Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe
8. Mai 2018
Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.
Das übergeordnete Ziel dieser psPACT- und mPACT-Methoden ist die schnelle Reinigung des gesamten ZNS-Gewebes, ohne dass ein elektrophoretisches Gewebereinigungssystem erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Modellfeld der Humankrankheitsforschung zu beantworten, wie z. B. die Alzheimer-Krankheit oder Verletzungen und Degeneration sowie die Tumorgenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das ZNS-Gewebe der Maus durch die elektrophoretische Gewebereinigung nicht geschädigt wird und durch die modifizierte passive Reinigung schnell entfernt wird.
Wir hatten die Idee zu dieser Methode, nachdem wir die ursprüngliche PACT- und frühere Methode zur Gehirnreinigung verwendet hatten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da psPACT und mPACT-Methoden schwierig durchzuführen sind, da diese Methode mehrere Phasen der Probenvorbereitung umfasst. Beginnen Sie mit der Zubereitung der PACT-Cocktaillösung, indem Sie VA-044-Pulver zu einer Lösung aus 4 % PFA und 4 % Acrylamid in einer Endkonzentration von 0,25 % hinzufügen. Nachdem Sie das Gewebe mit PACT-Lösung durchblutet haben, tauchen Sie das gesamte Gehirn und das Rückenmark vollständig in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit gekühlter PACT-Lösung und lagern Sie es 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie das Gewebe 24 Stunden später in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit frischer, kalter PACT-Lösung und verbinden Sie den Röhrchendeckel mit einem Gewebegel-Hybridisierungssystem, das mit einem Stickstofftank verbunden und auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Schalten Sie dann das Vakuum und das Gas für 10 Minuten ein, um die Probe in Stickstoffgas einzubetten. Um das Hydrogel zu polymerisieren, legen Sie das Röhrchen mit der Probe für drei Stunden oder bis zum Abschluss der Polymerisation in einen Schüttelinkubator mit 150 U/min und 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie nach der Inkubation Löschpapier, um das restliche polymerisierte Hydrogel zu entfernen, das das Gewebe umgibt. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit der Reinigungslösung. Legen Sie die Probe in einen Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde.
Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage, bis das ZNS der Maus die volle Klarheit erreicht hat. Beginnen Sie psPACT mit dem ZNS von einer Maus, die mit 4 % PFA durchblutet wurde und 24 Stunden lang in 4 % PFA bei vier Grad Celsius nachfixiert wurde. Waschen Sie das fixierte Gewebe eine Stunde lang in 0,1 molaren PBS.
Übertragen Sie das Gewebe nach dem Waschen in die A4P0-Lösung und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Tauchen Sie das Gewebe am nächsten Tag nach dem Waschen des Gewebes fünf Minuten lang in PBS in 0,25 % VA-044 in PBS und inkubieren Sie es sechs bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Durch die Trennung des Acrylamids und den anschließenden VA-044-Schritt wird vermieden, dass verbleibende nicht polymerisierte Hydrogel-Monomere, die das Gewebe umgeben, entfernt werden müssen, was die endgültige Gewebeintegrität beeinträchtigen kann, nachdem die Transparenz mit PACT erreicht wurde.
Nach der Inkubation das Gewebe in frische, kalte VA-044-Lösung überführen. Betten Sie die Probe dann 10 Minuten lang in Stickstoffgas ein. Übertragen Sie das Gewebe in die Reinigungslösung.
Inkubieren Sie die Probe dann in einem Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage, bis das ZNS der Maus vollständige Klarheit erreicht. Befolgen Sie für mPACT das Protokoll für psPACT bis zum Schritt der Clearinglösung.
Tauchen Sie dann die Gewebereinigungslösung, die 0,5 % Alpha-Thioglycerin, ein Entbräunungsmittel, zusätzlich zu 8 % SDS enthält, vollständig in 0,1 molare PBS ein. Legen Sie die Probe in einen Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde. Im Durchschnitt dauert es nur zwei Wochen, bis das ZNS der Maus mit mPACT die volle Klarheit erreicht.
