ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das gereinigte, intakte Gewebe zu gewinnen und seine dreidimensionale molekulare Information mit Hilfe von Immunmarkierungsmethoden sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Neurowissenschaften und der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. neuronale Verbindungen, molekulare Kategorisierung und strukturelle Veränderungen während der Entwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Gewebe eine Analyse großer Proben auf subzellulärer Ebene ohne Schnitte ermöglicht.

Um dieses Verfahren zu beginnen, inkubieren Sie die fixierten Organe in A4P0 Hydrogel-Monomerlösung bei vier Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden unter leichtem Schütteln. Geben Sie danach fünf Milliliter Hydrogel-Monomerlösung in ein 10-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Übertragen Sie dann die Mausgehirnprobe darauf und umwickeln Sie die Oberseite des Röhrchens mit Parafilm.

Als nächstes blasen Sie Stickstoff eine Minute lang mit der Hydrogel-infundierten Gehirnprobe durch die Flüssigkeit. Verschließen Sie das Probenröhrchen schnell und fest. Übertragen Sie den Schlauch für zwei Stunden in ein Wasserbad.

Überprüfen Sie danach die Viskosität des Hydrogels und waschen Sie die polymerisierte Probe dann kurz mit 0,1 X PBS, um überschüssiges Hydrogel zu entfernen. Übertragen Sie in diesem Schritt die polymerisierte Probe in einen Gewebebehälter. Und stellen Sie den Gewebebehälter in die ETC-Kammer.

Füllen Sie anschließend die ETC-Kammer mit einer Schlauchpumpe mit ETC-Puffer. Legen Sie die ETC-Bedingungen fest und schalten Sie sie ein. Ein bis zwei Millimeter dicke Hirnschnitte werden innerhalb von zwei Stunden mit geräumt.

Und ein ganzes Gehirn ist innerhalb von fünf bis sechs Stunden ausreichend frei. Anschließend wird die Probe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 45 Millilitern 0,1 x PBS überführt. Waschen Sie die Probe mehrmals mit 0,1 x PBS, bis beim kurzen Schütteln des Röhrchens keine Blasen mehr zu sehen sind, um die vollständige Entfernung von SDS zu bestätigen.

Um c-PRERSTO durchzuführen, geben Sie eine kleine Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von eins bis 500 für Kollagen-Antikörper vom Typ 4 hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Stunden lang bei 600-mal g. Danach waschen Sie die gefärbte Probe mit 0,1 X PBS durch Zentrifugation bei 600 mal g für 30 Minuten.

Geben Sie dann 500 Mikroliter Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von eins bis 500 für den Cy3-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper hinzu und zentrifugieren Sie ihn zwei Stunden lang 600-mal g. Anschließend wird die gefärbte Probe 30 Minuten lang mit 0,1 x PBS durch Zentrifugation bei 600 mal g gewaschen. Um s-PRESTO für größeres Gewebe durchzuführen, überführen Sie die Probe in eine mit einem Dreiwegeventil verbundene Spritze in der geschlossenen Ventilstellung.

Geben Sie fünf bis sieben Milliliter Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von eins bis 500 für Kollagen-Typ-4-Antikörper hinzu. Geben Sie anschließend die Antikörperlösung in die Probe, indem Sie das Ventil öffnen. Stellen Sie anschließend den Kolben der Spritze in die Position 17 Milliliter, um genügend Platz für die Entnahmebewegung der Infusion zu haben.

Schließen Sie dann das Dreiwegeventil, nachdem die Spritzeneinstellung abgeschlossen ist. Legen Sie die Spritze mit der Probe auf eine Spritzenpumpe. Stellen Sie die Bedingungen für die Spritzenpumpe auf ein Infusionsentnahmevolumen von zehn Millilitern pro Minute und eine Pause von vier Minuten im kontinuierlichen Zyklusmodus ein.

Lassen Sie die Spritzenpumpe anschließend drei bis 24 Stunden lang bei Raumtemperatur laufen. Öffnen Sie anschließend das Dreiwegeventil und ersetzen Sie die Lösung durch 0,1 X PBS. Waschen Sie die verschmutzte Probe zweimal jeweils eine Stunde lang mit 0,1 x PBS mit der Spritzenpumpe.

Ersetzen Sie dann PBS durch die Antikörperverdünnungslösung, die den konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper Cy3 enthält, und lassen Sie die Spritzenpumpe drei bis 24 Stunden lang laufen. Öffnen Sie anschließend das Dreiwegeventil und ersetzen Sie die Lösung durch 0,1 X PBS. Vor der Bildgebung wird die gefärbte Probe in einer geeigneten Menge kubischer Eindecklösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert.

Ersetzen Sie die Lösung nach einer Stunde durch frische kubische Einbettlösung und inkubieren Sie eine weitere Stunde lang. Da Antikörper nicht durch Diffusion in dichtes Gewebe eindringen können, sind die PRESTO Immunmarkierungsmethoden darauf ausgelegt, Makromoleküle aktiv zu infundieren und Reagenzien in dichtes Gewebe zu bringen. Das Aufbringen von Zentrifugalkräften mit einer Standard-Tischzentrifuge erleichterte die Abgabe von Antikörpern deutlich.

Die Anwendung der Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe verbesserte auch die Penetration der Antikörper. Für s-PRERSTO wurde eine Spritzenpumpe verwendet, um die Antikörper zu verabreichen. Die Organe der Maus, wie Nieren und Leber, wurden mit Kollagen Typ 4 markiert.

Im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden erhöht sich die Markierungstiefe durch drei Stunden c oder s-PRESTO deutlich. In Niere und Leber erreicht die Tiefe der z-Achse bei PRESTO Proben 300 bis 350 Mikrometer oder tiefer, während Kontrollproben nur in einer Tiefe von 40 bis 50 Mikrometern markiert werden. Einmal gemeistert, können diese Techniken an einem Tag für das Gewebe eindeutig durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zeit für die Gewebefixierung der Hydrogel-Monomer-Emulsion und des elektrophoretischen Gewebes klar zu halten. Im Anschluss an das Verfahren können weitere Methoden wie die Immunmarkierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Analyse der zellulären Dynamik und die Identifizierung einer neuronalen Pfanne über mehrere Organe hinweg zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der medizinischen Wissenschaft, um die Diagnose von Krankheiten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hydrogel-Einbettung und Gewebepolymerisation durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Hydrogel-Monomerlösung äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.