Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Modifikationen am ursprünglichen CLARITY-Protokoll zu demonstrieren, die zu konsistenteren und kostengünstigeren Ergebnissen führen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die 3D-Morphologie und die Konnektivität im Zentralnervensystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Konsistenz des optischen Clearings und der Mikroskopie im Zentralnervensystem der Maus verbessert.

Und das kostengünstig und reproduzierbar. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Da die Konstruktion der Bildgebungskammer kompliziert und aus der schriftlichen Beschreibung nicht ohne weiteres ersichtlich ist.

Gewinnung von paraformaldehyd-fixiertem Gehirn- und Rückenmarksgewebe von Mäusen, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Hemisezieren Sie das Gehirn, indem Sie es in eine Kunststoff-Maushirnmatrix legen und mit einer Matrixklinge entlang der Mittellinie schneiden. Fügen Sie jede Hemisphäre und jedes Rückenmark zu separaten 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen hinzu.

Jeweils mit 40 Millilitern Hydrogellösung. Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie ab, um die Fluorophore zu schützen. Und inkubieren Sie die Röhrchen mit den Proben und dem Hydrogel sieben Tage lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln.

Nach der Inkubationszeit werden 25 Milliliter Hydrogel aus der Probe und etwa 25 Milliliter Hydrogel im Zentrifugenröhrchen verworfen. Als nächstes entsauern Sie die Probe, indem Sie die Kappe entfernen, das Zentrifugenröhrchen in ein Exsikkatorglas legen und das Glas an ein Vakuum anschließen. Wenden Sie das Vakuum mindestens 10 Minuten lang an.

Schütteln Sie vorsichtig, um die Blasen aus emittiertem Sauerstoff zu entfernen. Ersetzen Sie nach 10 Minuten das Vakuum im Exsikkatorglas über zwei bis drei Minuten durch 100 % Stickstoffgas. Sobald sich der Druck ausgleicht und der Deckel des Exsikkatorbehälters geöffnet werden kann, verschließen Sie das Röhrchen schnell, um das erneute Eindringen von Sauerstoff zu verhindern.

Als nächstes polymerisieren Sie das Hydrogel, indem Sie das Röhrchen mit der Probe drei Stunden lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad legen, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Nach drei Stunden nimmt das polymerisierte Hydrogel eine gelartige Konsistenz an. Verwenden Sie einen Spatel, um die polymerisierte Probe aus dem Zentrifugenröhrchen zu entfernen, und schneiden Sie dann das überschüssige Hydrogel aus der Probe ab.

Entfernen Sie abschließend das restliche Hydrogel, indem Sie die Probe auf ein fusselfreies Tuch legen und das Gewebe vorsichtig darauf reiben und rollen, so dass nur eine dünne Schicht polymerisiertes Hydrogel auf der Probe zurückbleibt. Um mit der Lipidentfernung zu beginnen, überführen Sie die polymerisierte Probe in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 45 Millilitern Clearing-Puffer und inkubieren Sie sie sieben Tage lang bei 45 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Wechseln Sie den Puffer während dieser ersten sieben Tage täglich, indem Sie den gebrauchten Räumpuffer in einen Behälter für chemische Abfälle gießen.

Und die Zugabe von 45 Millilitern frischem Clearing-Puffer. Sobald alle Lipide löslich sind und das Gewebe Transparenz erreicht hat, geben Sie die Probe in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 45 Millilitern PBST gefüllt ist, und waschen Sie sie in den nächsten 24 Stunden viermal bei 40 Grad Celsius unter leichtem Schütteln, um SDS-Reste zu entfernen. Nach der abschließenden PBST-Spülung wird die Probe in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter DAPI und 1xPBST gefüllt ist.

Mit Folie umwickeln und 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Tag dreimal in PBST bei Raumtemperatur für mindestens sechs Stunden pro Waschgang waschen. Fahren Sie dann mit dem Brechungsindexabgleich fort.

Um diesen Teil des Verfahrens zu beginnen, überführen Sie die Probe in ein sauberes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 2-2 Thiodiethanol und 1xPBS bei PH 7,5 gefüllt ist, und inkubieren Sie wie auf dem Bildschirm gezeigt. Gegen Ende der zweiten Inkubation erstellen Sie eine Bildgebungskammer, indem Sie ein Stück wiederverwendbaren Klebstoff in einen Zylinder mit einem gleichmäßigen Durchmesser rollen, der nur geringfügig größer ist als die Dicke der Probe. Legen Sie den Zylinder in einem offenen Kreis auf eine 40 Millimeter große Glasbodenschale.

Verwenden Sie dann eine P1000-Pipettenspitze, um eine Abdichtung zwischen dem wiederverwendbaren Klebstoff und dem Glas herzustellen, indem Sie sie um den äußeren Rand des Zylinders rollen. Pipettieren Sie etwa 100 Mikroliter 63 % TDE auf die Glasschale und verteilen Sie es, um die Glasoberfläche innerhalb des Kreises aus wiederverwendbarem Klebstoff zu bedecken. Platzieren Sie die Probe dann mit einem Spatel vorsichtig in der Mitte des Kreises und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden.

