Name: Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie modifizierte passive CLARITY-Methoden für optisches Clearing des Maus-Zentralnervensystems. Diese kostengünstige Technik ermöglicht konsistente 3D-Bildgebung von Neuronen und Konnektivität in der Neurowissenschaft.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH / NINDS) Zuschuss 1R01NS086981 und der Conrad N. Hilton Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Laurent Bentolila und Dr. Matthew Schibler für ihre unschätzbare Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken, die an der CLARITY-Forum beigetragen haben (http://forum.claritytechniques.org). Wir danken vor allem Dr. Karl Deisseroth für eröffnet sein Labor diese faszinierende Technik zu lehren. Die Autoren sind dankbar für die großzügige Unterstützung von der Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace-Stiftung, Ahmanson Stiftung, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. und Linda R. Dietel Philanthropische Fund, und Northstar Fund . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde, auch teilweise von der National Center for Research Resources und vom Amt des Direktors der Nation unterstütztal Institutes of Health unter preis Zahlen C06RR012169, C06RR015431 und S10OD011939. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt. THY1-YFP, PLP-EGFP und PV-tdTomato Mäuse wurden für diese Experimente verwendet, aber alle Mäuse fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfolgreich gelöscht werden kann und abgebildet. 1. Gewebepräparation Achtung: Paraformaldehyd (PFA) und Acrylamid sind giftig und Reizstoffe. Führen Sie Experimente diese Reagenzien in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille). <ol><li> Sacrifice das Tier in Euthanasie Kammer mit ~ 1 ml Isofluran, bis die Atmung aufhört (~ 2 - 3 min). </li><li> Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe auf ~ 5 ml / min bis intrakardial perfuse die Maus mit Perfusionslösung (Tabelle 1) bei 4 ° C , bis das Blut aus den Geweben gelöscht (5 - 10 min). </li><li> Ändern Sie den Perfusat zu Fixierungslösung (Tabelle 1)bei 4 ° C bis zur Ausschöpfung der Hals und Schwanz deutlich versteift (5 - 10 min). </li><li> Beenden Sie die Perfusion und köpfen das Tier. Sezieren vorsichtig heraus das Gehirn aus dem Schädel , indem zuerst das Bindegewebe Entfernen des Schädels umgibt und dann Knochen von der ventralen Oberfläche des Schädels zu entfernen und das Gehirn heraus (Abbildung 1a) anheben, wie in 20 beschrieben. Hinweis: Geben Sie die Entfernung von Knochen besondere Sorgfalt flocculonodularis Lappen des Kleinhirns umgibt und die Riechkolben. <ol><li> Präparieren Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule durch sanft mit der Spitze eines feinen, scharfen Schere zwischen dem Rückenmark und der Wirbelsäule einsetzen und die einzelnen Wirbelsäulensegmenten weg schneiden, wie in 21 beschrieben. </li></ol></li><li> Hemisect das Gehirn, indem es in einer Kunststoffmatrix Mausgehirn Plazieren und mit einer Matrix Klinge entlang der Mittellinie schneiden. </li><li> Fügen Sie jede Hemisphäre und Rückenmark zu trennen 50 ml Zentrifugen Wannees mit ~ 40 ml Hydrogel - Lösung (Tabelle 1). Von diesem Punkt an Abdeckung die Rohre mit einer Aluminiumfolie, die Fluorophore bei allen nachfolgenden Schritten zu schützen. </li><li> Inkubiere das Rohr die Probe in Hydrogel bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) für 7 Tage enthält. </li></ol> 2. Polymerisation <ol><li> Verwerfen ~ 25 ml Hydrogel, Konservieren der Probe und ~ 25 ml Hydrogel in dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Desoxygenieren die Probe durch Entfernen der Kappe und das Zentrifugenröhrchen in Exsikkator Glas platzieren und das Glas auf ein Vakuum zu verbinden. Gelten das Vakuum für mindestens 10 min gelösten Gasen zu