Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Drei-D-Renderings von Plazenta-Zottenbaumfragmenten zu erstellen, die für die Analyse ihrer enthaltenen Gefäßnetzwerke geeignet sind. Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen in unserem Fachgebiet zu beantworten, z. B. warum ein Kind in seinem Wachstum eingeschränkt sein kann oder welcher Stress und wie stark der Stress gewesen sein könnte, der zu einer Frühgeburt geführt hat. Der Hauptvorteil unseres Verfahrens besteht darin, dass wir nun in der Lage sind, klares zwielichtiges Zottenbaumgewebe immunmarkieren und dann ihre Gefäßnetzwerke sichtbar zu machen und diese Visualisierungen zur Charakterisierung und Analyse dieser Gefäßnetzwerke zu verwenden.

Die Auswirkungen dieser Technik können sich auf viele Diagnosen und Therapien erstrecken, da die meisten Lebenswissenschaften auf zweidimensionale histologische Charakterisierung angewiesen sind. Frau Valerie Schwenk wird das Verfahren vorführen, die die Immunmarkierung und die Reinigung des Plazentagewebes durchführen wird, und dann wird Herr Phillip Necaise die Dissektion des Plazentagewebes und auch die umgekehrte Reinigung des Gewebes durchführen. Um die Dissektion des Zottenbaums vorzubereiten, spülen Sie zuerst das formale und fixierte Plazentagewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus.

Dann in einer Petrischale auf den Tisch eines Seziermikroskops stellen. Um den Zottenbaum zu lokalisieren, verwenden Sie ein Skalpell und eine feine Pinzette, um das Plazentagewebe auseinander zu reißen. Präparieren Sie dann etwa fünf Millimeter lange Stücke des Zottenbaums und geben Sie sie in ein Mikroröhrchen, das einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält.

Ersetzen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch eine frische und warten Sie 10 Minuten mit gelegentlichem Schwenken. Ersetzen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch permeabilisierenden Puffer, um das Gewebe zu permeabilisieren und die unspezifische Bindung von Sekundärantikörpern zu blockieren. Dann 30 Minuten inkubieren.

Ersetzen Sie dann den permeabilisierenden Puffer durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die zwei Prozent Ziegenserum mit monoklonalem Maus-Anti-CD31 und Kaninchen-Anti-CK7 enthält. Lassen Sie das Taschentuch über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Am nächsten Tag entfernen Sie die restlichen Antikörper mit zusätzlichen Waschungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zwei Prozent Ziegenserum.

Entfernen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit zwei Prozent Ziegenserum und fügen Sie den gleichen Puffer hinzu, ergänzt mit Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin G in Verbindung mit einem grünen Fluorophor und Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobulin G in Verbindung mit einem Infrarotfluorophor. 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie das Taschentuch dann einmal mit PBS-GS und lagern Sie das markierte Taschentuch bis zur Reinigung im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Proben dreimal im Abstand von 10 Minuten mit PBS. Um das Gewebe zu dehydrieren, entfernen Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und fügen Sie dem Gewebe 50%iges Ethanol hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Nach der Inkubation verwerfen und anschließend dreimal mit 70 % Ethanol im Abstand von 10 Minuten waschen, gefolgt von drei Wäschen mit 100 % Ethanol im Abstand von 15 Minuten.

Übertragen Sie dann das Gewebe mit einer Pinzette mit feiner Spitze vier Stunden lang in ein Mikroröhrchen, das mit einem Milliliter Lösung gefüllt ist. Nach vier Stunden wird das Gewebe in ein mit Lösung zwei gefülltes Mikroröhrchen umgefüllt und weitere vier Stunden inkubiert. Um das Gewebe in einer Sykes-Moore-Kammer zu befestigen, positionieren Sie mit einer feinen Pinzette einen 25 Millimeter dicken runden Deckglas auf dem Kammerboden.

Auch hier setzen Sie mit der feinen Pinzette eine Gummidichtung in den Boden des Deckglases. Entfernen Sie das in Lösung zwei getauchte Tuch und legen Sie es auf die Mitte des Deckglases. Geben Sie dann einen Tropfen Lösung zwei, etwa 40 Mikroliter, auf das Gewebe.

Nehmen Sie dann einen zweiten Abdecklader und legen Sie ihn auf die Dichtung. Drücken Sie dann den Deckglas und die Dichtung fest zusammen, indem Sie einen Sicherungsring in die Oberseite des Sockels einfädeln. Führen Sie dann eine 25-Gauge-Nadel durch die Dichtung in den Anschluss an der Basis ein.

