Name: Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Darstellung und Analyse vaskulärer Netzwerke in geklärten menschlichen Plazentazotten. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in plazentare Gefäßstrukturen für die Erforschung von Wachstumsrestriktionen und Frühgeburten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von der New York State Office für Menschen mit geistiger Behinderung und plazentaren Analytics LLC, New Rochelle, New York unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities Humanforschung Ethikkommission.
(1) Zotten Baum Dissektion
<ol><li>Spülen Sie Formalin fixiert Plazenta-Gewebe mit Phosphat poliert Kochsalzlösung (PBS)14 zu entfernen das Formalin und platzieren in einer Petrischale auf der Bühne eines Mikroskops Dissektion. Verwenden Sie Skalpell und feine Pinzette um das Plazenta-Gewebe auseinander zu necken, um Zotten Bäume (weiße fadenförmigen verzweigte Strukturen) zu finden. Sezieren Sie Stücke aus Villus Baum (mehrere mm lang) und übertragen Sie das Gewebe auf ein Micro-Schlauch mit ~ 1 mL PBS.</li>
</ol>2. immunofluorescent Färbung
<ol><li>Entfernen Sie mit einer Pipette die PBS zu und ersetzen Sie durch frische PBS. Mit gelegentlichen wirbelnden 10 min. ruhen lassen. Wiederholen Sie noch einmal. Hinweis: Dieser Schritt und alle weiteren Schritte sind bei Raumtemperatur außer der primären Antikörper Inkubationszeit durchgeführt.</li>
	<li>Mit einer Pipette, entfernen und ersetzen der PBS mit PBS + 0,1 % Triton-X100 + 2 % Ziegenserum (PBS-T-GS), um die Gewebe und Block unspezifische Bindung der Sekundärantikörper permeabilize. 30 min inkubieren.</li>
	<li>Ersetzen Sie die PBS-T-GS mit PBS, enthält 2 % Ziegenserum, beide Maus monoklonalen Anti-CK7 und Kaninchen Anti-CK7.<ol>
<li>Gewebe über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Entfernen Sie die restlichen Antikörper durch Waschen mit PBS-GS für 10 Minuten mit gelegentlichen wirbeln.</li>
		<li>Die PBS-GS zu entfernen und ersetzen Sie durch PBS-GS mit beiden Ziege Anti-Maus IgG gepaart mit einer grünen emittierende (520 nm) Fluorophor und Ziege Anti-Kaninchen IgG gekoppelt, ein Infrarot-Emission (652 nm) Fluorophor.</li>
		<li>Entfernen Sie die Antikörper durch Wiederholung von Schritt 2.1.</li>
		<li>Speichern Sie das Immunolabeled Gewebe bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Klärung des Gewebes
<ol><li>Waschen Sie die Proben mit PBS 3 Mal im 10 Minuten-Takt.</li>
	<li>Das Gewebe zu entwässern, durch Entfernen der PBS mit einer Pipette und ersetzt es mit 50 % Ethanol (Methanol kann auch verwendet werden). Inkubation für 10 min. zu ersetzen, mit frischen 50 % Ethanol und inkubieren Sie für 10 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal für eine Gesamtmenge von 3 Inkubationen. Wiederholen Sie die Inkubationen mit 70 %. Dann ersetzen Sie mit 100 % Ethanol und 15 Minuten lang inkubieren (Alternativ Methanol verwendet werden).</li>
	<li>Mit einer feinen Spitze Pinzette übertragen Gewebe auf eine frische Micro-Schlauch mit ~ 1 mL Lösung 1 für 4 h.</li>
	<li>Mit feinen Spitzen Pinzette übertragen Gewebe zu einem frischen Mikro-Rohr enthaltenden Lösung-2 für ~ 4 h. Hinweis: Bei Lagerung im Dunkeln ist die Immunfluoreszenz stabil bei Raumtemperatur für mindestens 6 Monate.</li>
	<li>Verwechseln Sie nicht mit einer wässrigen Lösung (z.B. Eindeckmittel), wie die Lichtung gehen verloren.</li>
</ol>4. Montage für die Mikroskopie
<ol><li>Montieren Sie das Gewebe zwischen einer standard-Glas-Folie und einem Deckgläschen nicht, wie das Gewebe weich und leicht verformt.</li>
	<li>Siehe Abbildung 5B und das Gewebe in einer Sykes-Moore-Kammer wie folgt montieren;<ol>
<li>Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein 25 mm Runde Deckglas in der Kammer Basis.</li>
		<li>Legen Sie mit einer feinen Spitze Pinzette die Gummidichtung in der Basis auf dem Deckglas.</li>
		<li>Geben Sie mit einer Pipette einen Tropfen (~ 40 µL) Lösung-2 in der Mitte das Deckglas.</li>
		<li>Mit den feinen Spitzen Pinzette eine Stück Gewebe übertragen von Lösung 2 bis zum Tropfen in der Mitte das Deckglas.</li>
		<li>Legen Sie eine zweite Deckglas auf der Oberseite der Dichtung.</li>
		<li>Fädeln Sie den Sicherungsring in der Oberseite des Sockels komprimieren Deckgläsern und Dichtung bis Sie fest. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu überdrehen oder das Deckglas zerbricht.</li>
		<li>22-Gauge Nadel an einem Anschluss auf der Basis und durch die Dichtung.</li>
		<li>Füllen Sie eine 3-mL-Spritze mit ~ 1,5 mL der Lösung 2.</li>
