Name: Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung kleiner Liganden in Kryo-EM-Karten makromolekularer Komplexe. Diese computergestützte Methode ermöglicht strukturelle Einblicke für die Arzneimittelforschung.

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SJ ist Empfänger des PhD-Stipendiums von DAE-TIFR, und die Finanzierung wird anerkannt. KRV bedankt sich für den DBT B-Life-Zuschuss DBT/PR12422/MED/31/287/2014 und die Unterstützung des Ministeriums für Atomenergie der indischen Regierung unter der Projektidentifikationsnummer RTI4006.

Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Verbesserungen in der Mikroskop-Hard- und -Software haben in den letzten Jahren zu einer Zunahme der Anzahl von KryoEM-Strukturen geführt. Obwohl die derzeit höchste Auflösung, die in der Einzelpartikel-KryoEM erreicht wird, bei 1,2 Å 57,58,59 liegt, wird der Großteil der Strukturen mit einer Auflösung von etwa 3-4 Å bestimmt. Die Modellierung von Liganden in Karten mit mittlerer bis niedriger Auflösung kann schwierig und oft mit Mehrdeutigkeiten behaftet sein. Angesichts der weit verbreiteten Verwendung von KryoEM sowohl in der akademischen Welt als auch in der Pharmaindustrie für die translationale Forschung und Wirkstoffforschung ist es wichtig, sicherzustellen, dass Liganden korrekt und ohne Mehrdeutigkeiten modelliert werden. Daher ist es ratsam, die Auflösungsfähigkeit von Ligandenatomen durch die Berechnung von Q-Scores60 zu quantifizieren, die nun in der EMDB als Metrik zur Bewertung der Qualität der Karten und der Anpassung des Modells sowie in Chimera verfügbar sind.
Im ersten Beispiel wurde ChimeraX verwendet, um die Differenzkarte im realen Raum zwischen dem Apo und den ligandengebundenen Karten im Enolase-Enzym M. tuberculosis zu berechnen. Die zusätzliche Dichte bei einem hohen Schwellenwert deutet auf das Vorhandensein des Liganden Phosphoenolpyruvat im aktiven Zentrum und Mg2+ hin, das an den Liganden gebunden ist. Es ist wichtig zu beachten, dass die Karte in diesem Fall eine mittlere Auflösung (3,2 Å) hat und Wassermoleküle nicht sicher modelliert werden können (Abbildung 1). Die Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass sie nur angewendet werden kann, wenn die Ligandenbindung keine signifikanten Konformationsänderungen im Protein induziert. In diesem Fall wurde keine Map-Normalisierung durchgeführt, da sowohl die APO- als auch die ligandengebundenen Datensätze mit der gleichen Pixelgröße erfasst und mit identischen Parametern in Relion verarbeitet wurden. Es ist jedoch erwähnenswert, dass beim Vergleich von Karten, die mit verschiedenen Rekonstruktionsprogrammen wie Relion46,47 und CryoSparc61 oder mit unterschiedlicher Qualität erstellt wurden, eine Normalisierung der Karten unerlässlich ist, bevor aussagekräftige Vergleiche durchgeführt werden können.
Das nächste Beispiel ist mGlu5, das bei der Agonistenbindung eine große molekulare Reorganisation erfährt, wie aus den KryoEM-Strukturen51,62 hervorgeht (Abbildung 2). In diesem Szenario ist es nicht möglich, eine einfache Differenzkarte zwischen den ungebundenen (APO) und ligandengebundenen Rezeptoren zu berechnen, da es erhebliche Unterschiede zwischen den Karten gibt. Hier wurde Servalcat verwendet, das ungeschärfte und ungewichtete Halbabbildungen als Input für die Verfeinerung im reziproken Raum verwendet und anschließend eine Differenzkarte zwischen der experimentellen Karte und der aus dem Modell abgeleiteten Karte berechnet. Bei einer hohen Schwelle kann man Unterschiede visualisieren und als Leitfaden für die Korrektur und Verbesserung des Modells dienen. Mehrere nicht modellierte Blobs in der extrazellulären und nahe der Transmembrandomäne von mGlu5 wurden beobachtet und als Leitfaden für die Modellierung von Liganden verwendet (Abbildung 2).