Pipettieren Sie anschließend weitere 100 Mikroliter 63 % TDE direkt auf die Probe und legen Sie sofort ein 40 Millimeter großes, kreisförmiges Deckglas über den wiederverwendbaren Klebstoff. Drücken Sie mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände vorsichtig um den Umfang des Kreises, bis das Deckglas die Probe berührt. Bringen Sie nun die Glasbodenschale langsam in eine aufrechte Position, die auf einer Oberfläche anliegt, und fügen Sie dann mit einer Pipette 63 % TDE hinzu, bis die Lösung die kleine Öffnung oben erreicht.

Trocknen Sie die Pipettenspitze mit einem fusselfreien Tuch ab, damit die Lösung nicht auf das Glas tropft. Zum Schluss fügen Sie Silikonelastomer in die kleine Öffnung hinzu, um den Kreis zu umschließen und eine geschlossene Kammer zu schaffen. Warten Sie fünf Minuten, bis es getrocknet ist, und fahren Sie dann mit der Bildgebung fort.

Platzieren Sie die Bildgebungskammer mit der Probe darin auf dem Tisch eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, um den Argon-Anregungslaser einzuschalten, klicken Sie auf die Registerkarte "Konfiguration" oben im Programm und dann auf das Lasersymbol. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Argon, um den Laser mit Strom zu versorgen, und verschieben Sie den Schieberegler auf 30 %Zurück zur Registerkarte "Erfassen" oben.

Wechseln Sie im Feld für die Strahlengangeinstellungen zum Feld für die Einstellung zum Speichern von Lasten und wählen Sie das Dropdown-Menü aus, um den entsprechenden Wellenlängenkanal für die Emission von YFP auszuwählen. Wählen Sie im Feld "Kanaleinstellungen" die entsprechenden Objektive für die Bildgebung aus, indem Sie auf den roten Hyperlink mit der Bezeichnung "Aktuelles Objektivobjekt" klicken. Verwenden Sie Objektive mit einem Arbeitsabstand, der größer ist als die Dicke des Gewebes.

Und eine große numerische Apertur zur Maximierung der Bildauflösung in der Ebene und zur Minimierung der Dicke des optischen Schnitts. Öffnen Sie in der linken Spalte der Dropdown-Menüs das Fenster für die XY-Auflösung, um die Erfassungsmatrix mit dem Namen format auf 1024x1024 oder einen Wert einzustellen, der der lateralen Auflösungsgrenze des Objektivs entspricht. Stellen Sie den Zoomfaktor so niedrig wie möglich ein.

Hier kommt 1.7 zum Einsatz. Legen Sie im selben Fenster die Parameter für den Durchschnitt der achten Zeile und den Durchschnitt eines Frames fest, indem Sie die individuell beschrifteten Menüs entsprechend herunterklappen. Lokalisieren Sie das Sample mit den Steuerelementen auf der Bühne.

Sobald ein repräsentatives Feld sichtbar ist, stellen Sie die Verstärkung auf 760 bis 780 und den Offset auf 1,0 bis 1,5 für YFP ein. Wählen Sie Kachel-Scan aus. Legen Sie dann die obere und untere Grenze des zu erfassenden Z-Stacks fest.

Stellen Sie die Dicke des optischen Abschnitts basierend auf der Auflösungsgrenze des optischen Abschnitts des Objektivs ein und starten Sie dann die Erfassung. Dieses Bild zeigt YFP-positive Neuronen in der Großhirnrinde und im Hippocampus, die mit 5-facher Vergrößerung abgebildet und in 3D rekonstruiert wurden. Der Maßstabsbalken stellt einen Millimeter dar.

Diese maximale Intensitätsprojektion eines 10-fachen Bildstapels der Großhirnrinde demonstriert die dendritische Aborisation der fünf pyramidalen Neuronen der kortikalen Schicht. Hier stellt der Maßstabsbalken 100 Mikrometer dar. Hier wird die THY-1YFP-Expression in einem intakten zervikalen und thorakalen Rückenmark gezeigt, mit 5-facher Vergrößerung abgebildet und in 3D rekonstruiert.

Der Maßstabsbalken stellt zwei Millimeter dar. Schließlich zeigt diese maximale Intensitätsprojektion eines 10x abgebildeten Stapels des Rückenmarks einzelne Axone, Maßstabsbalken repräsentieren 100 Mikrometer. Bei richtiger Durchführung kann diese Technik in zwei bis vier Wochen für das gesamte Rückenmark und in vier bis sechs Wochen für hemisezierte Gehirne durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. die immunhistostizische Chemie, vorgeformt werden, um Fragen zu beantworten, die eine komplexere biochemische Phänotypisierung erfordern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das zentrale Nervensystem einer Maus optisch abbildet und abbildet. Mit passiver Klarheit und konfokaler Lasermikroskopie.