		<li>Montieren Sie eine 25-Gauge-Nadel auf die Spritze.</li>
		<li>Legen Sie die Spritzennadel in den gegenüberliegenden Hafen und durch die Dichtung.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Luft in der Kammer durch die anderen 25-Gauge-Nadel Entlüftung ist, sanft Lösung-2und Füllung der Kammer zu injizieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Nadel und Spritze und der Kammers auf ein großes Glas-Folie auf der Bühne confocal Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ schneiden Sie benutzerdefinierte Brunnen aus Silikon PDMS.<ol>
<li>Mit einer Schere schneiden ein 25,4 × 25,4 mm2 Stück aus dem PDMS-Blatt.</li>
		<li>Mit einem Skalpell schneiden ~ 12,7 × 12,7 mm2 auch im Stück.</li>
		<li>Drücken Sie das Stück fest auf einen Objektträger.</li>
		<li>Füllen Sie den Brunnen an die Spitze mit Lösung 2.</li>
		<li>Übertragen Sie das Stück Gewebe aus der Mikro-Tube in die Mitte des Brunnens.</li>
		<li>Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein Deckglas oben auf dem Brunnen, so dass der untere Teil des Deckglases benetzt mit Lösung 2 ist.</li>
		<li>Montieren Sie die Sykes Moore Kammerversammlung mit dem Gewebe auf der Bühne confocal Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. der konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Bringen Sie das Gewebe in der Kammer in den Fokus mit einem 10 X-Objektiv.</li>
	<li>Bewegen Sie den Mikroskoptisch rauf und runter durch die Brennebene zum Messen des Abstands zwischen der Ober- und Unterseite des Gewebes.</li>
	<li>Verschieben Sie die Phase in 2,5 µm Schritten eine konfokale Image-Datei enthält eine Reihe von Bildern durch das Gewebe von oben nach unten zu sammeln.</li>
</ol>(6) Umkehrung der Lichtung
<ol><li>Umkehren der Lichtung des Gewebes auf eine Mikro-Rohr mit > 20 x das Volumen von 100 % Ethanol zu übertragen. 1 h ersetzen Intervalle mit 70 % Ethanol, danach 50 % Ethanol und PBS. Bei 4 ° C im Dunkeln lagern. Hinweis: Jetzt verarbeiten Sie das Gewebe für die Einbettung von standard Paraffin strukturierendes und histologischen oder Immuno-histochemische Färbung.</li>
</ol>(7) Dekonvolution
Hinweis: Für die folgenden Schritte sind Software-Befehlen, Tabs und Drop-Down-Menüs kursiv gesetzt.
<ol><li>Starten Sie die Software Dekonvolution und öffnen Sie der Image-Datei zu.</li>
	<li>Geben Sie im Fenster"Summary" aufgeführten Parameter.<ol>
<li>Für "Abstände geben Sie die Voxel x-, y- und Z-Dimensionen in µm.</li>
		<li>Wählen Sie für jeden Farbkanal der fluoreszierenden Farbstoffs für die Immunostaining aus dem Dropdown-Menü verwendet.</li>
		<li>Für die "Modalität", wählen Sie aus der Drop-Down-Menü konfokale Laser Scanning.</li>
		<li>Für die "Objektiv, 10 X aus der Drop-Down-Menü auswählen.</li>
		<li>Für die "Immersion Medium', Luft aus der Drop-Down-Menü auswählen.</li>
		<li>Klicken Sie auf die "anwenden" Taste.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf die Registerkarte"Deconvolution" ".</li>
	<li>Klicken Sie auf '3D Dekonvolution " in der Drop-Down-Menü.</li>
	<li>In der "3D - Dekonvolution" Fenster zu versichern, dass die Einstellungen sind: (1) Adaptive PSF Blind, 2) theoretische PSF, (3) Nutzung (Standard-Adaptive PSF, 10 Iterationen, mittlere Lärm), (4) Basis-Namen.</li>
	<li>Klicken Sie auf die "grüne Häkchen" zum Starten des Programms.</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, wiederholen Sie die Schritte 7,3-7.6 das Programm neu starten. Wenn Sie fertig zum dritten und letzten Mal neu starten.</li>
	<li>In der "Data Manager" Fenster, klicken Sie auf die Datei, die mit dem Präfix "10-10 - 10-".</li>
	<li>Klicken Sie auf die "Datei" Registerkarte, und klicken Sie auf "Speichern unter.</li>
	<li>Wählen Sie im Fenster'Save As' '8-Bit-Ganzzahl ohne Vorzeichen " aus der"Datentyp " Drop-Down-Menü und klicken Sie auf speichern.</li>
</ol>8. die Bildverarbeitung
<ol><li>Starten Sie Fidschi-Software.<ol>
<li>Klicken Sie auf "Datei", klicken Sie auf "offen" und wählen Sie die Deconvolved-Image-Datei und klicken Sie auf die "offen" Taste der "Open" Fenster.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Bild/Farbe/Split Kanäle und konvertieren das dreifarbige Bild-Datei in drei neue Dateien, die nur eine Farbe enthält. Speichern Sie die roten Image-Datei, die die Immunolabeled Zotten Kapillare Bild enthält. Die grünen und blauen Image-Dateien zu löschen.</li>
		<li>Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz aus der roten Bild-Datei mit: "Prozess/subtrahieren Hintergrund '.</li>
		<li>In der Drop-Down-Menü legen Sie Rolling Ball Radius 10 Pixel.</li>