Füllen Sie als Nächstes eine Drei-Milliliter-Spritze mit einem Punkt fünf Millilitern Lösung zwei. Montieren Sie dann eine 25-Gauge-Nadel auf der Spritze und führen Sie die Nadel durch die Dichtung in den gegenüberliegenden Anschluss ein. Beginnen Sie dann mit der Injektion von Lösung zwei in die Kammer und überprüfen Sie, ob die Luft in der Kammer durch die andere 25-Gauge-Nadel entweicht.

Wenn die Kammer voll ist, entfernen Sie die Nadel und die Spritze und setzen Sie den Sykes-Moore-Kammerhalter auf den konfokalen Mikroskoptisch. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv, um das auf der Kammer platzierte Gewebe zu fokussieren. Legen Sie als Nächstes einen Referenzpunkt für den Tisch fest und bewegen Sie den Mikroskoptisch in der Fokusebene auf und ab, um die Ober- und Unterseite des Gewebes zu identifizieren und einzustellen.

Stellen Sie die Schrittweite auf zwei Komma fünf Mikrometer ein und erfassen Sie eine konfokale Bilddatei, die eine Reihe von Bildern des Gewebes von oben nach unten enthält. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein Mikroröhrchen, das mehr als das 20-fache Volumen von 100 % Ethanol enthält, um die Reinigung rückgängig zu machen. Ersetzen Sie dann nach jeder Stunde durch 70 und dann durch 50% Ethanol und schließlich phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

Bis zum Einbetten bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern. Um das plazentare Gefäßnetzwerk zu zeigen, wurden hier sowohl mikroskopische als auch konfokale mikroskopische Aufnahmen einer menschlichen Plazenta aufgenommen. Diese mikroskopischen Aufnahmen der Plazenta zeigen die strahlenförmigen Zottenbäume, die in das Plazentaparenchym eingedrungen sind.

Diese mikroskopischen Aufnahmen zeigen das Vorhandensein eines distalen Teils von Zottenbaumstücken, der in der Zottengruppe endet. Um die Trophoblastenschicht der Zotten zu zeigen, wurde der distale Teil des Zottenbaums immunmarkiert. Im Bild ist die äußere Trophoblastschicht in grün und die Kapillaren in rot dargestellt.

Zur Überprüfung des Plazentagewebes vor und nach der Klärung wurden dann konfokale Bilder von ungeklärtem und geklärtem Plazentagewebe aufgenommen. Die Bilder zeigen, dass bei einem ungeklärten Gewebe die Immunfluoreszenz in einer Tiefe von 100 Mikrometern oder weniger des Gewebes erfasst werden kann. Im Gegenteil, für geklärtes Plazentagewebe kann Immunfluoreszenz in einer viel höheren Tiefe erfasst werden.

Um das konventionelle Gewebe mit den umgekehrten klaren Schnitten zu vergleichen, wurde das gereinigte Gewebe in einem umgekehrten Verfahren mit Ethanol dehydriert. Die immunhistochemische Färbung des Plazentagewebes mit anti CK7 vor und nach dem Clearing zeigt keine signifikante Veränderung der Gewebemorphologie durch das Clearing. Die Animation zeigt, dass das immungefärbte Zottengewebe über die gesamte Tiefe des Gewebevolumens verteilt ist.

Sobald Sie sich mit dem Eingriff vertraut gemacht haben, können Sie damit rechnen, dass er etwa 18 Stunden dauert, aufgeteilt auf drei Tage. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es mehrere verschiedene Fähigkeiten erfordert. Man muss in der Lage sein, Plazentapathologie und konfokale Mikroskopie durchzuführen.

Sie müssen in der Lage sein, Drei-D-Renderings der Bildgebung zu erstellen, und Sie müssen in der Lage sein, sich mit der Immunverarbeitung und -analyse auszukennen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie traditionelle Histologie, STS-Seite oder Maldi durchgeführt werden. Mit ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg auf dem Gebiet der mütterlichen Fetalmedizin, der Neonatologie und der Trophoblastenbiologie, um die Ursachen zu erforschen, die Präeklampsie, schlechtem fetalem Wachstum und fetalem Stress zugrunde liegen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man plazentarzottenartiges Baumgewebe entfernt, rendert und analysiert. Vielen Dank, dass Sie sich das Video angesehen haben und viel Glück bei Ihren Experimenten.