Das dritte Beispiel zeigt, wie die Auflösung (2,3 Å) eine entscheidende Rolle bei der Karteninterpretation und Modellierung eines fragmentgroßen Inhibitors in β-Galactosidase spielt. Hier bestand die Herausforderung darin, einen sehr kleinen Liganden (<200 Da) in der Servalcat-Differenzkarte inmitten des inhärenten Rauschens in den Daten zu identifizieren und genau zu modellieren. Neben der hohen globalen Auflösung, die mit der Fourier-Schalen-Korrelation (FSC) bestimmt wurde, war auch die für den Liganden spezifische lokale Auflösung ausreichend hoch, um eine genaue Platzierung der chiralen Zentren der Liganden zu gewährleisten (Abbildung 3). Die Dichte für Lösungsmittelmoleküle wurde in der Differenzkarte im gesamten Enzym und insbesondere in der Umgebung des Liganden beobachtet. Der Effekt der Auflösung auf die Modellierung von Liganden und Lösungsmittelatomen wurde ebenfalls demonstriert (Abbildung 4). Bei der Modellierung von Wasser- oder Lösungsmittelmolekülen ist Vorsicht geboten, da das Rauschen bei einem niedrigen Schwellenwert gelegentlich Wasser- oder Lösungsmittelmolekülen ähneln kann, was zu möglichen Fehlinterpretationen führen kann.
Eine weitere wichtige Überlegung ist, dass die KryoEM-Karten allein möglicherweise nicht ausreichen, um ein Metallion allein genau zu identifizieren. Zusätzliche biophysikalische Methoden wie die erweiterte Röntgenabsorptionsfeinstruktur (EXAFS) oder die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) sind oft erforderlich, um das Vorhandensein und die Identität des Metallions zu bestätigen. Sowohl in Enolase- als auch in β-Galactosidase-Enzymen wurde Mg2+ modelliert, da über diese Proteine bereits eine Fülle von Informationen verfügbar war, die die Identität des Metallions bestätigen. Auch die Koordination der Metallionen in diesen Fällen, beispielhaft für die klassische oktaedrische Geometrie und die nahezu idealen Koordinationsabstände von Mg2+, lieferte einen wesentlichen Beweis für ihre Identität.
Generell sollten bei der Modellierung von Liganden in KryoEM-Karten einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Zunächst ist es wichtig, die richtige Karte für die Ligandenidentifikation und -modellierung auszuwählen. In allen Fällen ist eine unscharfe und ungewichtete Karte oder Halbkarte gegenüber einer geschärften und gewichteten Karte ratsam, um die Ligandendichte zu visualisieren, da das Schärfen und Gewichten zu unter- oder überschärften Bereichen in der Karte führen könnte. Dies kann zu einer suboptimalen Ligandendichte führen, und die Verwendung verschiedener B-Faktor-Schärfungen kann verwendet werden, um die Dichte während der Modellerstellung in Coot zu bewerten. Obwohl die Verwendung der geschärften Karte zur Identifizierung von Liganden in einer KryoEM-Karte ein Risiko darstellt, zeigt die unscharfe Karte möglicherweise nicht die vollständigen Details der Ligandendichte, kann aber zu Demonstrationszwecken verwendet werden, wie in Abbildung 1B, C gezeigt.
Die Pose des modellierten Liganden sollte validiert werden, insbesondere in Fällen, in denen die Daten schwach sind. Wie hier für mGlu5 gezeigt, variiert die lokale Auflösung über die KryoEM-Karte, und eine unverzerrte Modellierung des Liganden kann eine Herausforderung darstellen. Servalcat kann als wertvolles Werkzeug zur Erkennung potenzieller Ungenauigkeiten bei der Protein- und Ligandenmodellierung eingesetzt werden22.
Die Heterogenität der Zusammensetzung kann in einem Protein-Liganden-Komplex vorhanden sein, in dem der Ligand nur in einer bestimmten Population vorhanden sein kann (wenn der Ligand ein niedriges Molekulargewicht hat, kann der Klassifizierungsschritt die Heterogenität möglicherweise nicht beseitigen). Dennoch ist es wichtig, den Schritt der 3D-Klassifizierung63 während der Bildverarbeitung vor der Ligandenmodellierung iterativ durchzuführen und zu überprüfen, ob sich die Dichte des Liganden verbessert. Wenn mehrere Kopien des Proteins vorhanden sind, ist bei der Anwendung der Symmetrie über die Karte während der anfänglichen Modellgenerierung und -verfeinerung Vorsicht geboten, da dies die Ligandendichte in allen symmetriebezogenen Molekülen ausgleichen kann. Die Symmetrie sollte erst dann auferlegt werden, wenn die Karte gründlich untersucht wurde, um das Vorhandensein der Ligandendichte in allen Proteinketten zu bestätigen.
