Optische Klärung und Markierung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie in der großflächigen Bildgebung des menschlichen Gehirns
26. Januar 2024
Das vorliegende Protokoll bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die schnelle und gleichzeitige optische Reinigung, die Multi-Round-Markierung und die volumetrische 3D-Rekonstruktion von Dutzenden von postmortalen menschlichen Hirnschnitten durch die Kombination der (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT-Gewebetransformationstechnik mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung in einem routinemäßigen Hochdurchsatzprotokoll.
Das menschliche Gehirn ist ein komplexes Organ, das verschiedene Fähigkeiten umfasst. Um seine Funktionsweise zu verstehen, ist es wichtig, eine detaillierte Zellsensorik über das gesamte Gehirn hinweg zu konstruieren. Unser routinemäßiges Hochdurchsatzprotokoll ermöglicht die Analyse der 3D-Zytoarchitektur von volumetrischen Bereichen des menschlichen Gehirns mit Mikrometerauflösung und ermöglicht so die strukturelle Charakterisierung.
Die volumetrische Rekonstruktion großer Bereiche des menschlichen Gehirns stellt mehrere experimentelle Herausforderungen dar, die mit den massiven Abmessungen der Gehirnproben, der komplexen biologischen Zusammensetzung, den variablen postmortalen Fixierungs- und Lagerbedingungen und den autofluoreszierenden Signalen von lipofuszinartigen Pigmenten zusammenhängen. All dies kann die optische Reinigungseffizienz und die Demonstrationsqualität beeinträchtigen. Im Vergleich zu anderen Clearing-Techniken kann die Kurzgewebstransformationsmethode in Kombination mit der Lichtblattmikroskopie für die schnelle und gleichzeitige Verarbeitung mehrerer menschlicher Hirnschnitte verwendet werden.
Diese führen zu einer 3D-Gehirnrekonstruktion mit subzellulärer Auflösung.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Hochdurchsatzprotokoll für die simultane optische Klärung, mehrfache Markierung und 3D-volumetrische Rekonstruktion von postmortalen menschlichen Hirnschnitten vor. Durch die Kombination der S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-Thiodiethanol (TDE) SHORT-Technik mit der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Methodik eine detaillierte strukturelle Charakterisierung mit mikrometergenauer Auflösung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Histologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Das menschliche Gehirn ist ein komplexes Organ, das eine detaillierte Untersuchung auf unterschiedlichen Maßstäben erfordert.
- Zu den Herausforderungen gehören die Handhabung großer Gehirnproben und autofluoreszierende Signale von Pigmenten.
- Das vorgestellte Protokoll behebt Mängel bestehender Klärtechniken.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines optimierten Protokolls zur Analyse der Struktur des menschlichen Gehirns.
- Verbesserung der optischen Klärungseffizienz und der Bildqualität von Gehirngewebeschnitten.
- Möglichmachung der 3D-Rekonstruktion mit hoher Detailgenauigkeit und Zuverlässigkeit.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie.
- Menschliches Gehirngewebe dient als biologisches Modell, wobei detaillierte Schritte zur Schnittführung und Aufbereitung beschrieben werden.
- Zu den wichtigsten Schritten gehören das Einbetten der Proben in Agarose, die Behandlung mit TDE und die mehrfache Immunfärbung für verschiedene neuronale Marker.
- Die Inkubationszeiten und -temperaturen sind genau festgelegt, um optimale Bedingungen für die Klärung und Bildgebung zu gewährleisten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll führt zu einer effektiven optischen Klärung und hochwertigen Abbildung von grauer und weißer Substanz.
- Mehrstufige Färbungen ermöglichen die Visualisierung unterschiedlicher neuronaler Populationen in menschlichen Gehirnschnitten.
- Die Methode zeigt die Fähigkeit, subzelluläre Details in 3D-Rekonstruktionen darzustellen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine Methode zur umfassenden Analyse der Gehirnstruktur mit mikrometergenauer Auflösung vor.
- Der Ansatz unterstreicht das Potenzial, unser Verständnis der Gehirnarchitektur und deren Auswirkungen auf neuronale Untersuchungen voranzubringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die großflächige, hochauflösende 3D-Bildgebung von menschlichem Hirngewebe ist entscheidend für die Weiterentwicklung der Zielstrukturenvalidierung und des mechanistischen Verständnisses in der neuropharmazeutischen Forschung und Entwicklung&D. Das SHORT-Protokoll in Kombination mit der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine schnelle, multiplexe strukturelle Abbildung neuronaler Subpopulationen sowohl in der grauen als auch in der weißen Substanz. Diese Fähigkeit unterstützt die Vorhersagegenauigkeit und Risikominimierung zu frühen Zeitpunkten der Entdeckungsforschung und translationalen Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung&D
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuronalen Architektur und die Abbildung von Subpopulationen zur Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem sie den zytoarchitektonischen Kontext im menschlichen Hirngewebe aufdeckt.
- Erleichtert die Portfolio-Priorisierung durch die Bereitstellung quantitativer struktureller Daten mit hohem Informationsgehalt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet optisch geklärte, mehrfach markierte Gewebeschnitte auf, die für nachgeschaltete quantitative Bildgebungsworkflows geeignet sind.
- Standardisiert die Probenvorbereitung für reproduzierbare, hochdurchsatzfähige Bildgebung und Analyse.
- Ermöglicht die multiplexe Detektion neuronaler Marker und unterstützt die Entwicklung robuster Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt strukturelle Bildgebungsdaten in Bezug zur krankheitsrelevanten Architektur des menschlichen Gehirns.
- Ermöglicht eine lückenlose Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch direkte Analyse menschlichen Gewebes.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung mit umfassenden 3D-Zytoarchitekturdaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem es die hochdurchsatzfähige, quantitative Bildgebung menschlicher Gehirnschnitte für die Zielvalidierung und mechanistische Untersuchungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch detaillierte neuronale Abbildung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, mehrfach nutzbare, bildgebungstaugliche Proben für die quantitative Analyse.
- Analytik: Stellt Daten mit Mehrkanalfähigkeit und subzellulärer Auflösung für den vergleichenden Bedingungsvergleich bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet Grundlagenforschung und präklinische Arbeiten durch direkte Relevanz für menschliches Gewebe.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen skalierbaren, standardisierten Arbeitsablauf für die mehrfache Nutzung in neurobiologischen Programmen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung neurobiologischer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Gewebeverarbeitung und Bildgebung.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Neuropharma-Arbeitsstoffen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebeaufbereitung, Immunmarkierung und fortgeschrittener Mikroskopie.
- Setzt Zugang zu Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie und Mehrkanal-Bildgebungstechnologie voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Probenvorbereitung und Bildgebung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann je nach Gehirnregion oder Gewebeszustand Anpassungen erfordern.
- Die Handhabung der Proben sowie Inkubationsparameter müssen streng kontrolliert werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
