Name: Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung synthetischer Polymere mittels MALDI-TOF-MS für die Polymerchemie. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung von Molekulargewicht, Dispersität und Endgruppenidentität mit hoher Genauigkeit.

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Die Autoren erkennen, dass das intelligente Materialien Design, Analyse und Verarbeitung Consortium (SMATDAP) von der National Science Foundation unter Kooperationsvertrag IIA-1430280 und das LA-Board of Regents für ein graduate Fellowship (MEP) finanziert. Polymerproben für diese Experimente wurden durch MilliporeSigma (Sigma-Aldrich) zur Verfügung gestellt.  Open-Access-Publikation dieses Artikels wird von MilliporeSigma gesponsert.

Achtung: Alle Reaktionen wurden in einer Dampfhaube ausgeführt. Bitte lesen Sie alle Material Sicherheit Data Sheets (MSDS) für jede chemische verwendet und entsprechende Vorkehrungen zu treffen.
1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Herstellung von Stammlösungen der matrix<ol>
<li>Lösen Sie 20 mg α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (HCCA auf) in 1 mL Tetrahydrofuran-nicht stabilisierten (THF) und Vortex bis aufgelöst.</li>
		<li>Lösen Sie 20 mg 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB auf) in 1 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Vorratslösung Alkali kation<ol>
<li>Lösen Sie 2 mg Natrium Trifluoroacetate (NaTFA) in 1 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
		<li>Lösen Sie 2 mg Kalium Trifluoroacetate (KTFA) in 1 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung des Analyten Stammlösungen<ol>
<li>Beispiel 1: 2 mg von Poly (Ethylenglycol) 2-Aminoethyl Äther Essigsäure auflösen (Mn = 5000) in 0,5 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
		<li>Beispiel 2: 2 mg Polyoxyethylen bis(azide) auflösen (Mn = 2000) in 0,5 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
		<li>Beispiel 3: Auflösen 2 mg poly(L-lactide), Thiol beendet (Mn = 2500) in 0,5 mL THF und Vortex bis aufgelöst.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Probe Mischungen für die Analyse<ol>
<li>Bereiten Sie eine Reihe von Lösungen durch Mischen von Matrix, Analyt und kation Lösung während die relativen Anteile der Komponenten variieren, so dass neun einzigartige Samples Mischungen hergestellt werden. Beispielsweise die Höhe der zusätzlichen Matrix Stammlösung konstant zu halten (zB., 10 µL), variieren Sie die Menge des Analyten Lösung um den Faktor drei (zB., 45, 15 und 5 µL), während auch die Menge der kationen-Lösung um den Faktor drei unterschiedliche (z.B. ., 9, 3 und 1 µL). Diese Proben liefern effektiv ein 3 x 3-Raster von Proben mit den beiden unterschiedlichen Konzentration Variablen auf den x- und y Achsen (Abbildung 1).</li>
		<li>Kombinieren Sie für das repräsentative Beispiel 15 µL der poly(L-lactide) Lösung mit 15 µL der DHB-Lösung und 1 µL der NaTFA Lösung.</li>
		<li>Pipette 1 μL jeder Lösung Mischung auf eine einzelne Probe auf die MALDI-Zieltafel (Abbildung 2). Fügen Sie die Proben inkrementell in kleinen Portionen zu verhindern, dass die Probe fließt aus dem Probe-Brunnen, so dass jedes aliquoten zu Trockenheit verdunsten kann, bevor zusätzliche Probe hinzufügen. Hinweis: Für höhere Siedepunkt Lösungsmittel eine Druckluftpistole Lösungsmittel Verdunstung beschleunigen eventuell aber Vorsicht verwendet werden sollten, um zu vermeiden, die Probe Heizplatte, die Platte zu verwerfen verursachen könnten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Standardproben zur Kalibrierung<ol>