ermöglichen, aus der Lösung und Blasen bilden zu kommen. Schütteln Sie die Luftblasen zu entfernen. </li><li> Ersetzen Sie das Vakuum im Exsikkator Glas mit 100% Stickstoffgas über 2 - 3 min. Sobald der Druck ausgleicht (einmal die Spitze des Exsikkator Glas geöffnet werden kann), die Kappe schnell das Rohr die Wiedereinführung von Sauerstoff zu verhindern. </li><li> Polymerize das Hydrogel durch das Rohr mit Probenabgabe in einem 37 ° C Wasserbad für 3 Stunden, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Polymerisierte Hydrogel nimmt auf einer gelartigen Konsistenz (Abbildung 1b). Hinweis: Eine geringe Menge an nicht-polymerisierten Hydrogels am oberen akzeptabel ist. </li><li> Verwenden Sie einen Spachtel, um den polymerisierten Probe aus dem Zentrifugenröhrchen zu entfernen, dann schneiden Sie das überschüssige Hydrogel aus der Probe entfernt. </li><li> Entfernen Sie die verbleibenden Hydrogel, das durch die Probe auf einem fusselfreien platzieren frei wischen und sanftes Reiben und Rollen des Gewebes auf sie, nur hinter einer dünnen Schicht aus polymerisiertem Hydrogel auf die Probe zu verlassen. </li></ol> 3. Lipidentfernung Hinweis: Lipid-frei Gewebe zerbrechlich ist, mit Vorsicht handhaben. Verwenden Sie eine Zelle Sieb, wenn das Rohr Ablassen verlieren Probe zu vermeiden. Außerdem quellen die Probe während des gesamten Löschvorgang jedoch Quellung während der Brechungsindex-Anpassungsprozeß umgekehrt werden. Achtung: Sodium Dodecylsulfat (SDS) und Borsäure sind reizend. Führen Sie Experimente, um diese in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Schutzbrille) verwendet wird. <ol><li> Übertragen polymerisierten Probe in ein sauberes 50 - ml - Zentrifugenröhrchen eingewogen und 45 ml Clearing - Puffer (Tabelle 1). Inkubieren bei 45 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm). Ändern Sie den Puffer täglich für zunächst 7 Tage um die verbrauchte Clearing-Puffer in chemische Abfälle Abgießen und Zugabe von ~ 45 ml frischem Clearing-Puffer. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> Nach den ersten 7 Tagen Inkubation der Probe bei 40 ° C und Austausch Clearing Puffer alle 2 - 3 Tage. Weiter Lichtung , bis alle Lipide löslich gemacht sind und Gewebe erreicht Transparenz (Abbildung 1c). Dies wird 4 - 6 Wochen für eine Maus Gehirnhemisphäre und 2 - 4 Wochen für eine Rückenmark. </li><li> Sobald Gewebe gelöscht ist, übertragenProbe auf eine neue 50 ml - Zentrifugenröhrchen und wasche 4 Mal in PBST (Tabelle 1) bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 min) über 24 h Rest SDS zu entfernen. </li></ol> 4. Molekulare Färbung Achtung: 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) ist ein Reizmittel und alle Experimente unter Verwendung sollte es in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen Sie die Probe in einen sauberen 15 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH-Wert 7,5. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 24 Std. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen. </li><li> 3 x waschen in PBST bei RT für mindestens 6 h / Wäsche. </li></ol> 5. Anpassung des Brechungsindex Achtung: 2,2&#39;-Thiodiethanols (TDE) ist ein Reizmittel und alle Experimente verwendet es shOuld in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden. <ol><li> Übertragen, um die Probe in einen sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen geben und mit 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Inkubieren bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 Upm) für 24 Std. </li><li> Austausch von 30% TDE mit 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. bei 40 ° C inkubieren unter leichtem Schütteln 24 Stunden. Hinweis: Die Probe wird schrumpfen zurück auf etwa Originalgröße. </li><li> Auf einem flachen, saubere Oberfläche ein Stück