		<li>Lassen Sie die 4 Menüoptionen deaktiviert und klicken Sie auf "" OK "".</li>
		<li>Klicken Sie auf 'Ja im Menü Prozess-Stack.</li>
		<li>Entfernen fester Gewebe Fluoreszenz (Autofluoreszenz) durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Helligkeit-Kontrast" Menü und die Minimum-, Maximum-, Helligkeit und Kontrast-Einstellungen anpassen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Kapillare Immunfluoreszenz zu entfernen.</li>
		<li>Minimieren Sie verbleibende irrelevant Fluoreszenz durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Threshold" Menü und die Schiebereglern anpassen, so dass die Kapillare Immunfluoreszenz markiert ist. Überprüfen Sie die "dunklen Hintergrund" box und klicken Sie auf "anwenden '. Auf der "Konvertieren in binären Dropdown-Liste" Menü überprüfen die "schwarzen Hintergrund" box und klicken Sie auf "" OK "". Speichern Sie die schwarz / weiß (binär) Bild-Datei für Analysen unten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Analyse
<ol><li>Objekt zu zählen und Skelettierung.<ol>
<li>Wählen Sie die binäre Image-Datei in Schritt 8.1.8 erstellt.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Analyze/3D OC-Optionen und überprüfen Sie nur"Volume " und"Store führt... " Kästen in der Drop-Down-Menü. Versichern Sie, dass das Kontrollkästchen "Show-Nummern" deaktiviert ist. Klicken Sie auf die "" OK "" Schaltfläche ".
</li>
		<li>CLIck auf "analysieren/3D Objekte Counter'. Legen Sie im Dropdown-Menü "Filter Größe: Min." bis 5000. Versichern, dass die "Objekte an den Rändern ausschließen -Box nicht aktiviert ist. Überprüfen Sie, dass die "ObjektsStatistik und"Zusammenfassung " Felder aktiviert. Klicken Sie auf die "" OK "" Taste. Hinweis: Dies kann je nach Größe und Computer Dateikonfiguration einige Minuten dauern.</li>
		<li>Der Statistiktabelle und Objekte-Map-Datei zu speichern.</li>
		<li>Wählen Sie die Objekte-Map-Datei. Klicken Sie auf "Plugins/Skelett/Skeletonize 2D-3D" , skeletonize Kapillarnetzes in der Binärdatei. Klicken Sie auf "Datei/speichern als. Wählen Sie "Tiff..." in der Drop-Down-Menü. In der speichern als TIFF-Fenster hinzufügen "Skel-" Objekt Karte Dateinamen und klicken Sie auf die "Speichern" Taste.
</li>
		<li>Klicken Sie auf "analysieren/Skelett/analysieren Skelett 2D-3D". In der Drop-Down-Menü die Standardeinstellungen übernehmen, und klicken Sie auf die "" OK "" Taste. Speichern Sie die Verzweigung "Informationen" Tabelle, die " Ergebnistabelle und zwei Ausgabe-Dateien (Skel-Objekte-beschriftet - Skelette und Tagged Skelett).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+features+of+placental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).</li>
<li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Origins+of+Chronic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li>
<li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925(2014).</li>
<li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+possible+function+for+placental+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li>
<li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li>
<li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transcriptional+activity+in+the+syncytiotrophoblast+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta.</a> Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).</li>
<li>Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. <a target="_blank" href="https://www.ias-iss.org/ojs/IAS/article/view/820">3-D study of vessels in peripheral placental villi.</a> Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).</li>
<li>Pearce, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Modeling+of+Blood+Flow+and+Oxygen+Transfer+in+Feto-Placental+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0165369(2016).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li>
<li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth%3A+a+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(15)00837-5">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li>
<li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Institutional Review Board genehmigt die Auflistung der Plazenta Zotten Gewebe für Formalin Fixierung von wahlweise abgebrochene Schwangerschaften. Bevor die Verfahren durchgeführt wurden, ein kurzer Überblick über die Krankenakte mütterliches Alter, Parität, festgestellt und bestätigt das Fehlen einer zugrunde liegenden medizinischen (z.B.Bluthochdruck, Diabetes und Lupus) oder fetalen (strukturelle oder chromosomalen Anomalien, abnorme Wachstum) wurde durchgeführt. Das Datenblatt und alle gesammelten Exemplare...

