Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene
January 30th, 2014
Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kortikale Mikroglia aus murinen Neugeborenen zu isolieren. Dies wird durch erste Mikros erreicht, die kortikales Hirngewebe von Muren-Neugeborenen präparieren. Der zweite Schritt besteht darin, gemischte Gliazellkulturen für 17 bis 21 Tage in vitro zu züchten.
Anschließend werden die Mikroglia aus diesen gemischten Gliakulturen isoliert. Der letzte Schritt besteht darin, Mikrogliazellen für weitere Experimente in Zellkulturplatten zu plattieren. Letztendlich werden Immunfluoreszenzmikroskopie und Eliza verwendet, um zu zeigen, dass dieses Isolationsprotokoll den Immunphänotyp und die Funktionalität der Mikroglia bewahrt.
Dievisuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die SEP bei der Mikromikrodissektion schwierig durchzuführen sind. Die erfolgreiche Ausführung dieses Verfahrens erfordert sowohl Schnelligkeit als auch Genauigkeit. Das heißt, wenn Sie zu langsam sind, verringert sich die Zellausbeute, während eine unvollständige Entfernung der Hirnhäute die Gliakultur verunreinigt und das Gliawachstum behindert.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung des vollständigen Mikroglia-Mediums, das im Folgenden als MCM bezeichnet wird. Bereiten Sie einen Kolben pro Welpen vor und inkubieren Sie ihn mindestens eine Stunde lang. Dieser Gleichgewichtsschritt ist essentiell für den Erfolg.
Als nächstes Aliquot zubereiten und auf Eis kalt stellen. Alle benötigten Medien aliquotieren sechs Milliliter MCM für jeden Welpen und erwärmen sie vor der Sektion in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Wischen Sie den horizontalen Luftstromarbeitsplatz und das Seziermikroskop mit 70 % Ethanol ab.
Legen Sie anschließend die sterilisierten chirurgischen Instrumente, die für den Eingriff benötigt werden, in den Arbeitsbereich. Bereiten Sie eine sterile Schale mit Präpariermedium für die Aufnahme des Kopfes und eine weitere für die Präparierung vor. Geben Sie das Zerkleinerungsmedium in eine eigene Schale zum Zerkleinern des Hirngewebes.
Legen Sie das frisch isolierte Gehirn nach der Enthauptung und Hirnextraktion unter ein Präpariermikroskop, um die Höflichkeiten zu visualisieren, und achten Sie darauf, dass die Rückenseite nach oben und trocken bleibt. Sichern Sie das Gehirn, indem Sie die Spitzen der Pinzette in den Schnittpunkt von Mittelhirn und Kortex einführen. Sobald sie an Ort und Stelle sind, entfernen Sie die dorsalen kortikalen Hirnhäute vollständig.
Entfernen Sie anschließend die ventralen Hirnhäute, um die Reinheit und Ausbeute der Mikroglia zu maximieren. Es ist wichtig, das gesamte Hirnhautgewebe vollständig zu entfernen. Trennen Sie die Kortexe vom Rest des Gehirns.
Achten Sie darauf, alle verbleibenden kortikalen Hirnhäute zu entfernen, die auf der ventralen oder medialen Seite der Kortikale vorhanden sein können. Nachdem das Hirnhautgewebe entfernt wurde, legen Sie die Kortexe in die zuvor vorbereitete Hackschale. Wenn Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank der zweiten Klasse arbeiten, verwenden Sie eine Schere, um das Hirngewebe zu zerkleinern.
Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein 15 Millimeter konisches Röhrchen. Spülen Sie sowohl die Schere als auch die Hackfleischschale mit jeweils einem Milliliter Hackfleisch aus, um die Ausbeute zu maximieren. Sammeln Sie diese Spülungen und geben Sie sie in das konische 15-Milliliter-Röhrchen mit dem gehackten Gewebe.
Lassen Sie die Gewebesuspension ein bis zwei Minuten lang ungestört, so dass sich das zerkleinerte Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen kann. Nach dieser Zeit zwei Milliliter des Überstands vorsichtig entfernen und entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das abgesetzte zerkleinerte Gewebe nicht beschädigt wird. Geben Sie drei Milliliter des zuvor erwärmten MCM in das gehackte Gewebe und trichen Sie das Gewebe dann kräftig.
Nach Abschluss des Triers sollte kein festes Gewebe mehr erkennbar sein. Fügen Sie weitere drei Milliliter MCM mit derselben Pipettenspitze hinzu, um verbleibende verreibte Probe aus der Spitze zu sammeln. Nach dem Sammeln zentrifugieren Sie das zerkleinerte Gewebe, um die Zellen zu pelletieren.
Wenn sie fertig sind, stellen Sie die pelletierten Zellen wieder in die biologische Sicherheitswerkbank ein. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Sanfte Wiederbelebung.
Das Zellpellet wird mit zwei Millilitern warmem MCM suspendiert und dann die Zellreussuspensionssuspension in den zuvor vorbereiteten Kolben gegeben. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang. Klopfen Sie nach 24 Stunden vorsichtig mit dem Kolben gegen die Handfläche, um die Gewebeablagerungen aufzulösen.
Überprüfen Sie die Zellen vor und nach dem Klopfen, um sicherzustellen, dass die Ablagerungen vollständig entfernt werden. Ersetzen Sie anschließend das Medium durch frisches MCM und stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator. Überprüfen Sie die Zellen täglich, um das Wachstum und die Kontamination zu überwachen.