wiederverwendbarer Klebstoff in einen Zylinder mit einheitlichem Durchmesser rollen nur geringfügig größer als die Dicke der Probe. </li><li> Legen Sie den wieder verwendbaren Klebstoffzylinder in einem offenen Kreis (~ 25 mm Innendurchmesser mit einer kleinen Öffnung an der Spitze) auf einem 40 mm Glasbodenschale. Wenn Korrekturen vorgenommen werden müssen, entfernen Sie den Zylinder aus dem Glas und schnitt mit einer Rasierklinge. </li><li> Verwenden Sie Spitze eine p1000 Pipette eine Dichtung zwischen dem wieder verwendbaren Klebstoff und Glas zu schaffen, indemes um den äußeren Rand des Zylinders rollen. </li><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l 63% TDE auf die Glasschale und verteilen um die Glasoberfläche innerhalb des Kreises von wieder verwendbaren Klebstoff zu bedecken. </li><li> Mit einem Spatel, legen Sie sorgfältig die Probe in der Mitte des Kreises, kümmert sich nicht um Blasen zu bilden. </li><li> Pipettieren weitere 100 &amp; mgr; l von 63% TDE direkt auf die Probe, dann sofort legen Sie eine 40 mm Kreisdeckglas über den wieder verwendbaren Klebstoff. </li><li> Mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände, drücken Sie vorsichtig um den Umfang des Kreises, bis das Deckglas Kontakt mit der Probe gemacht hat. </li><li> Langsam bringen die Glasbodenschale in eine aufrechte Position gegen eine Fläche ruht, dann fügen Sie 63% TDE mit einer Pipette, bis die Lösung die kleine Öffnung am oberen Ende erreicht. Mit einem fusselfreien wischen Sie die Pipettenspitze zu trocknen, so dass die Lösung nicht auf das Glas tropft. Zur Vermeidung von Blasen in der Kammer, leeren Sie nie die Pipette den ganzen Weg. </li><li> Nachdie kleine Öffnung, fügen Silikonelastomer den Kreis und schaffen eine geschlossene Kammer zu umschließen. Warten Sie 5 Minuten für sie vor der Abbildung, um zu trocknen. </li></ol> 6. Mikroskopie Achtung: Die Laser in der konfokalen, Ebene Beleuchtung und Lichtbogen-Mikroskopie verwendet werden, sind sehr leistungsfähig und kann zur Erblindung führen. Alle Experimente Laser verwendet wird, sollten nach einer umfangreichen Ausbildung und mit großer Vorsicht und entsprechenden Augenschutz durchgeführt werden. <ol><li> Setzen Sie die Druckkammer mit der Probe im Inneren auf der Bühne eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop. </li><li> Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). So schalten Sie die Argon Anregungslaser, klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration an der Spitze des Programms dann den Laser-Symbol. Markieren Sie das Kästchen neben Argon, den Laser einzuschalten und die Folie Skala bis 30% bewegen. Beachten Sie die Zeiger langsam erwärmen zu der gewählten Position. <ol><li> Zurück zur acquire Reiter an der Spitze. In dem großen Feld &quot;Beam Path Settings &amp;# 34; gehen Sie zum Laden / Speichern-Box Einstellung und das Dropdown-Menü wählen Sie einen entsprechenden Wellenlängenkanal Bild YFP (527 nm) zu wählen. </li></ol></li><li> Wählen Sie die entsprechende Ziele für die Bildgebung durch den roten Hyperlink Auffinden der Aufschrift &quot;Ziel: aktuelle Objekt&quot; unter dem Kanaleinstellungen Feld. Ein Klick auf die Registerkarte öffnet alle verfügbaren Ziele und eine Auswahl automatisch den Turm drehen. <ol><li> Verwendung Ziele (z. B. 10X) mit einem großen Arbeitsabstand (größer als die Dicke des Gewebes abgebildet, beispielsweise 11 mm ist) und eine große numerische Apertur (z. B. 0,3) in der Ebene der Bildauflösung zu maximieren und zu minimieren optische Schnittdicke. </li></ol></li><li> Auf der linken Spalte der Dropdown-Menüs, öffnen Sie die &quot;XY: Auflösung&quot; Fenster Erfassungsmatrix zu setzen, die so genannte &quot;Format&quot;, auf 1.024 x 1.024 oder ein angemessener Wert für die laterale Auflösungsgrenze des Objektivs. Stellen