Unser Verständnis von der entwickelnden Plazenta und seine Krankheiten ist in hohem Maße begrenzt, räumliche Beziehungen zwischen benachbarten Zotten und enthaltenen Kapillaren histologischen Abschnitten abgeleitet abgeleitet. In dieser Studie haben wir dieses Problem angesprochen, durch die Entwicklung der Mittel, um dreidimensionale (3D) Darstellungen der menschlichen Plazenta Kapillare Netzwerke zu generieren, die für Analysen der Kapillare Netzwerk-Features (z. B. Verzweigungen, Festigkeit) geeignet sind. Zu diesem Zweck haben wir zusammengefasst, immunofluorescent Färbung mit zwei kommerzielle Gewebe Clearing-Produkte, Visikol-1 und Visikol-2 (im folgenden genannt als Lösung 1 und Lösung 2).
Die menschliche Plazenta ist einen riesigen Komplex von Blutgefäßen befindet sich an der Schnittstelle zwischen intervillous Blut der Mutter und den sich entwickelnden Fötus. Heraus aus ihrer Einfügung in die Chorion Platte erstreckt, verzweigt sich die Nabelschnur in ein Netz von Arterien und Venen, die zur Deckung die Chorion Oberfläche mit einem aufwendigen vaskuläre Netzwerk ramify. Ihre Enden dann nach unten in den innen- oder Tiefe der plazentaren Scheibe wo sie mehrere Generationen mehr Verzweigungen zu unterziehen und am Ende in die Klemme Zotten und ihre enthaltenen Kapillare Netzwerke, die Website für den Austausch von Gasen, Nährstoffe, eindringen und Stoffwechselerkrankungen Abfall zwischen fetalen und mütterlichen Blut.
Beleidigungen, die Plazenta Kapillarnetzes während der Entwicklung haben langfristige Folgen für die Gesundheit des Fötus, Neugeborenen und die emergent Erwachsene 1,2,3. Im Hinblick auf Schwangerschaft zusammenhängenden Pathologien wie Fehlschlag, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und mütterlichen Diabetes 4,5,6 gibt es ist ein hoher Wert gelegt auf die Entwicklung von Methoden zur Messung und Charakterisierung der Plazenta Zotten Kapillare Netzwerke. Ein großes Hindernis ist, dass die plazentale vaskuläre Netzwerken umfassen ein breites Spektrum der Skala. Die Oberfläche vaskulärer Netzwerke können so groß wie 4-5 mm im Durchmesser sein. Die terminal Zotten Kapillaren sind in der Größenordnung von 10 -20 µm im Durchmesser; die Plazenta enthält über 300 km Blutgefäße 7. Derzeit gibt es einige einfach zu bedienende und schnelle Techniken, die diesen extremen Schiff Skala erfasst werden können. Durch Mikroskopie kann bisher nur eine kleine Anzahl von Villi gerendert werden. Zum Beispiel fokussiert Jirkovska Et Al. die Plazenta Villus bei Laufzeit, kombiniert konfokale Mikroskopie mit optischen Schnittserien in 1 µm Abständen von 120 µm dicke Abschnitte erhalten; keine Angaben über die Zahl der untersuchten Proben noch Statistiken wurden 8. Kapillare Strukturen wurden identifiziert und Konturen der Zotten und Kapillaren waren handgezeichnete, mit Umzeichnungen zur Bildanalyse exportiert. Während die Autoren diskutieren die Folgen ihrer Erkenntnisse für das "wachsende Zotten vaskuläre Netzwerk", sind solche Schlussfolgerungen problematisch, wenn nur "Begriff" (36 + Woche Gestationsalter) Gewebe untersucht wird. In ähnlicher Weise Mayo et einl. und Pearce Et Al. stützte sich auf das Gewebe im gleichen Alter, für ihre Simulationen von Blut und Sauerstoff-Transfer, aber ihre Analysen beschränkten sich auf nur wenige Begriff terminal Zotten 9,10 . Stereologie wurde auch auf die Studie der Struktur der Zotten Schiffe angewendet. Aber auch hier der Schwerpunkt wurde in der Regel auf spätere Schwangerschaften liefern Liveborn Säuglinge mit einem oder mehreren Schwangerschaft Komplikationen 11,12.
Bis vor kurzem beschränkte konfokalen Mikroskopie, Bildgebung, Gewebe Tiefen von 100-200 µm wegen Absorption der Anregung und Emission der Fluoreszenz durch das darüber liegende Gewebe 13 . Wenn Gewebe clearing und 3D Histologie häufig in der Literatur beschrieben wurden und es gibt gibt zahlreiche Methoden für Gewebe löschen viele ungeeignet für die Verwendung mit Gewebe in der Regel irreversibel beschädigt werden zelluläre Morphologie durch die hyperhydration von Proteinen oder Entfernung von Lipiden. Daher ist es nicht möglich zu überprüfen, ob diese Ergebnisse bezeichnend für das Gewebe selbst und keine Artefakte sind aus der Verarbeitung unserer Gewebe clearing-Prozess eine reversible Technik ist, die gegen traditionelle Histologie überprüfen kann. Gewebe-Clearing beinhaltet in der Regel einer der drei wichtigsten Ansätze: 1) einheitliche Abgleich des Brechungsindex (RI) der Gewebeanteile durch Untertauchen in RI passende Lösungen, die die kumulative Lichtstreuung verursacht durch kontinuierlichen lensing entfernt Schwankungen des niedrigen RI (Zytosol) und hohe RI (Protein/Lipide) Bestandteile; (2) entfernen Lipidkomponenten durch Einbettung in Hydrogel und Nutzung von Elektrophorese/Diffusion Lipidkomponenten entfernen; (3) Ausbau/Denaturierung von Protein-Struktur zum verstärkten Eindringen von Lösungsmitteln Förderung der Einheitlichkeit der RI 13. Während dieser Ansätze können Gewebe transparent zu machen und für 3D-Darstellungen von Biomarkern generiert werden, sind diese 3D-Darstellungen von zweifelhaftem klinischen Wert, da es schwierig ist, festzustellen, ob diese Bilder bezeichnend für Gewebeeigenschaften sind oder des Gewebes clearing-Prozess. Auf der anderen Seite, da unsere Gewebe löschen rückgängig gemacht werden kann Standard histologischen und/oder Immunohistochemistry einsetzbar des gleichen Gewebes zu beurteilen, ob die Veränderungen klinisch bedeutsam sind.
Diese Studie enthält eine Analyse der 47 distalen Zotten Proben aus insgesamt 23 klinisch normal und wahlweise abgebrochene Schwangerschaften zwischen 9-23 abgeschlossener Wochen Schwangerschaft und zwei voll ausgetragenen normale Lieferungen. Immunfluoreszenz Kennzeichnung der Trophoblast und Gefäßendothelien ermöglichte eine quantitative und automatisierte Analyse der Veränderungen in den Zotten vaskulären Netzwerken und ihrer Komplexität.
Mit diesem Protokoll wir isoliert und analysiert zuvor terminal Zotten und ihre Kapillare Netzwerke auf einer Skala nicht möglich. Dieser Ansatz, wenn Zotten und Kapillare Netzentwicklung über Schwangerschaft angewendet werden diese Eigenschaften identifizieren, die die Grundlage für die Geburt eines gesunden Kindes sind. Bei Anwendung auf Studien von komplizierten Schwangerschaften wird es auch klären, wann und wie die plazentalen Pathologien zu ändern, die Zotten Bäume und die Kapillare Netzwerke, die sie Scheide und wie diese fetalen Wohlbefinden beeinträchtigen.