Abhängig vom Zustand (Kristall oder Lösung) und dem Ort (vergraben oder Oberfläche) können die Atome dynamisch sein, und in der Modellverfeinerung wird dies als atomarer Verschiebungsparameter (ADP) bezeichnet. Zusammen mit der Differenzkarte, die visuelle Hinweise auf mögliche Ungenauigkeiten im Modell liefert, können ADP-Werte verwendet werden, um die Genauigkeit der Liganden nach der Verfeinerung 64,65,66,67 zu bewerten. Typischerweise sollte der Ligand ähnliche ADP-Werte wie die umgebenden Reste haben, d.h. wenn sie stabil gebunden und genau modelliert sind. Liganden an der Peripherie oder Atome eines Liganden (wie Lipide), die weit von Makromolekülen entfernt sind, können jedoch höhere ADP-Werte aufweisen. Neben der Verfeinerung der Koordinaten ermöglichen sowohl Refmac33,34 als auch Phenix die Verfeinerung der ADP-Werte28,68. In Refmac wird die Mott-Bethe-Näherung verwendet, um den Elektronenstreufaktor einzelner Atome während der Kartenberechnung zu berechnen. In der neueren Version von Phenix wurde die individuelle B-Faktor-Verfeinerung, ähnlich der Kristallographie, eingeführt, um die Atomunordnung zu berücksichtigen. Sehr oft wird in den verfeinerten Modellen, die von der KryoEM abgeleitet wurden, ein großer Bereich von ADP-Werten beobachtet (manchmal Werte nahe Null), und sogar der Q-Score, der in EMDB zur Bewertung der Anpassung des Modells an die Karte verwendet wird, hängt von der hinterlegten primären Karte und der Art der B-Faktor-Schärfung60 ab. Bei der Erstellung von KryoEM-Modellen werden häufig mehrere Karten verwendet, und daher sollten die in der Modellierung und Verfeinerung verwendeten Karten in den Methoden deutlich erwähnt werden, da aufgrund der anisotropen Auflösung in vielen Makromolekülen eine einzige Karte möglicherweise nicht ausreicht, um alle Details zu erklären. 
Bei der Modellierung von Liganden in Makromolekülen besteht eine der Haupteinschränkungen von KryoEM-Karten (wie in der Kristallographie) darin, dass es sich als schwierig erweisen kann, die korrekte Konformation zu bestimmen, wenn die Ligandenbindungsstelle eine niedrige Auflösung hat oder wenn der gebundene Ligand dynamisch ist. Darüber hinaus haben die meisten KryoEM-Strukturen Auflösungen unter 3 Å, und die Darstellung von Wassermolekülen in den Karten ist begrenzt, was es schwierig macht, die Rolle der Hydratation bei der Liganden- oder Wirkstoffbindung zu beurteilen (wie hier an den Beispielen von Enolase und mGluR gezeigt). Computergestützte Methoden können in Kombination mit KryoEM-Daten verwendet werden, um diese Einschränkungen zu überwinden69. Im Gegensatz zur Kristallographie erfährt nur das Modell eine Verfeinerung, nicht die Karte. Derzeit ist die einzige Methode, um das Vorhandensein eines Liganden anzuzeigen oder eine genaue Modellierung zu gewährleisten, die Erstellung von Auslassungskarten (unter Verwendung von Tools wie Servalcat). Es gibt also eine Reihe von Werkzeugen, die den Forschern helfen, das Modell zu erstellen und zu bewerten, aber es gibt mehrere Bereiche in der Modellverfeinerung, in denen neuere Ansätze oder Modifikationen aktueller Ansätze in naher Zukunft zu erwarten sind.