Sie den Zoomfaktor so gering wie möglich (z. B. 10,7). </li><li> Im gleichen Fenster stellen 8 Linie Durchschnitt und 1 Frame durchschnittliche Parameter durch Eintropfen entsprechend die individuell beschriftet Menüs nach unten. Verwenden, um große Werte für ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und kleine Werte für eine schnelle Akquisition. Hinweis: 8-Zeilen-Mittelwerte und 1 Frame Durchschnitt erwirbt qualitativ hochwertige Bilder einer Maus Gehirnhälfte in etwa 4 Stunden. </li><li> Suchen Sie die Probe mit Hilfe der Bühne steuert. Sobald eine repräsentative Feld sichtbar ist, stellen Sie die Verstärkung und Offset. Hinweis: Die Verstärkung und Offset werden im Wesentlichen basierend auf dem Gewebetyp variieren, Fluorophore und / oder anatomischen Merkmal abgebildet wird. Für YFP, stellen Werte von 760 bis 780 für die Verstärkung und von -1,0 bis -1,5 für den Offset. </li><li> Wählen Sie &quot;Kachel-Scan&quot; und wählen Sie die Grenzen der Region von Interesse. Den oberen und unteren Grenzen des z-Stapel zu erwerb. Stellen Sie die Dicke des optischen Abschnitt auf der Basis der optischen Schnittauflösungsgrenze des Ziels. Hinweis: Ein Ziel deroptische Abschnitt Auflösungsgrenze wird in erster Linie durch seine numerische Apertur definiert. Die meisten Mikroskop Steuerungssoftware wird automatisch ein angemessener Wert für die objektive Berechnung verwendet wird. Für einen 10X-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 das wäre etwa 11 um betragen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Hinweis: Dies kann mehrere Stunden dauern. </li><li> Sammeln Sie Bilder mit höherer Auflösung höherer Vergrößerung Ziele aus bestimmten Regionen von Interesse verwendet wird. </li></ol>

<ol><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+automated+histology+in+the+pursuit+of+connectomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.</a> J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).</li>
<li>MacKenzie-Graham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimodal%2C+multidimensional+atlas+of+the+C57BL%2F6J+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain.</a> J Anat. 204, 93-102 (2004).</li>
<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li>
<li>Theer, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fundamental+imaging-depth+limit+in+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+A+Opt+Image+Sci.+Vis%22%5BJournal%5D)">On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy.</a> J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Spence, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+CLARITY+to+gray+matter+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Bringing CLARITY to gray matter atrophy.</a> Neuroimage. 101, 625-632 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Sci Rep. 5, 9808(2015).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Struct Funct. , (2015).</li>
<li>Parra, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+brain+expressing+YFP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP.</a> J Vis Exp. (67), e3848(2012).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Viz+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> J Viz Exp. (96), e52580(2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Passive Clearing von Hydrogel eingebettet Gewebe (passive CLARITY) ist eine einfache und kostengünstige Methode für große Gewebestücke zu löschen. Dieser Ansatz erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann leicht in einem temperaturgesteuerten Schüttler durchgeführt werden. Über den Zeitraum von einigen Wochen, auch große, hoch myelinisierten Gewebe, wie eine gesamte Gehirn oder Rückenmark, werden für die Mikroskopie transparent und geeignet sind. Auch wenn dieser Bericht über das Clearing von ZNS-Gewebe konzentriert h...

