Name: Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Erfahren Sie die passiven Clearing-Methoden psPACT und mPACT zur schnellen optischen Transparenz von Maus-ZNS-Gewebe. Diese Techniken ermöglichen schonende mikroskopische Analysen für neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der entsprechenden Forschung an der Yonsei University College of Medicine genehmigt. Alle Versuchstiere sind nach den Richtlinien des Ausschusses Labor Tierbetreuung Yonsei University College of Medicine geopfert.
1. Vorbereitung der Reagenzien
Achtung: Paraformaldehyd (PFA), Acrylamid und Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) sind giftige Reizstoffe und somit in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA, Kittel, Handschuhe, Schutzbrille) behandelt werden.
<ol><li>4 % Acrylamid (A.A.) Lösung (A4P0): 180 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 20 mL 40 % Acrylamid-Lösung hinzufügen.</li>
	<li>0,25 % VA-044 Lösung: Fügen Sie 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride (VA-044) Pulver auf 200 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Während das VA-044-Pulver bei Raumtemperatur gelagert werden kann, muss es bei 4 ° C bei der Solubilisierung mit PBS-Puffer gespeichert werden. Bereiten Sie um beste Ergebnisse zu erzielen nur die Menge der Lösung für das Experiment benötigt.</li>
	<li>Pakt cocktail Lösung: 225 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung 10 g Acrylamid hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 200 mL mit 4 % PFA. Vor dem Einsatz fügen Sie 100 mg VA-044-Pulver 40 mL der Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Clearing-Lösung Puffer Pakt: 350 mL 0,1 M PBS 40 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) hinzu und stellen Sie die Lautstärke auf 500 mL mit 0,1 M PBS. Fügen Sie 0,5 % α-Thioglycerol mPACT clearing-Lösung hinzu des Pakts Lösung Puffer löschen.</li>
	<li>Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten BALB männliche Mäuse; die Ratten, die in dieser Studie verwendet wurden 2 Wochen alten männlichen SD-Ratten.</li>
</ol>(2) Anästhesie und Chirurgie der Perfusion
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
<ol><li>Betäuben Sie das Tier in einem Pathogen-freies Zimmer mit 30 mg/kg Zoletil mit einer 1 mL Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Überwachen Sie das Tier für 5-10 min.</li>
	<li>Sobald das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat, verwenden Sie die Zehe-Prise Antwort-Methode, die Tiefe der Narkose bestimmen. Bestätigen Sie Reaktionsmangel. Hinweis: Die folgenden Schritte mit Maus und Ratte Chirurgie folgen ein ähnliches Protokoll in einer früheren Studie11verwendet.</li>
	<li>Machen Sie einen ca. 5-6 cm Schnitt unterhalb des Brustkorbs durch das Integument und Bauchwand.</li>
	<li>Geschwungene, stumpfe Scheren ein Schnitt in das Zwerchfell, Abtasten der thorakalen Bereich um die Website der Schnitt vorher zu suchen zu verwenden.</li>
	<li>Erstrecken Sie sich des Schnittes über die gesamte Länge des Brustkorbs, der Pleurahöhle verfügbar zu machen.</li>
	<li>Verdrängen Sie sorgfältig die Lunge. Machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb bis zum Schlüsselbein. Mit Iris-Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt am hinteren Ende des linken Ventrikels. Legen Sie eine Blunt - oder Olive-Kreissägeblätter Perfusion 18-Gauge-Nadel in der Aorta ascendens, durch den Schnitt Ventrikel.</li>
	<li>Sichern Sie die Nadel und klemmend Herzen mit einer Gefäßklemme verhindern Sie auslaufen zu. Alternativ können Sie eine modifizierte Gefäßklemme Klemmen die Aorta auf die Nadelspitze.</li>