In diesem Artikel haben wir uns auf die aktuellen Ansätze zur Modellierung von Liganden konzentriert, zu denen die manuelle Inspektion der Ligandendichte, die Erstellung der Ligandengeometriedatei und die anschließende Modellierung des Liganden in der KryoEM-Karte gehören. Dies ist eine aufregende Zeit in der Strukturbiologie und Wirkstoffforschung, da direkte Elektronendetektoren mit schnelleren Bildraten und die Verwendung einer schnelleren Datenerfassung70 dazu geführt haben, dass hochauflösende Karten (<2,8 Å) mehrerer Makromoleküle, die oft an kleine Molekülliganden gebunden sind, in relativ kurzer Zeit erhalten werden konnten. Die kürzliche Einführung automatisierter Ligandenmodellierungswerkzeuge wie GEMspot69 in der Schrödinger-Suite und EMERALD17 in der Rosetta-Suite, die versucht, die wahrscheinlichste gebundene Pose des Liganden unter Berücksichtigung der experimentellen KryoEM-Daten zu finden, verspricht, diesen Prozess zu rationalisieren und zu automatisieren. Ähnlich wie bei der Röntgenkristallographie ist davon auszugehen, dass die Identifizierung der Bindungsmodi von kleinmolekularen Liganden durch KryoEM, vielleicht zwei oder mehr an einem einzigen Tag, zu einer realistischen Möglichkeit wird.

Zellen erfüllen ihre Funktionen, indem sie unzählige chemische Reaktionen gleichzeitig und unabhängig voneinander durchführen, die jeweils akribisch reguliert werden, um ihr Überleben und ihre Anpassungsfähigkeit als Reaktion auf Umwelteinflüsse zu gewährleisten. Dies wird durch die molekulare Erkennung erreicht, die es Biomolekülen, insbesondere Proteinen, ermöglicht, mit anderen Makromolekülen sowie kleinen Molekülen oder Liganden transiente oder stabile Komplexe zu bilden1. Daher sind Protein-Liganden-Wechselwirkungen grundlegend für alle Prozesse in der Biologie, einschließlich der Regulation der Proteinexpression und -aktivität, der Erkennung von Substraten und Cofaktoren durch Enzyme sowie der Art und Weise, wie Zellen Signale wahrnehmen und weiterleiten 1,2. Ein besseres Verständnis der kinetischen, thermodynamischen und strukturellen Eigenschaften des Protein-Liganden-Komplexes enthüllt die molekularen Grundlagen der Ligandeninteraktion und erleichtert auch ein rationales Wirkstoffdesign, indem die Wirkstoffinteraktion und Spezifität optimiert werden. Ein wirtschaftlicher und schnellerer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Liganden-Wechselwirkung ist die Verwendung von molekularem Docking, einer computergestützten Methode, die virtuell eine Vielzahl kleiner Moleküle durchleuchtet und den Bindungsmodus und die Affinität dieser Liganden zu Zielproteinen vorhersagt3. Experimentelle Beweise aus hochauflösenden Strukturen, die durch Röntgenbeugung (XRD), Kernspinresonanz (NMR) oder Elektronenkryomikroskopie (KryoEM) bestimmt wurden, liefern jedoch den wesentlichen Beweis für solche Vorhersagen und helfen bei der Entwicklung neuerer und wirksamerer Aktivatoren oder Inhibitoren für ein bestimmtes Ziel. In diesem Artikel wird die Abkürzung "KryoEM" verwendet, da die Technik allgemein genannt wird. Es gibt jedoch eine anhaltende Debatte über die Wahl der richtigen Nomenklatur, und kürzlich wurde der Begriff Kryo-Gen-Probe Electron Microscopy (KryoEM) vorgeschlagen, um anzuzeigen, dass die Probe bei kryogener Temperatur ist und mit Elektronen abgebildetwird 4. In ähnlicher Weise wurden die von der KryoEM abgeleiteten Karten als Elektronenpotential, elektrostatisches Potential oder Coulomb-Potential bezeichnet, und der Einfachheit halber verwenden wir hier die KryoEM-Karten 5,6,7,8,9,10.
Obwohl die XRD die Goldstandardtechnik bei der hochauflösenden Strukturbestimmung von Protein-Liganden-Komplexen war, hat die KryoEM nach der Auflösungsrevolution11 an Dynamik gewonnen, wie der Anstieg der Coulomb-Potentialkarten oder KryoEM-Karten zeigt, die in den letzten Jahren in der Electron Microscopy Database (EMDB)12,13 hinterlegt wurden14. Aufgrund von Fortschritten in der Probenvorbereitung, der Bildgebung und den Datenverarbeitungsmethoden stieg die Anzahl der Proteindatenbanken (PDB)14 mit KryoEM zwischen 2010 und 2020 von 0,7 % auf 17 %, wobei etwa 50 % der im Jahr 2020 gemeldeten Strukturen mit einer Auflösung von 3,5 Å oder besser bestimmt wurden15,16. Die KryoEM wurde von der Strukturbiologie, einschließlich der pharmazeutischen Industrie, schnell übernommen, da sie die Untersuchung flexibler und nichtkristalliner biologischer Makromoleküle, insbesondere von Membranproteinen und Multiproteinkomplexen, mit nahezu atomarer Auflösung ermöglicht, den Prozess der Kristallisation überwindet und gut beugende Kristalle erhält, die für die hochauflösende Strukturbestimmung durch XRD erforderlich sind.
