Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls zu demonstrieren, die zu konsistenteren und kosteneffizienteren Ergebnissen führen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise zur 3D-Morphologie und zur Konnektivität im zentralen Nervensystem. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Konsistenz der optischen Klärung und der Mikroskopie im zentralen Nervensystem der Maus verbessert.

Auf kostengünstige und reproduzierbare Weise. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Aufbau der Abbildungskammer kompliziert ist und aus der schriftlichen Beschreibung nicht leicht ersichtlich wird.

Verwenden Sie paraformaldehydfixiertes Gehirn- und Rückenmarkgewebe von Mäusen, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Halbieren Sie das Gehirn, indem Sie es in eine Kunststoff-Hirnmatrix für Mäuse legen und entlang der Mittellinie mit einer Matrixklinge schneiden. Geben Sie jede Gehirnhälfte und das Rückenmark in separate 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Jeweils mit 40 Milliliter Hydrogel-Lösung. Die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um die Fluorophore zu schützen. Die Röhrchen mit Proben und Hydrogel sieben Tage lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren.

Nach der Inkubationszeit 25 Milliliter Hydrogel verwerfen, sodass die Probe und etwa 25 Milliliter Hydrogel im Zentrifagenröhrchen verbleiben. Als Nächstes die Probe entgasen, indem der Verschluss entfernt wird, das Zentrifagenröhrchen in ein Exsikkatorglas gestellt wird und das Glas mit einem Vakuum verbunden wird. Das Vakuum mindestens 10 Minuten lang anlegen.

Vorsichtig schütteln, um die Blasen des entstandenen Sauerstoffs zu lösen. Nach 10 Minuten das Vakuum im Exsikkatorgefäß innerhalb von zwei bis drei Minuten durch 100 % Stickstoffgas ersetzen. Sobald sich der Druck ausgeglichen hat und der Deckel des Exsikkatorgefäßes geöffnet werden kann, die Röhre schnell verschließen, um eine erneute Einführung von Sauerstoff zu verhindern.

Als Nächstes das Hydrogel polymerisieren, indem das Gefäß mit der Probe für drei Stunden in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius gestellt wird, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Nach drei Stunden erhält das polymerisierte Hydrogel eine gelartige Konsistenz. Mit einem Spatel die polymerisierte Probe aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen und überschüssiges Hydrogel von der Probe abschneiden.

Entfernen Sie abschließend das verbleibende Hydrogel, indem Sie die Probe auf ein fusselfreies Tuch legen und das Gewebe vorsichtig darauf reiben und rollen, wobei nur eine dünne Schicht des polymerisierten Hydrogels auf der Probe zurückbleibt. Um den Entfernungsvorgang von Lipiden zu beginnen, überführen Sie die polymerisierte Probe in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 45 Millilitern Klärpuffer und inkubieren Sie sie sieben Tage lang bei 45 Grad Celsius unter sanftem Schütteln. Wechseln Sie den Puffer täglich während dieser anfänglichen siebentägigen Phase, indem Sie den verwendeten Klärpuffer in einen chemischen Abfallbehälter gießen.

Und Zugabe von 45 Milliliter frischem Klärpuffer. Sobald alle Lipide solubilisiert sind und das Gewebe transparent wird, überführen Sie die Probe in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 45 Milliliter PBST gefüllt ist, und waschen Sie die Probe viermal bei 40 Grad Celsius mit sanftem Schütteln innerhalb der nächsten 24 Stunden, um restliches SDS zu entfernen. Nach dem letzten PBST-Waschschritt überführen Sie die Probe in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI und 1×PBST gefüllt ist.

Mit Folie abdecken und 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Tag dreimal mit PBST bei Raumtemperatur waschen, wobei jede Waschung mindestens sechs Stunden dauern sollte. Anschließend mit der Brechungsindex-Anpassung fortfahren.

Um diesen Teil des Verfahrens zu beginnen, überführen Sie die Probe in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 2-2 Thiodiethanol und 1xPBS bei pH 7,5 gefüllt ist, und inkubieren Sie wie auf dem Bildschirm gezeigt. Gegen Ende der zweiten Inkubation stellen Sie eine Bildgebungs-Kammer her, indem Sie ein Stück wiederverwendbaren Klebstoff zu einem Zylinder mit gleichmäßigem Durchmesser rollen, der geringfügig größer ist als die Dicke der Probe. Legen Sie den Zylinder als offenen Kreis auf eine 40-Millimeter-Glasboden-Dish.

Verwenden Sie dann eine P1000-Pipettenspitze, um durch Abrollen entlang des äußeren Randes des Zylinders eine Dichtung zwischen dem wiederverwendbaren Klebstoff und dem Glas herzustellen. Geben Sie mithilfe der Pipette etwa 100 Mikroliter 63 % TDE auf die Glasunterlage und verteilen Sie die Lösung, sodass die Glasoberfläche innerhalb des Kreises aus wiederverwendbarem Klebstoff bedeckt ist. Platzieren Sie die Probe anschließend vorsichtig mit einem Spatel in der Mitte des Kreises, wobei Sie darauf achten sollten, keine Blasen zu bilden.