	<li>Machen Sie einen großen Schnitt im rechten Vorhof, kümmert sich um minimale Schäden an der absteigenden Aorta zu gewährleisten. Die Ratte ist nun betriebsbereit Perfusion.</li>
</ol>(3) ganze Perfusion und Präparation der Ratte
Achtung: PFA Acrylamid giftige Reizstoffe und sind somit unter einem Abzug mit geeignete PSA behandelt werden.
Hinweis: Ganze Perfusion folgendermaßen ähneln einem ein Protokoll in einer früheren Studie von Woo Et al.verwendet. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Legen Sie den rechten Vorhof des Herzens auf ein 18-Gauge-Nadel, kümmert sich um eventuelle Luftblasen nicht vorstellen.</li>
	<li>Mit einer 50 mL-Spritze, Pumpen Sie schnell und gleichmäßig 50 mL kalten 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL).</li>
	<li>Die 18-Gauge-Nadel an das Rohr der peristaltischen Pumpe anschließen.</li>
	<li>Mit 200 mL kalte 0,1 M-PBS-Lösung mit Heparin (10 Einheiten/mL) bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min waschen.</li>
	<li>Befestigen Sie mit 250 mL kaltem 4 % PFA-Lösung auf eine Umlaufgeschwindigkeit von 10 mL/min. Die Ratte sollte in diesem Stadium steif sein.</li>
	<li>Erheben Sie und speichern Sie die restliche PFA-Lösung für die Entsorgung.</li>
	<li>Pakt perfundieren Sie Gewebe mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044-Pulver mit einem 18-Gauge-Nadel, und entfernen Sie dann den Kopf und Wirbelsäule. Setzen Sie den Schädel durch eine Mittellinie Schnitt vom Hals, die Nase. Diese zusätzliche Perfusion Schritt ist nicht erforderlich für die PsPACT und mPACT Methoden; nach der Fixierung sofort isolieren Sie des Kopfes und der Wirbelsäule und setzen Sie des Schädels aus.</li>
	<li>Setzen Sie die Basis des Schädels durch Entfernen alle restlichen Hals und Wirbelsäule Muskel aus.</li>
	<li>Verwenden Sie Rongeurs und Schere zum abschälen des Schädels. Entfernen Sie das Gehirn und das Rückenmark.</li>
	<li>Speichern Sie das Gewebe in 4 % PFA bei 4 ° C; Gewebe können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden.</li>
</ol>4. Hydrogel Monomer-Infusion und Polymerisation der Ratte und Maus CNS
Achtung: Acrylamid, SDS, α-Thioglycerol und PFA sind Reizstoffe und sollte so behandelt werden, in einer Dampfhaube und mit entsprechenden PINKELN.
<ol><li>
Pakt (passiv Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Isolieren und Kultur ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) aus festen Mäuse und Ratten zu einem 50 mL Röhrchen mit einer gekühlten Pakt cocktail Lösung von 4 % PFA, 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 Pulver und Speicher bei 4 ° C für 24 h stellen Sie sicher, dass das Gewebe in der s vollständig eingetaucht ist. ösung.</li>
		<li>Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung System an einen Stickstofftank angeschlossen gel: Stellen Sie das System auf 37 ° C. Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) Pakt übertragen cocktail Lösung und verbinden mit Rohr Kappe, dann schalten Sie das Vakuum.</li>
		<li>Um das Hydrogel polymerisieren, platzieren Sie das Rohr mit der Probe in einem schütteln Inkubator (150 u/min, 37 ° C) für 3 h oder bis Polymerisation abgeschlossen ist.</li>
		<li>Mit Löschpapier (siehe Tabelle der Materialien), entfernen Sie die restlichen polymerisierten Hydrogel umgebenden Gewebe.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit Clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).</li>
		<li>Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage für die Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PsPACT (Prozess getrennten passiven Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.</li>