Eine genaue Modellierung des Liganden in der KryoEM-Karte ist von größter Bedeutung, da er als Bauplan des Protein-Liganden-Komplexes auf molekularer Ebene dient. Es gibt mehrere automatisierte Ligandenbildungswerkzeuge, die in der Röntgenkristallographie verwendet werden und von der Form und Topologie der Ligandendichte abhängen, um den Liganden in die Elektronendichte 17,18,19,20 einzupassen oder aufzubauen. Wenn die Auflösung jedoch kleiner als 3 Å ist, führen diese Ansätze tendenziell zu weniger wünschenswerten Ergebnissen, da die topologischen Merkmale, von denen sie für die Erkennung und Erstellung abhängen, weniger definiert sind. In vielen Fällen haben sich diese Methoden als unwirksam erwiesen, wenn es darum geht, Liganden genau in KryoEM-Karten zu modellieren, da diese Karten im niedrigen bis mittleren Auflösungsbereich bestimmt wurden, typischerweise zwischen 3,5 Å und 5 Å17.
Der erste Schritt bei der 3D-Strukturbestimmung eines Protein-Liganden-Komplexes durch KryoEM besteht entweder darin, den Liganden mit dem Protein zu co-reinigen (wenn der Ligand eine hohe Bindungsaffinität zum Protein aufweist) oder die Inkubation der Proteinlösung mit dem Liganden für eine bestimmte Zeit vor der Gittervorbereitung. Anschließend wird ein kleines Probenvolumen auf ein plasmagereinigtes, löchriges TEM-Gitter aufgebracht, gefolgt von einem Schockfrosten in flüssigem Ethan und schließlich einer Bildgebung mit einem Kryo-TEM. Die 2D-Projektionsbilder von Hunderttausenden bis Millionen einzelner Teilchen werden gemittelt, um eine 3-dimensionale (3D) Coulomb-Potentialkarte des Makromoleküls zu rekonstruieren. Die Identifizierung und Modellierung von Liganden und Lösungsmittelmolekülen in diesen Karten stellt in vielen Fällen eine große Herausforderung dar, da die anisotrope Auflösung über die gesamte Karte (d. h. die Auflösung ist im gesamten Makromolekül nicht einheitlich), die Flexibilität in der Region, in der der Ligand gebunden ist, und das Rauschen in den Daten zu beachten ist. Viele der Modellierungs-, Verfeinerungs- und Visualisierungswerkzeuge, die für die XRD entwickelt wurden, werden nun für den Einsatz in der KryoEM für die gleichen Zwecke angepasst 18,19,20,21. In diesem Artikel wird ein Überblick über verschiedene Methoden und Software gegeben, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zum Aufbau von Modellen und zur Verfeinerung der aus der KryoEM abgeleiteten Koordinaten verwendet werden. Es wurde ein Schritt-für-Schritt-Protokoll erstellt, um die Prozesse bei der Modellierung von Liganden unter Verwendung spezifischer Protein-Liganden-Komplexe mit unterschiedlicher Auflösung und Komplexität zu veranschaulichen.
Der erste Schritt bei der Modellierung von Liganden in KryoEM-Karten umfasst die Identifizierung der Ligandendichte (Nicht-Protein) in der Karte. Wenn die Ligandenbindung keine Konformationsänderung im Protein induziert, dann hebt die Berechnung einer einfachen Differenzkarte zwischen dem Protein-Liganden-Komplex und dem Apo-Protein im Wesentlichen die Regionen mit zusätzlicher Dichte hervor, was auf das Vorhandensein des Liganden hindeutet. Solche Unterschiede können sofort beobachtet werden, da nur zwei Karten benötigt werden, und sogar Zwischenkarten während des Prozesses der 3D-Verfeinerung können verwendet werden, um zu überprüfen, ob der Ligand vorhanden ist. Wenn die Auflösung hoch genug ist (<3,0 Å), kann die Differenzkarte auch Einblicke in die Position von Wassermolekülen sowie von Ionen geben, die mit dem Liganden und den Proteinresten interagieren.