<li>Bereiten Sie die Kalibrierstandards über das vorgeschlagene Lieferanten-Protokoll. Hinweis: Dendrimer Kalibrierstandards wurden für diese Studie ausgewählt und stehen als die reine Dendrimere oder Mischfinanzierung mit Matrix, Kalibrator und kation bei optimalen Verhältnissen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) die Übernahme Datenoptimierung
<ol><li>Initiierende Datenerfassung<ol>
<li>Datenerfassungs-Software "FlexControl" zu öffnen.</li>
		<li>Werfen Sie die Plattform, um das Laden von der Zieltafel aktivieren Sie durch Drücken der "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">" Taste.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig die Zieltafel mit den geladenen Kalibrator und Analyten Proben auf der Plattform in der entsprechenden Ausrichtung.</li>
		<li>Verwenden die Software zur Datenerfassung um zu injizieren die Zieltafel auf der Plattform durch Drücken der "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">"-Taste noch einmal.</li>
		<li>Wählen Sie eine geeignete Daten Erwerbsmethode (positiv Mode Erwerbsmethode) durch Drücken der Datei | Wählen Sie die Methode. Hinweis: Für die meisten Polymerproben, einschließlich unserer vertretenden Analyten Ionisation soll über Komplexierung mit einem kation und daher eine positive Modus Erwerbsmethode ist am besten geeignet. Je nach Instrument, für geringere Masse reicht (500-10.000 Da) oder wenn höherer Auflösung gewünscht ist wählen Sie eine Reflektor Modus Methode Datei. Für höheren Molekulargewicht Proben oder wenn höhere Signalempfindlichkeit brauchten, und niedriger Auflösung ist akzeptabel, linearmodus Methode Datei auswählen.</li>
		<li>Vor dem Importieren von Daten, stellen Sie sicher, eine geeignete Massenbereich für die Datenerhebung ist ausgewählt-im Idealfall Massenbereich Hälfte der niedrigsten Masse in der zu erwartenden Verteilung sowie doppelte der höchsten Masse in der zu erwartenden Verteilung enthalten wird. Überprüfen Sie dies durch Klicken auf die Registerkarte " Erkennung " und Masse Bereichanzeigen. Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass Signal vom unteren Molekulargewicht Abbau Fragmente oder höheren Molekulargewicht Aggregate (Dimer), die möglicherweise in der Probe vorhanden sind in den Daten enthalten. Beachten Sie, dass Matrix Oligomere häufig mit hohen Signalintensitäten in den meisten MALDI-TOF-Massenspektren, Bereitstellung von hoher Intensität Lärm mit einer Masse bis zu 1.000 Da, erschwerende Analyse unterhalb dieser Masse wahrgenommen werden. Obwohl die Kalibrierung erforderlich sein wird, bevor eine endgültige DataSet zu erhalten, kann eine genaue Kalibrierung Datei nur erworben werden, wenn identische Aufnahmeparameter wie optimiert für den bestimmten Analyten eingesetzt werden. Daher ist eine vorläufige Optimierung der Analyten Massenspektrum vor der Kalibrierung, gefolgt von den hochschlag einer kalibrierten Analyten Massenspektrum erforderlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorläufige Datenerfassung<ol>
<li>Die Software zur Datenerfassung wählen Sie die Position auf der Zielplatte, die den gewünschten Analyten entspricht.</li>
		<li>Erhebung von Daten während der Bewegung der Laser Ziel um die Probe um das Signal zu maximieren zu initiieren. Klicken Sie auf Start, um die Datensammlung zu starten. Hinweis: Der Laser kann Matrix an einer bestimmten Stelle nach der wiederholten Probenahme erschöpfen.</li>
		<li>Verwenden den Schieberegler auf der linken Seite des Kamerafensters, die Laserleistung passen Sie an, dass die minimale Leistung erforderlichen isotopischen Auflösung erreicht erreicht ist. Hinweis: Bei der Analyse der mehrfachen Proben bestätigen das optimale Verhältnis von Analyten, kation und Matrix verwenden Sie die gleichen Laserleistung auf jeder der Analyten Proben um zu bestimmen, welche Probe zeigt die besten Signal-/Rauschverhältnis für die Aufnahmeparameter. Weiter zukünftigen Erwerb Optimierung mit der Probe, die angezeigt wird, das beste Signal Rauschabstand auszustellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Akquisition Datenoptimierung<ol>