		<li>Gewebe zu übertragen, eine 50 mL-Tube mit 4 % PFA und Store bei 4 ° C für 24 h sicherstellen, dass das Gewebe vollständig in das Fixiermittel eingetaucht ist.</li>
		<li>Das fixierte Gewebe für 1 h in 0,1 M PBS waschen und dann übertragen auf A4P0 Lösung (4 % Acrylamid in 0,1 M PBS). Shop bei 37 ° C für 24 h.</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe für 5 min in 0,1 M PBS.</li>
		<li>Tauchen Sie das Gewebe in 0,25 % VA-044 in 0,1 M PBS. Bei 37 ° C für 6-24 h speichern Sie und übertragen Sie dann auf frischen 0,25 % VA-044/PBS-Lösung.</li>
		<li>Die Probe in Stickstoffgas einbetten, für 10 min mit einem Gewebe Hybridisierung gel System (siehe Tabelle der Materialien) an einen Stickstofftank angeschlossen: übertragen Gewebe auf eine 50 mL-Tube mit frisch kalt (4 ° C) 0,25 % VA-044/PBS-Lösung, und in Verbindung mit Rohr Kappe. Schalten Sie das Vakuum.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung (8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (modifizierte Passive Clearing-Technik)
	<ol>
<li>Das ganze ZNS (Gehirn und Rückenmark) mit Knochen Cutter und Schere aus PFA-behoben: Mäuse und Ratten auf einer sauberen Werkbank zu isolieren.</li>
		<li>Führen Sie die Schritte 4.2.2 - 4.2.8 des PsPACT-Protokolls.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gewebe auf clearing-Lösung. Beachten Sie, dass im Gegensatz zu den Pakt und PsPACT Protokolle mPACT eine Clearing-Lösung bestehend aus 0,5 % α-Thioglycerol zusätzlich 8 % SDS mit 0,1 M PBS-Puffer, pH 8.0 benötigt. Α-Thioglycerol ist ein UN-Bräunung Mittel, das hilft Gewebe deutlich schneller und effektiver. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in die Lösung getaucht ist.</li>
		<li>Legen Sie die Probe in einem schütteln Inkubator stellen auf 37 ° C und 150 u/min, bis das Gewebe gelöscht wurde. Im Durchschnitt dauert es ca. 2 Wochen für Maus CNS, volle Klarheit zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Brechungsindex Matching und Immunostaining geräumte CNS
Hinweis: nFelgen (Nycodenz-basierte Brechungsindex passende Lösung) besteht aus 0,8 g/mL Nycodenz Pulver, gelöst in 30 mL Basis-URI Puffer (0,01 % Natriumazid und Tween 20 in PBS 0,1 M, pH 8,0). Es wird empfohlen, dass die Lösung sich in einem 37 ° C schütteln Inkubator befindet, um richtige Solvatation des Pulvers zu ermöglichen.
<ol><li>Inkubieren Sie Gewebe in 0,1 % Triton x-100 in 0,1 M PBS für 2 h, dann blockieren Sie mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in 0,1 M PBS für 6 h.</li>
	<li>Abschnitte in PBST dreimal waschen (0,1 % Tween 20 in PBS 0,1 M) für 2 h. Fleck Abschnitte mit primären Antikörper (in diesem Fall, ein Anti-Kaninchen PECAM-CD31 Antikörper, die Blutgefäße Flecken) für 2 Tage.</li>
	<li>Färben Sie Abschnitte mit Sekundärantikörper (in diesem Fall eine Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3 fluoreszierende Konjugat) in 2 % BSA für 2 Tage.</li>
	<li>Waschen mit der Bezeichnung Gewebe dreimal in PBST für 2 h und laden in 15 mL nFelgen für 2-10 Tage.</li>
	<li>Bewegen Sie vor Bildgebung beschrifteten Gewebe, eine kleine Menge von n-Felgen auf 35 oder 60 mm Gewebekultur Schalen. Befestigen Sie mit Silikon am unteren Rand der Schale.</li>
	<li>1,5-2 mL frische nFelgen hinzugeben.</li>
</ol>6. Bildbearbeitung
<ol><li>Abrufen von Bildern der geräumten Gewebe mit Kachel Scannen mit einem konfokalen Laserscanning-Microscopewith 10 X Vergrößerung (siehe Tabelle der Materialien). Für Cy3 beschriftet Gewebe, verwenden Sie Wellenlängen von 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
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<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist. In de...

Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.
Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.
Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT ("Prozess-separater Pakt") und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Reinigungslösung</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS Lösung</td></tr><tr><td>40% Acrylamid Lösung</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymerisation (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&akut;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]Dihydrochlorid</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymerisation (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Clearing-Lösung (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS-Lösung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS-Lösung</td></tr>, <tr><td>PECAM-CD31-Antikörper</td>, <td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immunfärbendes</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG Cy3 fluoreszierendes Konjugat</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, Polymerisation</td></tr><tr><td>20X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH 7,4)</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Puffer</td></tr><tr><td>10 mL Stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Lösungstransfer</td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Clearingröhrchen</td></tr><tr><td>35 mm Zellkulturschale</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Bildgebung</td></tr><tr><td>Konfokalschale</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Bildgebung</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Korea Vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anästhesie&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL Spritze</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymerisation (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Papier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Löschpapier zur Gelentfernung</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue Gel-Hybridisierungssystem</td></tr></tbody></table>

neuartige passiv clearing methoden für die schnelle produktion von optischen transparenz im gesamten zns-gewebe

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT ("modifizierte Pakt") bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.

Generation ein transparentes Modell des gesamten ZNS mit optimierten passiven Clearing-Techniken
Optische Clearance von Maus und Ratte ganze CNS-Gewebe wurde schnell erreicht mit verschiedenen Techniken der passiven Clearing (Abbildung 1). Abbildung 2Azeigt eine schematische Darstellung des Gewebes im Laufe der Zeit löschen. Im Gegensatz zu der Original...

Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Das übergeordnete Ziel dieser psPACT- und mPACT-Methoden ist die schnelle Reinigung des gesamten ZNS-Gewebes, ohne dass ein elektrophoretisches Gewebereinigungssystem erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Modellfeld der Humankrankheitsforschung zu beantworten, wie z. B. die Alzheimer-Krankheit oder Verletzungen und Degeneration sowie die Tumorgenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das ZNS-Gewebe der Maus durch die elektrophoretische Gewebereinigung nicht geschädigt wird und durch die modifizierte passive Reinigung schnell entfernt wird.Wir hatten die Idee zu dieser Methode, nachdem wir die ursprüngliche PACT- und frühere Methode zur Gehirnreinigung verwendet hatten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da psPACT und mPACT-Methoden schwierig durchzuführen sind, da diese Methode mehrere Phasen der Probenvorbereitung umfasst. Beginnen Sie mit der Zubereitung der PACT-Cocktaillösung, indem Sie VA-044-Pulver zu einer Lösung aus 4 % PFA und 4 % Acrylamid in einer Endkonzentration von 0,25 % hinzufügen. Nachdem Sie das Gewebe mit PACT-Lösung durchblutet haben, tauchen Sie das gesamte Gehirn und das Rückenmark vollständig in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit gekühlter PACT-Lösung und lagern Sie es 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius.Übertragen Sie das Gewebe 24 Stunden später in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit frischer, kalter PACT-Lösung und verbinden Sie den Röhrchendeckel mit einem Gewebegel-Hybridisierungssystem, das mit einem Stickstofftank verbunden und auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Schalten Sie dann das Vakuum und das Gas für 10 Minuten ein, um die Probe in Stickstoffgas einzubetten. Um das Hydrogel zu polymerisieren, legen Sie das Röhrchen mit der Probe für drei Stunden oder bis zum Abschluss der Polymerisation in einen Schüttelinkubator mit 150 U/min und 37 Grad Celsius.Verwenden Sie nach der Inkubation Löschpapier, um das restliche polymerisierte Hydrogel zu entfernen, das das Gewebe umgibt. Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit der Reinigungslösung. Legen Sie die Probe in einen Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde.Im Durchschnitt dauert es etwa 20 Tage, bis das ZNS der Maus die volle Klarheit erreicht hat. Beginnen Sie psPACT mit dem ZNS von einer Maus, die mit 4 % PFA durchblutet wurde und 24 Stunden lang in 4 % PFA bei vier Grad Celsius nachfixiert wurde. Waschen Sie das fixierte Gewebe eine Stunde lang in 0,1 molaren PBS.Übertragen Sie das Gewebe nach dem Waschen in die A4P0-Lösung und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Tauchen Sie das Gewebe am nächsten Tag nach dem Waschen des Gewebes fünf Minuten lang in PBS in 0,25 % VA-044 in PBS und inkubieren Sie es sechs bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Durch die Trennung des Acrylamids und den anschließenden VA-044-Schritt wird vermieden, dass verbleibende nicht polymerisierte Hydrogel-Monomere, die das Gewebe umgeben, entfernt werden müssen, was die endgültige Gewebeintegrität beeinträchtigen kann, nachdem die Transparenz mit PACT erreicht wurde.Nach der Inkubation das Gewebe in frische, kalte VA-044-Lösung überführen. Betten Sie die Probe dann 10 Minuten lang in Stickstoffgas ein. Übertragen Sie das Gewebe in die Reinigungslösung.Inkubieren Sie die Probe dann in einem Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde. Im Durchschnitt dauert es etwa 17 Tage, bis das ZNS der Maus vollständige Klarheit erreicht. Befolgen Sie für mPACT das Protokoll für psPACT bis zum Schritt der Clearinglösung.Tauchen Sie dann die Gewebereinigungslösung, die 0,5 % Alpha-Thioglycerin, ein Entbräunungsmittel, zusätzlich zu 8 % SDS enthält, vollständig in 0,1 molare PBS ein. Legen Sie die Probe in einen Schüttelinkubator, der auf 37 Grad Celsius und 150 U/min eingestellt ist, bis das Gewebe gereinigt wurde. Im Durchschnitt dauert es nur zwei Wochen, bis das ZNS der Maus mit mPACT die volle Klarheit erreicht.In der vorliegenden Studie erreichten Maushirnproben, die mit dem mPACT-Protokoll behandelt wurden, nach 14 Tagen eine optische Transparenz, vor Proben, die mit den PACT- und psPACT-Protokollen behandelt wurden. Ganze ZNS-Proben der Ratte, die mit mPACT geklärt wurden, erreichten eine maximale Clearance innerhalb von 20 Tagen. Erwachsene Rattengehirne allein, im Gegensatz zum gesamten ZNS, wurden mit mPACT in nur fünf Tagen beseitigt.Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen mit dem gesamten ZNS der Maus durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und Anatomie, pathophysiologische Erkrankungen wie Gewebeverletzungen, Entwicklungsfehlbildungen, Krebs und neurodegenerative Erkrankungen in ZNS-Modellen von Säugetieren zu erforschen.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Optische Clearing-Techniken revolutionieren die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. In diesem Bericht beschreiben wir Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), das konsistentere und kostengünstigere Ergebnisse liefert.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Tumorsphäroide werden zunehmend zur Beurteilung von Tumorzell-Mikroumgebung-Interaktionen und Therapiereaktionen eingesetzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine robuste, aber einfache Methode zur Semi-Hochdurchsatz-Bildgebung von 3D-Tumorsphäroiden mittels schneller optischer Clearing.

