um das Gewebefragment zu lösen.

Überprüfen Sie die Zellen vor und nach dem Abklopfen, um sicherzustellen, dass die Verunreinigungen vollständig entfernt sind. Ersetzen Sie anschließend das Medium durch frisches MCM und stellen Sie den Kolben zurück in den Inkubator. Überprüfen Sie die Zellen täglich, um das Wachstum und eine mögliche Kontamination zu überwachen.

Nach ungefähr 17 bis 21 Tagen sind die Mikrogliazellen zur Gewinnung bereit; um festzustellen, ob die Zellen soweit sind, untersuchen Sie sie unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop. Die Mikroglia sind zur Gewinnung bereit, wenn sie eine Konfluenz von etwa 40 % erreicht haben und als kleine, helle, kugelförmige Zellen wachsen, die als Monolayer auf anderen Zellen aufliegen.

Um Mikroglia zu isolieren, klopfen Sie das Kolbenfläschchen kräftig gegen die Laborbank. Diese Erschütterung hilft, die Mikroglia aufgrund ihrer geringen Adhärenz von anderen Gliazellen zu lösen. Versiegeln Sie die Kolbenverschlüsse mit Parafilm und schwenken Sie die gemischten Gliazellkulturen fünf Stunden lang in einem temperaturgesteuerten, nicht befeuchteten Rotationsschüttler.

Nach dieser Zeit visuell überprüfen, ob die Mikroglia sich von der Flächenoberfläche des Kolbens gelöst haben. Mit einem invertierten Phasenkontrastmikroskop erscheinen die Mikroglia als helle, kugelförmige, frei schwebende Zellen. Es wird eine Restschicht aus Astrozyten und Oligodendrozyten geben, die am Boden des Kolbens haften.

Sammeln Sie anschließend den Überstand, der die Mikroglia enthält, in einem sterilen kegelförmigen Zentrifagenröhrchen und resuspendieren Sie das Pellet. Suspendieren Sie das Mikroglia-Pellet in warmem Mikroglia-Wachstumsmedium und bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe einer hämocytometrischen Platte. Die Zellen werden 24 Stunden später in einem 24-Loch-Plattenformat auf Kunststoff oder sterilen Glasdeckgläsern ausgesät.

Ersetzen Sie das Medium durch frisches, warmes MGM, um schwimmende Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zellen und zur Aufrechterhaltung ruhender Mikroglia; die Mikrogliazellen sind unmittelbar nach diesem Nachfüllschritt bereit für Experimente zur Beurteilung der Mikroglia-Reinheit. Zellkulturen, die aus Mikroglia stammen und endogen GFP exprimieren, wurden für das Makrophagen-Antigen IBA1 gefärbt und mit DAPI kontragefärbt.

Um den Zellkern sichtbar zu machen, wiesen mehr als 95 % der Zellen eine Kolokalisation von GFP IBA nach einem und dpi auf. Nach Stimulation der Zellen mit LPS zeigten die Mikroglia eine deutliche morphologische Veränderung von einem kleinen bi-Phänotyp hin zu einer amöbenartigen Form. Immunzytochemische Färbung für P 65 ergab, dass P 65 unter normalen Bedingungen diffus im gesamten Zytoplasma lokalisiert ist.

Während nach einer zweistündigen Exposition gegenüber Pam P eine dramatische Verlagerung der Immunoreaktivität in den Zellkern beobachtet wurde, um zu bestätigen, dass die isolierten Mikrogliazellen ihre biochemische immunologische Funktionalität beibehalten hatten. Die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF alpha wurde nach Exposition gegenüber PAM oder LPS bestimmt. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kortikale Mikrogliazellen aus neugeborenen Mäusen isoliert, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Es ist wichtig, eine sterile Technik beizubehalten und das meningeale Gewebe gründlich aus dem präparierten kortikalen Bereich zu entfernen.