<li>Zoomen auf eine einzelne Spitze in der Mitte der Massenbereich von Interesse, die Auflösung durch die Anpassung des Unterschied in der Beschleunigung Spannungen optimieren (für die Instrumente in dieser Studie, dies umfasst das Anpassen des Werts "IS2"), die in den Spektrometer ist Registerkarte ". Hinweis: Dies ist am schnellsten durch Variation den IS2 Wert in großen Schritten, Kenntnis nehmend von dem Wert die beste Auflösung erzeugt optimiert (i.e., die kleinste voll Spitze Breite am halben maximale Signalstärke), und dann weiter zu optimieren, in kleineren Schritten der Der IS2 Wert. In der Regel ist der optimale IS2 Wert höher (näher an IS1) für niedrige Masse Polymere und unteren für Hochpolymere Masse.</li>
		<li>Auf Wunsch erhöhen Sie Auflösung mit reflektron Modus. Hinweis: Reflektron Modus ermöglicht die Kompensation der Diskrepanzen in Anfangsgeschwindigkeit von Ionen der gleichen m/Z durch die höhere Geschwindigkeit-Ionen mit dem gleichen m/Z -Wert in einen längeren Weg zum Detektor zu zwingen. Dieser Anstieg der Weg zum Detektor kann langsamer Ionen der gleichen m/Z -Wert gleichzeitig, am Detektor ankommen effektiv Konzentration der Ionen für höhere Auflösung. Obwohl reflektron Modus in der Regel die Signal-Auflösung für Proben mit schwachen Signalintensität verbessert kann linearmodus erforderlich sein, um die Daten zu visualisieren.</li>
		<li>Schließlich optimieren die Laserleistung durch die Reduzierung der Laserleistung so gering wie möglich beim Generieren noch eine vernünftige Signal Rauschabstand (zB., Signal-Rauschabstand von etwa 10). Hinweis: Da in der Regel höhere Laserleistungen verringern Sie die Auflösung und Fragmentierung auslösen können, sind der Massenspektren mit bester Qualität erworben mit reduzierter Laserleistung, aber eine höhere Anzahl von Scans.</li>
		<li>Sobald die Aufnahmeparameter optimiert sind, sparen Sie unkalibrierten Massenspektren Auswahl Datei und dann Speichern Spektrum auf Speichern unter. Für externe Kalibrierung muss eine Neuanschaffung der Kalibrator unter diesen identisch, optimierten Parametern durchgeführt werden bevor eine Neuanschaffung initiiert wird, um die kalibrierten Massenspektrum des Analyten zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) MALDI-Kalibrierung
<ol><li>Erwerb der Kalibrierung Massenspektrum<ol>
<li>Erwerben Sie mit Hilfe der Aufnahmeparameter bereits für den Analyten optimiert, eine optimierte Massenspektrum der Stichprobe von massenormale. Hinweis: Im Idealfall sollte die Kalibrations-Set eine Norm über dem Bereich von Interesse, eine unten und mindestens im Bereich von Interesse enthalten. Die Genauigkeit der Kalibrierung ist am besten, wenn alle Aufnahmeparameter für beide Proben identisch sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen Sie eine Kalibrierung Datei<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass vorhandene Kalibrierung ist ungültig oder tab in der Lage, durch Drücken der Kalibrierung ungültig unter dem Spektrometer überschrieben werden.</li>
		<li>Mit der gleichen Aufnahmeparameter (zB., Laserleistung, IS2 Spannung), bewegen Sie den Laser über zum Beispiel Brunnen mit den Kalibrator (zB., Dendrimer standard, Peptid) durch Auswahl der entsprechenden nun mit dem Cursor und erwerben ein Spektrum durch Drücken der Taste starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald genügendes Signal erfasst wurde, drücken Sie starten , beenden, Erfassung von Daten.</li>