Rapid Optical Clearing für die Semi-Hochdurchsatzanalyse von Tumorsphäroiden

Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH  - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.

Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns

Dieses Protokoll kombiniert optisches Clearing und Immunmarkierung für die konfokale Bildgebung des gesamten Volumens von Netzhautorganoiden in der gesamten Halterung. Es bewahrt die 3D-Struktur und ermöglicht eine detaillierte Visualisierung wichtiger neuronaler Signalwege und verbessert die Untersuchung der Netzhautreifung, der räumlichen Organisation und ihrer potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin.

Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Optische Clearing-Techniken, wie z. B. die Absorption von Moleküllösungen, reduzieren vorübergehend die Lichtstreuung, um die biologische Bildgebung zu verbessern und biokompatible, reversible In-vivo-Bildgebungsstrategien für tief eingebettete Organe zu bieten. Dieses Protokoll stellt detaillierte experimentelle Verfahren sowie fortschrittliche Bildverarbeitung vor, um eine qualitativ hochwertige, dynamische Bildgebung für die Echtzeitdynamik bei lebenden Tieren zu erzielen.

Transientes optisches Clearing mit absorbierenden Molekülen für die ex vivo und in vivo Bildgebung

Erfahren Sie die passiven Clearing-Methoden psPACT und mPACT zur schnellen optischen Transparenz von Maus-ZNS-Gewebe. Diese Techniken ermöglichen schonende mikroskopische Analysen für neurologische Forschung.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

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