In Ermangelung der Apo-Protein-Karte ist es nun möglich, Servalcat22 zu verwenden, das als eigenständiges Tool verfügbar ist und im Rahmen der Refmac-Verfeinerung auch in die CCP-EM-Software-Suite 23,24 und in CCP4 8.0 Release25,26 integriert wurde. Servalcat ermöglicht die Berechnung einer FSC-gewichteten Differenzkarte (Fo-Fc) unter Verwendung der ungeschärften Halbkarten und des Apoproteinmodells als Eingabe. Die Fo-Fc-Auslassungskarte stellt die Diskrepanz zwischen der experimentellen Karte (Fo) und der vom Modell abgeleiteten Karte (Fc) dar. In Ermangelung eines Liganden im Modell deutet eine positive Dichte in einer Fo-Fc-Karte, die sich mit der experimentellen EM-Karte überschneidet, typischerweise auf das Vorhandensein des Liganden hin. Hier wird davon ausgegangen, dass die Proteinkette gut in die Karte eingepasst ist, und die verbleibende positive Dichte gibt an, wo sich der Ligand befindet. Es ist jedoch wichtig, akribisch zu untersuchen, ob die positive Dichte auf Modellierungsungenauigkeiten zurückzuführen ist, wie z. B. das falsche Rotamer einer Proteinseitenkette.
Der zweite Schritt besteht darin, aus den verfügbaren chemischen Informationen eine kartesische Koordinatendatei des Liganden mit wohldefinierter Geometrie zu erhalten oder zu erstellen. Standardliganden (z. B. ATP und NADP+), die bereits in der CCP4-Monomerbibliothek verfügbar sind, können zur Verfeinerung verwendet werden, indem die Koordinaten- und Geometriedateien über ihren Monomer-Zugangscode abgerufen werden. Für unbekannte oder nicht standardmäßige Liganden stehen jedoch verschiedene Werkzeuge zur Verfügung, um die Geometriedateien zu erstellen. Einige der Beispiele sind der eLBOW27 - (Electronic Ligand Builder and Optimization Workbench) in Phenix28, Lidia - ein eingebautes Tool in Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32 - ein Modul von Glide innerhalb der Schrödinger-Suite. Die Ligandenkoordinatendatei wird dann in die Dichte eingepasst, wobei sowohl die experimentelle KryoEM-Karte als auch die Differenzkarte in Coot verwendet werden. Darauf folgt die Realraumverfeinerung in Phenix28 bzw. die reziproke Verfeinerung in Refmac33. Voraussetzung ist eine Linux-Workstation oder ein Laptop, der mit einer guten Grafikkarte und der oben genannten Software ausgestattet ist. Die meisten dieser Programme sind in verschiedenen Suiten enthalten. CCP-EM24 und Phenix28 sind für akademische Benutzer frei verfügbar und enthalten eine Vielzahl von Tools, die in diesem Artikel verwendet werden, darunter Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine usw. In ähnlicher Weise bieten Chimera37 und ChimeraX38 kostenlose Lizenzen für akademische Benutzer.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Konsortium mehrerer Institute</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>kostenlos für akademische Nutzer und enthält Coot und eine Liste von Werkzeugen, die für die Röntgenkristallographie entwickelt</td></tr> wurden <tr><td>CCP-EM</td><td>Konsortium mehrerer Institute</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>Kostenlos für akademische Nutzer und umfasst Coot, Relion und viele andere</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Allgemeine Software für die Modellbildung, aber auch mit anderen oben beschriebenen Suiten verfügbar</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Konsortium mehrerer Institute</td> https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html <td>Software innerhalb der Phenix-Suite zum Andocken von Modellen in KryoEM-Karten</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie-Datenbank&nbsp;</td><td>Konsortium mehrerer Institute</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Öffentliches Repositorium für Elektronenmikroskopie kartiert</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercial, Kamera von Thermo Fisher&nbsp;</td></tr><tr><td>Phenix&nbsp;</td><td>Konsortium mehrerer Institute</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>kostenlos für akademische Nutzer und umfasst Coot</td></tr><tr><td>Protein</td><td>Data Bank Konsortium mehrerer Institute</td><td>https://rcsb.org</td><td>Öffentliche Datenbank makromolekularer Strukturen</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrödinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Molekulares Visualisierungstool. Die Bildungsversion ist kostenlos, aber mit Einschränkungen verbunden. Die Vollversion kann gegen eine geringe Gebühr bezogen werden.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>Software für die KryoEM-Bildverarbeitung, auch verfügbar mit CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Kommerzielles KryoTEM von Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, USA</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Allzwecksoftware für Anzeige, Analyse und mehr</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, USA</td><td></td> <td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Allzweck-Software für Anzeige, Analyse und mehr</td></tr></tbody></table>