Die Fähigkeit, komplette neuroanatomische Strukturen abzubilden, ist immens wertvoll für das Verständnis des Gehirns in Gesundheit und Krankheit. Traditionell war bei der 3D-Bildgebung ein Gewebeschnitt erforderlich, um die axiale Auflösung zu gewährleisten und tiefe anatomische Strukturen sichtbar zu machen. Dieser Ansatz kann hochauflösende Datensätze erzeugen, erfordert jedoch ausgefeilte Bildrekonstruktionstechniken und ist sehr arbeitsintensiv. Infolgedessen war es auf die Bildgebung kleiner Gewebevolumina1-3 beschränkt. Das optische Schneiden hingegen eignet sich gut, um hochauflösende 3D-Bilder von fluoreszenzmarkierten Geweben zu erstellen. Da der optische Schnitt von Natur aus dreidimensional ist, sind keine umfangreichen Berechnungen erforderlich, um ein 3D-Bildvolumen zu erzeugen. Lichtstreuung und Gewebetrübung begrenzen jedoch die Tiefe, in der Gewebe optisch geschnitten werden kann. Die Abbildungstiefe ist bei der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie auf etwa 150 μm und bei der Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie4-8 auf weniger als 800 μm begrenzt.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzlich mehrere optische Clearing-Techniken entwickelt und dann weiter verfeinert, um die tiefenmikroskopische Bildgebung von intaktem Gewebe zu ermöglichen. Die Verwendung von Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB), um fixiertes Gewebe transparent zu machen, gehörte zu den frühesten Ansätzen9. Dieser Ansatz war jedoch durch das Quenchen der Fluoreszenz in den Proben und die unvollständige Beseitigung von hochmyelinisierten Strukturen eingeschränkt10. Verfeinerungen dieser Technik, wie z. B. die 3D-Bildgebung von solvent Cleared Organs (3DISCO), haben zu einer sehr schnellen und vollständigen Gewebereinigung geführt, leiden aber immer noch unter einem schnellen Verlust von Fluoreszenzsignalen, insbesondere des gelb fluoreszierenden Proteins (YFP)10. Wässrige Clearing-Lösungen wie Sca/e11 und SeeDB12 bewahren Fluoreszenzsignale, beseitigen aber hochmyelinisiertes Gewebe nicht vollständig. Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) ist eine vielversprechende neue optische Clearing-Technologie, die die Einschränkungen zuvor entwickelter wasserbasierter Clearing-Lösungen zu überwinden scheint13. Im Gegensatz zu anderen optischen Clearing-Techniken bettet das mit Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridisierte Rigid Imaging-kompatible Tissue-hYdrogel (CLARITY)14 das Gehirn in eine poröse Matrix ein, die Proteinen, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen strukturelle Integrität verleiht, während die Lipide ungebunden bleiben. Die Lipide werden dann elektrophoretisch entfernt, was zu einem optisch gereinigten Gehirn führt, das mit allgemein verfügbaren Techniken leicht visualisiert und ebenso leicht untersucht werden kann.