<table><tbody><tr><td>10% Formaldehydlösung (w/v) in wässrigem Phosphatpuffer</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>Allgemeines Fixiermittel, gebrauchsfertige Formel, seien Sie vorsichtig, da Dämpfe giftig sind</td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B Nr. 11</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Feinzange</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen (1,7 mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>Einweg, 3ml Transferpipette</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Verdünnung auf 0,1% ab Lager</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>Verdünnen auf 2% in PBS-Lösung</td></tr><tr><td>Maus monoklonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Klon OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-CD31 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>grün emittierend (520 nm) Fluorochrom&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>infrarotemittierendes (652 nm) Fluorochrom</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Ethanolalkohol 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td> Bei <td>Bedarf mit PBS auf niedrigere Konzentrationen verdünnen</td></tr><tr><td>Lösung-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Lösung-2</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore-Kammern</td><td>BellCo Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>25-Gauge-Nadel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Benötigt</td></tr><tr><td>3 mL</td><td>Spritze ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD Einwegspritze</td></tr><tr><td>PDMS Silikonfolien</td><td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>Dekonvolutionssoftware</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>Fiji Bildbearbeitungssoftware</td><td></td><td></td><td>kostenlose, quelloffene Software erhältlich bei https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>Komponente 1 von SelecTech H& E Färbesystem</td></tr><tr><td>Alkoholisch Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>Komponente 2 von SelecTech H& E Färbesystem</td></tr><tr><td>Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>Komponente 3 von SelecTech H& E Färbesystem</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>Komponente 4 von SelecTech H& E-Färbesystem</td></tr><tr><td>Immunhistochemisches Detektionssystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Detektionssystem HRP DAB</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale darstellung und analyse der immunolabeled, geklärt menschlichen plazenta zotten vaskulärer netzwerke