Nach etwa 17 bis 21 Tagen sind die Mikrogliazellen bereit für die Ernte, um festzustellen, ob die Zellen bereit sind, untersuchen Sie sie unter einem inversen Phasenkontrastmikroskop. Mikroglia sind bereit für die Ernte. Wenn sie eine Fluenz von etwa 40 % Co erreicht haben, erscheinen sie als kleine, helle kugelförmige Zellen, die als Monoschicht über anderen wachsen.
Zur Isolierung klopfen Mikroglia den Kolben kräftig gegen den Labortisch. Diese Bewegung hilft, Mikroglia von anderen Gliazellen zu trennen, da Mikroglia nur geringe Adhäsionseigenschaften aufweisen. Verschließen Sie die Kolbenkappen mit Paraform und drehen Sie die gemischten Gliakulturen mit einem temperaturgesteuerten, nicht befeuchteten Rotationsschüttler fünf Stunden lang.
Nach dieser Zeit ist visuell zu überprüfen, ob sich die Mikroglia von der Kolbenoberfläche abgehoben haben. Mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop sind Mikroglia helle, kugelförmige, frei schwebende Zellen. Am Boden des Kolbens haftet eine Restschicht aus Astrozyten und Oligodendrozyten.
Sammeln Sie anschließend den Überstand, der die Mikroglia enthält, in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen und einen Gaumen. Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Mikroglia-Pellet in warmem Mikroglia-Wachstumsmedium und bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einer Hämozytometerplatte. Die Zellen auf einem 24-Well-Plattenformat auf Kunststoff oder sterilem Glas decken 24 Stunden später ab.
Ersetzen Sie das Medium durch frisches, warmes MGM, um schwimmende Zellen und Schmutz zu entfernen. Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zellen und um die Ruhephase der Mikroglia zu erhalten, sind die Mikrogliazellen unmittelbar nach diesem Refeeding-Schritt bereit für Experimente, um die Reinheit der Mikroglia zu beurteilen. Zellkulturen, die aus endogen exprimierenden Mikroglia gewonnen wurden, die GFP exprimieren, wurden für das Makrophagen-Antigen IBA one gefärbt und mit DAPI gegengefärbt.
Um den Zellkern sichtbar zu machen, zeigten mehr als 95% der Zellen eine Kolokalisation von GFP, IBA eins und dpi. Nachdem die Mikroglia die Zellen mit LPS herausgefordert hatten, nahmen sie eine starke morphologische Veränderung von einem kleinen bi-Phänotyp zu einer amöbenartigen Form an. Immunphytochemische Färbungen für P 65 zeigen, dass P 65 unter normalen Bedingungen diffus im gesamten Zytoplasma lokalisiert ist.
Nach einer zweistündigen Exposition mit Pam P 65 verlagerte sich die Immunreaktivität dramatisch in den Zellkern, um zu bestätigen, dass isolierte Mikroglia ihre biochemische Immunfunktionalität beibehielten. Die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF alpha wurde nach Exposition gegenüber PAM oder LPS bestimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kortikale Mikroglia von spiegelnden Neugeborenen isolieren können, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
Es ist wichtig, die sterile Technik beizubehalten und das meningeale Gewebe aus der präparierten kortikalen Region gründlich zu entfernen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kortikaler Mikroglia aus murinen Neonaten und betont die Bedeutung der Erhaltung der mikroglialen Immunfunktion während des Prozesses. Die Isolationsmethode beinhaltet die mikrochirurgische Dissektion von Hirngewebe, die Kultivierung gemischter Gliazellen und die anschließende Isolierung von Mikroglia für Experimente.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Mikroglia spielt eine entscheidende Rolle im zentralen Nervensystem (ZNS).
- Isolationsmethoden können die Funktionalität von mikroglialen Zellen beeinflussen.
- Die Erhaltung der Immunfunktion ist für genaue experimentelle Ergebnisse unerlässlich.
- Proinflammatorische Stimuli werden verwendet, um die mikrogliale Aktivierung zu bewerten.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Mikroglia aus murinen Neonaten.
- Sicherstellung, dass isolierte Mikroglia ihren Immunphänotyp und ihre Funktionalität behalten.
- Erleichterung weiterer Experimente zur Mikroglia-Biologie.
Verwendete Methoden
- Mikrochirurgische Dissektion von kortikalem Hirngewebe aus murinen Neonaten.
- Kultur gemischter Gliazellen für 17 bis 21 Tage in vitro.
- Isolierung von Mikroglia aus gemischten Gliakulturen.
- Verwendung von Immunfluoreszenzmikroskopie und ELISA zur Bewertung der mikroglialen Funktionalität.
Hauptergebnisse
- Das Isolationsprotokoll liefert hochreine mikrogliale Kulturen.
- Mikroglia behält post-Isolierung immunofunktionelle Eigenschaften bei.
- Aktivierung mit LPS und Pam 3 CSK 4 zeigt erhaltene Funktionalität.
- Fluoreszente Bildgebung und Immunzytochemie bestätigen die Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Isolationsmethode ist effektiv für die Gewinnung funktioneller Mikroglia.
- Die Erhaltung der Immunfunktion ist entscheidend für die Untersuchung der Mikroglia-Biologie.
- Dieses Protokoll kann auf verschiedene experimentelle Setups mit Mikroglia angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