	<li>Sobald ein Massenspektrum der Kalibrator erworben hat, wählen Sie das Mass Control List Dropdown-Menü in der Registerkarte " Kalibrierung ", die die Kalibrierung standard entspricht. Die entsprechenden Masse Kontrollliste wird Referenz Massen der Kalibrator mit dem entsprechenden kation ausgewählt haben. Hinweis: Diese sollte ab der Kalibrator Lieferant, und achten Sie darauf, die Monoisotopic Masse Werte bei Isotopen Auflösung erreicht ist (zB., Reflektor-Modus unter m/Z = 5000), und eine durchschnittliche Masse Werte bei Isotopen Auflösung nicht erreicht werden kann (z.B., linearen Modus oben m/Z = 5000),</li>
	<li>Vor dem Abgleich der entsprechenden Referenz-Gipfel zum jeweils ausgewählten Kalibrator-Gipfel, sicherzustellen, dass eine angemessene Spitze Kommissionierung Protokoll verwendet wird, wählen Sie die Registerkarte " Bearbeiten ". Hinweis: Peak Picking Protokolle von spektrale Auflösung abhängig. Für eine durchschnittliche Masse Berechnung dauert die Software den Masse Durchschnitt über die gesamte Reihe von Isotopen Gipfeln. Für eine Monoisotopic Masse Berechnung sollte die Software festgelegt werden, um die genauen Masse nur die erste isotopischen Spitze zu berechnen.</li>
	<li>Wenden Sie die Bezugsmasse aus der Massenkontrolle-Liste auf das entsprechende Signal für den Kalibrator Massenspektrum indem Sie den Bereich links von der Spitze des Interesses auswählen und klicken Sie dann auf die entsprechende Masse in der Liste anwenden an. Weiter den Vorgang für die restlichen Kalibrator-Gipfel. Hinweis: Für die genaue und präzise Kalibrierung, legen Sie die Analyten und Kalibrator Proben möglichst nah beieinander auf die Zieltafel, da subtile Variationen in Ziel Traufhöhe die Genauigkeit der Kalibrierung beeinflussen können.</li>
	<li>Zurückzukaufen Sie das Spektrum des Analyten, sobald der Massenskala für die optimierte Aufnahmeparameter kalibriert.</li>
</ol>(4) Daten-Analyse und Interpretation
<ol><li>Peak-Kommissionierung<ol>
<li>Öffnen Sie das Analyt-Spektrum in der Daten-Analyse-Software (FlexAnalysis).</li>
		<li>Vergrößern Sie auf einem Gipfel zu identifizieren, wenn isotopischen Auflösung erreicht worden ist, durch Klicken auf die Schaltfläche X-Bereich vergrößern .</li>
		<li>Drücken Sie Masse List | Finden Gipfel auswählen. Wenn der Monoisotopic Berg gelöst ist, wählen Sie dieses ersten Peak in der isotopischen Verteilung die Masse mit einem Monoisotopic Peak-Kommissionierung Protokoll bestimmen. Wenn Monoisotopic Gipfel nicht behoben wird, verwenden Sie eine durchschnittliche Masse Gipfel Kommissionierung Protokoll und bestimmen Sie die durchschnittliche Masse der gesamten isotopischen Verteilung.</li>
		<li>Dieser Prozess für jedes n-Mer in der Polymer-Distribution Kommissionierung Gipfel weiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Polymer-Charakterisierung und Ende Gruppe-Analyse-Berechnungen Hinweis: Bei richtiger Anwendung bieten MALDI-TOF MS wertvolle, genaue Daten für Massenverteilung Berechnungen von Polymeren. Es sei darauf hingewiesen, dass Massenverteilung Daten nur korrekt ist, wenn die Dispersität der Polymer-Probe relativ niedrig ist (zB., etwa Đ= 1.3 oder unten).<ol>
<li>Berechnen Sie die Anzahl mittlere Molekulargewicht, die Masse Durchschnitt in Bezug auf die Anzahl der Mole jedes Massenanteil, mit Hilfe der Formel: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq2v2.jpg"> wo Nich = Anzahl der Moleküle einer bestimmten Molekulargewicht und Mich = spezifische Molekulargewicht von diesen Molekülen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Gewicht mittlere Molekulargewicht, die Masse Durchschnitt in Bezug auf das Gewicht jedes Massenanteil, mit Hilfe der Formel: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq3v2.jpg"> wo N ich = Anzahl der Moleküle einer bestimmten Molekulargewicht und M ich = spezifische Molekulargewicht von diesen Molekülen.</li>