Als Nächstes pipettieren Sie weitere 100 Mikroliter 63 % TDE direkt auf die Probe und legen sofort ein kreisförmiges Deckglas mit einem Durchmesser von 40 Millimetern über den wiederverwendbaren Kleber. Drücken Sie vorsichtig mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände entlang des Randes des Kreises, bis das Deckglas die Probe berührt. Bringen Sie die Glasbodenschale nun langsam in eine aufrechte Position, wobei sie an einer Oberfläche anlehnt, und fügen Sie mit einer Pipette 63 % TDE hinzu, bis die Lösung die kleine Öffnung an der Oberseite erreicht.

Verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Pipettenspitze abzutrocknen, damit die Lösung nicht auf das Glas tropft. Fügen Sie abschließend Silikonelastomer zur kleinen Öffnung hinzu, um den Kreis zu schließen und eine geschlossene Kammer zu erzeugen. Warten Sie fünf Minuten zum Trocknen, und fahren Sie dann mit der Bildgebung fort.

Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit der Probe im Inneren auf dem Objekttisch eines laser-scanning-konfokalen Mikroskops. Öffnen Sie die Bildgebungsoftware, um den Argon-Anregungslaser einzuschalten. Klicken Sie dazu auf den Konfigurationsreiter oben im Programm und anschließend auf das Laser-Symbol. Aktivieren Sie das Kästchen neben Argon, um den Laser einzuschalten, und stellen Sie den Schieberegler auf 30 %. Wechseln Sie danach zurück zum Reiter „Erfassen“ oben im Programm.

Wählen Sie im Bereich Einstellungen für den Strahlengang das Feld zum Laden und Speichern aus, und wählen Sie im Dropdown-Menü den geeigneten Wellenlängenkanal zur Emission von YFP aus. Wählen Sie im Bereich Kanaleinstellungen die geeigneten Objektive für die Bildaufnahme aus, indem Sie den roten Hyperlink mit der Bezeichnung „objective current object“ anklicken. Verwenden Sie Objektive mit einer Arbeitsdistanz, die größer ist als die Dicke des Gewebes.

Sowie eine große numerische Apertur, um die in der Ebene liegende Bildauflösung zu maximieren und die optische Schichtdicke zu minimieren. Öffnen Sie in der linken Spalte der Dropdown-Menüs das Fenster für die XY-Auflösung, um die Aufnahmematrix, genannt Format, auf 1024×1024 oder einen für die laterale Auflösungsgrenze des Objektivs geeigneten Wert einzustellen. Stellen Sie den Zoomfaktor so niedrig wie möglich ein.

1,7 wird hier verwendet. Stellen Sie im selben Fenster die Parameter „Durchschnitt aus acht Zeilen“ und „Durchschnitt aus einem Bild“ ein, indem Sie entsprechend die jeweils beschrifteten Menüs öffnen. Suchen Sie die Probe mithilfe der Tischsteuerung.

Sobald ein repräsentatives Feld sichtbar ist, stellen Sie den Verstärkungsfaktor für YFP auf einen Wert zwischen 760 und 780 und die Offset-Einstellung auf einen Wert zwischen 1,0 und 1,5 ein. Wählen Sie die Kachel-Scan-Funktion aus und legen Sie anschließend die oberen und unteren Grenzen des zu erfassenden Z-Stapels fest.

Stellen Sie die Dicke des optischen Schnitts basierend auf der Auflösungsgrenze des Objektivs ein und beginnen Sie anschließend mit der Aufnahme. Dieses Bild zeigt YFP-positive Neuronen in der Großhirnrinde und im Hippocampus, die mit 5x Vergrößerung aufgenommen und in 3D rekonstruiert wurden. Die Maßstabsleiste entspricht einem Millimeter.

Diese Projektion der maximalen Intensität eines 10x-Bildstapels der Großhirnrinde zeigt die dendritische Verzweigung von Pyramidenneuronen der kortikalen Schicht fünf. Hier repräsentiert die Maßstabsleiste 100 Mikrometer. Hier wird die THY-1YFP-Expression in einem intakten zervikalen und thorakalen Rückenmark gezeigt, das mit 5facher Vergrößerung aufgenommen und in 3D rekonstruiert wurde.

Die Maßstabsleiste repräsentiert zwei Millimeter. Schließlich zeigt diese Projektion der maximalen Intensität eines mit 10x abgebildeten Stapels des Rückenmarks einzelne Axone, wobei die Maßstabsleisten 100 Mikrometer repräsentieren. Bei korrekter Durchführung kann diese Technik innerhalb von zwei bis vier Wochen für ganze Rückenmarkproben und vier bis sechs Wochen für halbierte Gehirne durchgeführt werden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die immunhistochemische Färbung angewendet werden, um Fragen zu beantworten, die eine komplexere biochemische Phänotypisierung erfordern. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das zentrale Nervensystem einer Maus optisch klären und abbilden kann. Mithilfe der passiven Klärung und der Laser-Konfokalmikroskopie.