modellierung von liganden in karten aus der elektronenkryomikroskopie

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Die Entschlüsselung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen in einem makromolekularen Komplex ist entscheidend für das Verständnis des molekularen Mechanismus, der zugrunde liegenden biologischen Prozesse und der Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren hat sich die kryogene Probenelektronenmikroskopie (KryoEM) zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, um die Strukturen von Makromolekülen zu bestimmen und die Art der Ligandenbindung mit nahezu atomarer Auflösung zu untersuchen. Die Identifizierung und Modellierung von Nicht-Protein-Molekülen in KryoEM-Karten ist aufgrund der anisotropen Auflösung über das interessierende Molekül und des inhärenten Rauschens in den Daten oft eine Herausforderung. In diesem Artikel werden die Leser mit verschiedenen Softwares und Methoden vertraut gemacht, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zur Modellerstellung und zur Verfeinerung atomarer Koordinaten unter Verwendung ausgewählter Makromoleküle verwendet werden. Eine der einfachsten Möglichkeiten, das Vorhandensein eines Liganden zu identifizieren, wie am Enzym Enolase dargestellt, besteht darin, die beiden Karten zu subtrahieren, die mit und ohne Liganden erhalten wurden. Die zusätzliche Dichte des Liganden wird wahrscheinlich auch bei einem höheren Schwellenwert in der Differenzkarte hervorstechen. Es gibt Fälle, wie im Fall des metabotrope Glutamatrezeptors mGlu5 gezeigt, in denen solche einfachen Differenzkarten nicht erstellt werden können. Die kürzlich vorgestellte Methode zur Ableitung der Fo-Fc-Omit-Map kann als Werkzeug zur Validierung und Demonstration des Vorhandenseins des Liganden dienen. Schließlich wird am Beispiel der gut untersuchten β-Galactosidase der Effekt der Auflösung auf die Modellierung der Liganden und Lösungsmittelmoleküle in KryoEM-Karten analysiert und ein Ausblick darauf gegeben, wie KryoEM in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Dieses Protokoll stellt die Werkzeuge vor, die für die Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen zur Verfügung stehen.

Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Wir sind daran interessiert, die physiologischen Prozesse zu verstehen, die in der gesamten Zelle ablaufen, insbesondere an der Membrangrenzfläche. Wir verwenden Kryo-EM als Haupttechnik und arbeiten an verschiedenen interessanten und herausfordernden biologischen Problemen, indem wir mehrere makromolekulare Komplexe untersuchen. Die Bestimmung der Strukturen von Membranproteinen und anderen labilen Komplexen war vor einigen Jahrzehnten eine Herausforderung.Technische Fortschritte in der Kryo-EM, einem neuartigen Detergens- und Lipidmimetikum, ebneten jedoch den Weg für eine schnelle Strukturbestimmung dieser Komplexe. Diese Strukturen können nun mit hoher Auflösung erhalten und möglicherweise in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden. Zu den Herausforderungen bei der Einzelpartikel-Kryo-EM gehören die Aufnahme stabiler und homogener Proben, die Einbettung der Probe in zufälliger Ausrichtung in dünnes Eis, die Verarbeitung einer großen Anzahl von Bildern mit geringem Signal-Rausch-Verhältnis und die genaue Bestimmung der Winkelausrichtung und Klassifizierung während der 3D-Rekonstruktion.Die Identifizierung und Modellierung kleiner Moleküle in Kryo-EM-Karten von Ligandenproteinkomplexen ist aufgrund des inhärenten Rauschens in den Daten und der isotropen und geringen Kartenauflösung, der Probenheterogenität und der Ligandenflexibilität eine Herausforderung. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Identifizierung und Modellierung von Liganden und Lösungsmittelmolekülen in Kryo-EM mit niedriger bis mittlerer Auflösung.

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