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nährstoff- und Gas-Austausch zwischen Mutter und Fötus erfolgt an der Schnittstelle von der mütterlichen intervillous Blut und die riesigen Zotten engmaschiges Netz, aus denen sich ein Großteil der Parenchym der menschlichen Plazenta. Die distale Zotten Kapillarnetzes ist die Endstation der fetalen Blut-Versorgungsmaterial nach einigen Generationen der Verzweigung von Schiffen aus der Nabelschnur. Dieses Netzwerk hat einen zusammenhängenden zellulären Mantel, syncytial Trophoblast Sperrschicht, die verhindert, dass der fetalen Blut mischen und dem mütterlichen Blut in dem es ständig gebadet wird. Beleidigungen, die Integrität der plazentaren Kapillarnetzes auftretenden Störungen wie mütterlicher Diabetes, Bluthochdruck und Übergewicht, haben Konsequenzen dieser vorliegenden schwerwiegende gesundheitliche Risiken für den Fötus, Säugling und Erwachsenen. Um die strukturellen Auswirkungen diese Beleidigungen besser zu definieren, entwickelte ein Protokoll für diese Studie, die Kapillarnetzes Struktur in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3 erfasst, wobei man seine topologischen Eigenschaften in ihrer ganzen Komplexität untersuchen kann. Um dies zu erreichen, werden Cluster von terminal Zotten aus Plazenta seziert und der Trophoblast-Schicht und die Kapillaren Gefäßendothelien sind Immunolabeled. Diese Proben werden dann geklärt, mit einem neuen Tuch clearing-Prozess, der es ermöglicht, konfokale Bild Stapeln bis Z-Tiefe von ~ 1 mm erwerben. Die dreidimensionale Darstellungen von diesen Stapeln dann verarbeitet und analysiert, um grundlegende Kapillarnetzes Maßnahmen wie Volumen, Anzahl der Kapillare Niederlassungen und Kapillare Verzweigungspunkte zu Ende, als Bestätigung der Eignung dieses Ansatzes für generieren engmaschiges Netz Charakterisierung.