In der vorliegenden Studie erreichten Maushirnproben, die mit dem mPACT-Protokoll behandelt wurden, nach 14 Tagen eine optische Transparenz, vor Proben, die mit den PACT- und psPACT-Protokollen behandelt wurden. Ganze ZNS-Proben der Ratte, die mit mPACT geklärt wurden, erreichten eine maximale Clearance innerhalb von 20 Tagen. Erwachsene Rattengehirne allein, im Gegensatz zum gesamten ZNS, wurden mit mPACT in nur fünf Tagen beseitigt.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen mit dem gesamten ZNS der Maus durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und Anatomie, pathophysiologische Erkrankungen wie Gewebeverletzungen, Entwicklungsfehlbildungen, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen in ZNS-Modellen von Säugetieren zu erforschen.
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Übersicht
Diese Studie stellt zwei innovative Methoden, psPACT und mPACT, vor, um die optische Transparenz zu verbessern und die mikroskopische Analyse der intakten vaskulären Strukturen des zentralen Nervensystems (ZNS) von Nagetieren zu erleichtern. Die Techniken zielen darauf ab, das gesamte ZNS-Gewebe schnell und schonend zu klären, um zentrale Fragen zu Modellen menschlicher Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit und der Tumorbildung zu beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gewebeklärungstechniken
- Mikroskopische Bildgebung
Hintergrund
- Die Studie baut auf früheren Methoden auf und hebt die Grenzen der elektrophoretischen Gewebeklärung hervor.
- Unterstreicht die Notwendigkeit schneller und wirksamer Klärverfahren für das zentrale Nervensystem von Nagetieren.
- Bietet Lösungen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für klinische Anwendungen in der Neurowissenschaft.
Zweck der Studie
- Entwicklung und Validierung von psPACT und mPACT als effiziente Protokolle zur Klärung von ZNS-Gewebe.
- Erweiterung der Möglichkeiten für Forschende, die neuropathologische Zustände untersuchen.
- Verbesserung der Visualisierung der Gewebevaskularisation im ZNS.
Verwendete Methoden
- Die Methoden umfassen ein mehrstufiges Protokoll zur Vorbereitung und Klärung von ZNS-Gewebe unter Verwendung von PACT-Lösungen.
- Zu den wichtigsten biologischen Modellen gehören ZNS-Proben von Maus und Ratte, wobei der Schwerpunkt auf der Erzielung optischer Transparenz liegt.
- psPACT benötigt im Allgemeinen etwa 20 Tage, um vollständige Klarheit zu erreichen, während mPACT dies in ungefähr 14 Tagen erreichen kann.
- Spezielle Lösungen und Inkubationsumgebungen werden für die Polymerisation und die Klärungsprozesse eingesetzt.
Hauptergebnisse
- mPACT bietet eine erhebliche Verringerung der Zeit für die Gewebeklärung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Proben, die mit mPACT behandelt wurden, zeigten in kürzerer Zeit optische Transparenz, was auf eine verbesserte Effizienz für Forschungsanwendungen hindeutet.
- Die Methoden erweisen sich als wirksam bei der Untersuchung verschiedener neurologischer Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie ermöglicht eine schnelle und effiziente Klärung von ZNS-Gewebe und verbessert dadurch die Forschungsmöglichkeiten im Bereich der Neurowissenschaften.
- Die neuartigen Methoden stellen wertvolle Werkzeuge zur Erforschung von Krankheitsmechanismen und Gewebeschädigungen dar.
- Die Auswirkungen auf das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen und die Verbesserung pathologischer Untersuchungen durch verbesserte Bildgebungstechniken sind erheblich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Neue passive Klärmethoden wie psPACT und mPACT beheben eine entscheidende Engstelle in der Neurowissenschafts-Forschung und -Entwicklung, indem sie eine schnelle und hochpräzise optische Durchsichtigkeit des gesamten ZNS-Gewebes ohne elektrophoretische Schäden ermöglichen. Diese Fähigkeit unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung bei Modellen neurodegenerativer Erkrankungen, indem sie die subzelluläre Architektur erhalten und gleichzeitig die Bildgebungszeiträume beschleunigen. Die Methoden erhöhen die Vorhersagegenauigkeit in präklinischen Studien zu Alzheimer, Tumorbildung und Verletzungsmodellen durch eine verbesserte Visualisierung neuropathologischer Phänotypen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in intakten ZNS-Modellen, indem subzelluläre Strukturen und Zellkreisläufe für Target-Engagement-Studien erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Verringert artefaktuelle Veränderungen durch elektrophoretisches Klären des Gewebes und verbessert so die Reproduzierbarkeit von phänotypischen Screening-Ergebnissen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem klarere Messgrößen zum Fortschritt neurodegenerativer Prozesse in krankheitsrelevanten Systemen bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, transparente ZNS-Präparationen, die für hochauflösende Bildgebung von subzellulären Biomarkern und der Modulation von Signalwegen geeignet sind.