Elektrophoretische Gewebereinigung (ETC) wird verwendet, um Lipide aus in Hydrogel eingebetteten Geweben in CLARITY zu entfernen, jedoch kann es schwierig sein, ETC konsistent zu implementieren und Gewebe, die der Elektrophorese unterliegen, können Gewebeverzerrung, Bräunung, Verlust der Fluoreszenz und Antikörperreaktivität aufweisen. Passives Lipidclearing vermeidet diese Einschränkungen, erfordert jedoch längere Clearingzeitenvon 15-17. Das passive Clearing ermöglicht auch das parallele Clearing einer großen Anzahl von Proben, da es nicht durch die Anzahl der verfügbaren ETC-Geräte begrenzt ist. Die Verringerung der Konzentration von Paraformaldehyd und der Ausschluss von Bis-Acrylamid aus dem Hydrogel haben zu einer starken Steigerung der Clearing-Geschwindigkeit auf Kosten einer stärkeren Gewebeausdehnung geführt16. Es wurden kostengünstigere Alternativen zur Brechungsindexanpassungslösung entwickelt, die in der ursprünglichenCLARITY-Technik verwendet wurde 17-19. 2,2'-Thiodiethanol (TDE) ist ein kostengünstiges und schnelles Clearingmittel für das Gehirn, das einen Teil der Gewebeausdehnung, die bei der Lipidentfernung auftritt, rückgängig macht18. Dieser Bericht beinhaltet die passive Reinigung von in Hydrogel eingebettetem Gewebe und die Verwendung von TDE als Brechungsindex-Matching-Lösung für die ursprüngliche CLARITY-Technik, um ein hochgradig reproduzierbares und kostengünstiges Protokoll für die optische Reinigung des Zentralnervensystems der Maus zu erstellen.

<table><tbody><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15714-5</td><td>Perfusion und Hydrogel</td></tr><tr><td>2,2'-Thiodiethanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>Brechungsindex-Matching-Lösung</td></tr><tr><td>40%</td><td>Acrylamid Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>2% Bis-Acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>VA-044 Initiator</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>Hydrogel</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>Clearing-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>Clearing-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>Konservierungsmittel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Natriumnitrat</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Kernfärbung</td></tr><tr><td>99,9% Isofluran</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Hydrocholorinsäure</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Glasbodenschale</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040 Willco</td><td>Schalen</td></tr><tr><td>Wiederverwendbarer Klebstoff</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Silikonelastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>Fusselfreies Tuch</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Maus Gehirn Matrix</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>Gewebe schneiden</td></tr><tr><td>Matrixklingen</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>Gewebe schneiden</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>Pefusion</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>Mikroskopie</td></tr></tbody></table>

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Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionell erforderte die Gewebevisualisierung, dass das Gewebe von Interesse seriell geschnitten und abgebildet wird, wodurch jeder Gewebeschnitt einzigartigen nichtlinearen Verformungen unterzogen wurde, was die Fähigkeit, die zelluläre Morphologie, Verteilung und Konnektivität im zentralen Nervensystem (ZNS) zu beurteilen, dramatisch behinderte. Optische Clearing-Techniken verändern jedoch die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. Diese Ansätze ermöglichen es, tief in intakte Organpräparate einzudringen, was einen enormen Einblick in die strukturelle Organisation von Geweben bei Gesundheit und Krankheit bietet. Techniken wie Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) erreichen dieses Ziel, indem sie eine Matrix bereitstellen, die wichtige Biomoleküle bindet und gleichzeitig lichtstreuende Lipide frei diffundieren lässt. Die Lipidentfernung, gefolgt von der Anpassung des Brechungsindex, macht das Gewebe transparent und lässt sich leicht in 3 Dimensionen (3D) abbilden. Nichtsdestotrotz kann es schwierig sein, das elektrophoretische Gewebeclearing (ETC), das im ursprünglichen CLARITY-Protokoll verwendet wurde, erfolgreich zu implementieren, und die Verwendung einer proprietären Lösung zur Anpassung des Brechungsindex macht es teuer, die Technik routinemäßig anzuwenden. Dieser Bericht demonstriert die Implementierung eines einfachen und kostengünstigen optischen Clearing-Protokolls, das passives CLARITY für eine verbesserte Gewebeintegrität und 2,2′-Thiodiethanol (TDE), eine zuvor beschriebene Lösung zur Anpassung des Brechungsindex, kombiniert.