Die generierten 3D-Renderings der Kapillaren in Clustern von terminal Villi in menschlichen Plazenta von 8 Wochen gestational Alter Begriff Lieferung wurden als einzelne Cluster gezählt und skelettiert für Netzwerk-Analyse. Die Funktionseinheiten der Plazenta (Abb. 1A) sind die Villus Bäume, die eine Verlängerung der Überwasserschiffe sind, wo sie die Plazenta Parenchym (Abbildung 1Bund erweitert...

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Drei-D-Renderings von Plazenta-Zottenbaumfragmenten zu erstellen, die für die Analyse ihrer enthaltenen Gefäßnetzwerke geeignet sind. Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen in unserem Fachgebiet zu beantworten, z. B. warum ein Kind in seinem Wachstum eingeschränkt sein kann oder welcher Stress und wie stark der Stress gewesen sein könnte, der zu einer Frühgeburt geführt hat. Der Hauptvorteil unseres Verfahrens besteht darin, dass wir nun in der Lage sind, klares zwielichtiges Zottenbaumgewebe immunmarkieren und dann ihre Gefäßnetzwerke sichtbar zu machen und diese Visualisierungen zur Charakterisierung und Analyse dieser Gefäßnetzwerke zu verwenden.Die Auswirkungen dieser Technik können sich auf viele Diagnosen und Therapien erstrecken, da die meisten Lebenswissenschaften auf zweidimensionale histologische Charakterisierung angewiesen sind. Frau Valerie Schwenk wird das Verfahren vorführen, die die Immunmarkierung und die Reinigung des Plazentagewebes durchführen wird, und dann wird Herr Phillip Necaise die Dissektion des Plazentagewebes und auch die umgekehrte Reinigung des Gewebes durchführen. Um die Dissektion des Zottenba