- Operativer Wert: Macht spezielle elektrophoretische Ausrüstung überflüssig und senkt so die Hürden für die Implementierung des Assays in verschiedenen Forschungsteams.
- Skalierbarkeit: Mit mPACT wird die Transparenz des Maus-ZNS in etwa 14 Tagen erreicht, wodurch vorhersehbare Zeitpläne für Substanz-Screening-Kampagnen ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Validierung, indem die Gewebestruktur für Längsschnittstudien der Tumorentstehung und entwicklungsgeschichtlichen Missbildungen erhalten bleibt.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Visualisierung subzellulärer Strukturen in pathologischem Gewebe und verringert so die Mehrdeutigkeit bei der Interpretation des Wirkmechanismus.
- Treue des Krankheitsmodells: Unterstützt eine konsistente ZNS-Durchlichtung bei Nagetieren (Maus/Ratte) und verbessert dadurch die Vergleichbarkeit zwischen Studien in der Sicherheitspharmakologie.
Pipeline- und Workflow-Integration
psPACT und mPACT sind in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase einzuordnen und unterstützen insbesondere die Target-Validierung bis hin zur Leitstruktur-Optimierung, indem sie quantifizierbare, bildgebungsgeeignete ZNS-Modelle bereitstellen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch 3D-Kartierung der Proteinexpression und Zellverteilung im intakten Gewebe und klärt die Beteiligung von Signalwegen in Krankheitsmodellen auf.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Gewebeproben, die eine standardisierte Bewertung der Wirkstoffeffekte auf die Architektur des zentralen Nervensystems unterstützen.
- Analytik: Erzeugt abbildgebende Daten mit hoher Auflösung, die es Forschungsteams ermöglichen, strukturelle Veränderungen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen mit verbesserter Signal-Rausch-Relation zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Erhält die proteomische und strukturelle Kontinuität von der Entdeckung bis zu präklinischen Phasen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern in Modellen der Neurodegeneration und von Verletzungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Klärung des zentralen Nervensystems, die in mehreren Projekten zur Erforschung von Neuropathologien eingesetzt werden kann und redundante Methodenentwicklungen reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten durch die Visualisierung im intakten Gewebe verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit, indem variable elektrophoretische Parameter und Abhängigkeiten von Geräten vermieden werden.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Generierung präklinischer Daten für zentralnervensystemwirksame Wirkstoffkandidaten beschleunigt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zur Bekämpfung von Neurodegeneration und Onkologie durch schnellere und aussagekräftigere phänotypische Endpunkte.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Gewebshistologie, Hydrogel-Chemie und der Durchführung von Inkubationsprotokollen, um die mehrstufige Probenvorbereitung zu bewältigen.
- Benötigt Schüttelinkubatoren, Stickstoffgassysteme und temperaturgesteuerte Umgebungen für die Hydrogelpolymerisation und die Clearing-Phasen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung der Lösungen (z. B. VA-044, SDS-Konzentrationen) sowie bei zeitlichen Steuerungen, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen.
- Die Anpassung auf nicht-zentralnervöse Gewebe (z. B. Niere, Milz) erfordert die Validierung von Clearing-Zeiten und der Erhaltung der Struktur, wie in der Quellenliteratur beschrieben.
- Praktische Einschränkung: Der Erfolg des Protokolls hängt von einer sorgfältigen Durchführung ab, da mehrere Vorbereitungsschritte vorhanden sind und Abweichungen zu unvollständigem Clearing oder Gewebeschäden führen können.