die strukturelle Organisation des Gehirns sichtbar machen ist entscheidend für das Verständnis, wie die Morphologie und Konnektivität Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Optische Clearing-Techniken machen es möglich, Bildzellpopulationen in 3D in intakten Geweben, so dass wir kohäsiv Morphologie und Konnektivität zu studieren. Mäuse, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, angetrieben durch spezifische...

Optische Clearing-Techniken revolutionieren die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. In diesem Bericht beschreiben wir Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), das konsistentere und kostengünstigere Ergebnisse liefert.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls zu demonstrieren, die zu konsistenteren und kosteneffizienteren Ergebnissen führen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise zur 3D-Morphologie und zur Konnektivität im zentralen Nervensystem. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Konsistenz der optischen Klärung und der Mikroskopie im zentralen Nervensystem der Maus verbessert.Auf kostengünstige und reproduzierbare Weise. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da der Aufbau der Abbildungskammer kompliziert ist und aus der schriftlichen Beschreibung nicht leicht ersichtlich wird.Verwenden Sie paraformaldehydfixiertes Gehirn- und Rückenmarkgewebe von Mäusen, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Halbieren Sie das Gehirn, indem Sie es in eine Kunststoff-Hirnmatrix für Mäuse legen und entlang der Mittellinie mit einer Matrixklinge schneiden. Geben Sie jede Gehirnhälfte und das Rückenmark in separate 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Jeweils mit 40 Milliliter Hydrogel-Lösung. Die Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um die Fluoro

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Chronische Augenhypertension induziert wird mittels Laserkoagulation der Trabekelnetzwerk in Maus Augen. Der Augeninnendruck (IOP) wird für mehrere Monate nach der Laser-Behandlung erhöht. Die Abnahme der Sehschärfe und Kontrastempfindlichkeit von Versuchstieren werden anhand des optomotor Test.

Ein Laser-induzierten Maus-Modell der chronischen Ocular Hypertension zu Sehfehler Charakterisierung

In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Supraspinale Projektionen sind wichtig für die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen, und serotonerge Fasern sind eines dieser Fasersysteme. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Anwendung des kombinierten CLARITY/CUBIC-Protokolls auf das Rückenmark der Maus, um die Terminierung dieser serotonergen Fasern zu untersuchen.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Maus mit hochauflösenden spektralen Bereich optische Kohärenztomographie (SD-OCT). Es konzentriert sich auf die retinalen Ganglienzellen (RGC) in der peripapillären Region mit mehreren scannen und Quantifizierung der beschriebenen Ansätze.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Hier präsentieren wir eine Anpassung der passiven Klarheit und 3D-Rekonstruktion Methode zur Visualisierung der Eierstöcke Gefäßsystem und follikulären Kapillaren in intakten Maus Eierstöcke.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Lähmung und Opticospinal Entzündung durch Übertragung von Aquaporin-4 (AQP4) induzieren-spezifischen T-Zellen von AQP4- / - Mäusen in WT-Mäuse. Darüber hinaus führen wir serielle optische Kohärenztomographie verwenden, um visuelle System Funktionsstörung zu überwachen.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Optische Clearing-Techniken, wie z. B. die Absorption von Moleküllösungen, reduzieren vorübergehend die Lichtstreuung, um die biologische Bildgebung zu verbessern und biokompatible, reversible In-vivo-Bildgebungsstrategien für tief eingebettete Organe zu bieten. Dieses Protokoll stellt detaillierte experimentelle Verfahren sowie fortschrittliche Bildverarbeitung vor, um eine qualitativ hochwertige, dynamische Bildgebung für die Echtzeitdynamik bei lebenden Tieren zu erzielen.

Transientes optisches Clearing mit absorbierenden Molekülen für die ex vivo und in vivo Bildgebung

Erfahren Sie modifizierte passive CLARITY-Methoden für optisches Clearing des Maus-Zentralnervensystems. Diese kostengünstige Technik ermöglicht konsistente 3D-Bildgebung von Neuronen und Konnektivität in der Neurowissenschaft.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

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