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Twin-to-twin Transfusion-Syndrom und zwei Anämie Polyzythämie Sequenz sind zwei potenziell verheerende Probleme in Perinatalmedizin. Beide Erkrankungen treten nur in monochorialen Zwillingen und resultieren aus unsymmetrischen Durchblutung der Plazenta Gefäßanastomosen. Wir bieten ein einfaches Protokoll zur genauen Beurteilung der Anwesenheit von Gefäßanastomosen mit Farbstoff Injektion von Plazentagefäße nach der Geburt.

Präzise und einfache Auswertung der Gefäßanastomosen in Monochoriale Placenta mit Farbstoff

Dieses Video zeigt die Etablierung von primären humanen Plazenta-Zotten und Dezidualorgankulturen unter ex vivo-Bedingungen. Diese Modelle eignen sich gut für die Untersuchung der Pathogenese an der Schnittstelle zwischen Mensch und Mutter-Fötus.

Etablierung von Zotten- und Dezidualorgankulturen als ex vivo Modelle der menschlichen Maternal-Fetal-Schnittstelle

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung von Veränderungen im mütterlichen Gefäßsystem während der Schwangerschaft bei Mäusen. Mit stereologischen Methoden wird der Umbau der dezidualen Spiralarterien quantitativ beurteilt und die Ergebnisse immunhistochemisch qualitativ bestätigt.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Wir präsentieren eine detaillierte Methode, um die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu studieren. Die Methode kombiniert die Blutentnahme von den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta mit Ultraschallmessungen von Volumen Blutfluss und Plazenta Gewebe Probenahme.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie<em&gt; In vivo</em

Hier präsentieren wir eine Anpassung der passiven Klarheit und 3D-Rekonstruktion Methode zur Visualisierung der Eierstöcke Gefäßsystem und follikulären Kapillaren in intakten Maus Eierstöcke.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Hier ist ein Protokoll für die Kultivierung von Plazenta-Explantaten unter konstanten Flussbedingungen. Dieser Ansatz verbessert traditionelle statische Zottenkultursysteme, indem er die Replikation dynamischer physiologischer Umgebungen ermöglicht.

Ex Vivo Plazenta-Explantat-Flow-Kultur - Nachahmung der dynamischen Bedingungen in utero

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von menschlichen Plazentagewebe-Explantierungen, die an einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche kultiviert werden, um virale Infektionen zu untersuchen.

Ex vivo Kultur menschlicher Plazenta-Explants zur Untersuchung der viralen Übertragung über die mütterlich-fetale Grenzfläche

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Erfahren Sie die 3D-Darstellung und Analyse vaskulärer Netzwerke in geklärten menschlichen Plazentazotten. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in plazentare Gefäßstrukturen für die Erforschung von Wachstumsrestriktionen und Frühgeburten.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Weitere Videos entdecken