		<li>Nachdem die Mw und Mn ausgerechnet quantifizieren Sie die Breite der Molmassenverteilung mit dem Verhältnis Mw/mn die Dispersität, Đgenannt wird.</li>
		<li>Die einzigartige und leistungsstarke Funktion der MALDI-TOF MS-Datenanalyse ist die Fähigkeit zu bestimmen oder zu bestätigen die Endgruppen Homopolymere. Bestimmen der Endgruppe durch die folgende Formel für die beobachteten Masse von einem n-Mer im Massenspektrum (Mn-Mer) umstellen: Mn-Mer = n (MRU ) + MEG1 + MEG2 MIon wo n = Grad der Polymerisation, MEG1 = Masse des α-Endgruppe MEG2 = Masse des Arbeitskreises ω-Ende M-RU = Masse des Referats Wiederholung des Polymers, und MIon = Masse des Ions, dass komplexe mit dem Polymer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben finanzielle Interessen im Zusammenhang mit der kugelförmigen Kalibrierstandards, die in dieser Studie verwendet.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist ein unschätzbares analytisches Werkzeug für Polymer Charakterisierung wegen seiner Fähigkeit, Polymer-Ionen in die einzeln geladenen Zustand und mit minimalen Fragmentierung zu generieren. Diese weiche Ionisierung-Technik nutzt kurze Laserpulse um desorbieren Solid-State-Proben des Polymer Analyten eingebettet in einer Matrix zusammengesetzten Polymer-Ionen in der Gasphase zu generieren. Die Makromoleküle sind in der Regel durch Komplexierung mit Kationen ionisiert, die Matrix zu ermöglichen, ihre Analyse durch Massenspektrometrie hinzugefügt werden. Diese makromolekularen Ionen werden dann durch eine Extraktion Spannung zu bringen in den Feldfreien Bereich des Flug-Rohr die ihre m/Z zu bestimmenden ermöglichen können anhand ihrer Flugzeit zwischen der Ionenquelle und der Detektor5 beschleunigt , 32.
Im Vergleich zu anderen Polymer Charakterisierung, hängt MALDI-TOF MS Spektren Qualität stark von Daten Aufnahmeparameter und Probenvorbereitung. Zwar gibt es keine festgelegten Formel für die Probenvorbereitung, ermöglicht Verständnis der Funktion der einzelnen Komponenten der Probenvorbereitung für eine schnellere empirische Optimierung. Der wichtigste Faktor bei der MALDI-Probenvorbereitung ist Auswahl der Matrix, weil Kompatibilität der Matrix mit der Polymer-Analyt entscheidend ist dafür, dass aufgeregt Matrix, single, bierten Makromoleküle in einen ionisierten Zustand5zu generieren, 15,17,19. Sobald entsprechende Matrix und Cationization Agenten ausgewählt wurden, muss das richtige Verhältnis von Analyten, Matrix und Cationization Agent bestimmt werden. Dies kann erreicht werden, indem man empirisch ein zweidimensionales Raster von Proben (Abbildung 1) auf die MALDI-TOF MS Zieltafel (Abbildung 2) mit steigender Konzentration der Matrix auf einer Achse und zunehmende Cationization Agent Konzentration auf die andere.
Ähnlich wie bei MALDI Probenvorbereitung, gibt es keine festgelegten Formel zur Bestimmung der Aufnahmeparameter Daten; Allerdings sollten bestimmte Trends anzusehen spektrale Optimierung beschleunigen. Reflektron Modus, die Auflösung erhöht, sondern verringert sich insgesamt Signal, wird in der Regel für geringere Masse reicht (in diesen Beispielen unter 4.000 Da) gewählt, wo isotopischen Auflösung erreicht werden kann. In diesen Fällen wurden Monoisotopic Massenberechnungen und Peak picking Methoden verwendet. Für Polymerproben mit Massen über 4.000 Da wurde linearmodus mit durchschnittlichen Massenberechnungen und peaking Kommissionierung Methoden verwendet. Um Signal Auflösung zu verbessern, sollte die Ion-Source-Spannungen in kleinen Schritten mit dem allgemeinen Trend der größeren Masse Polymere mit einer größeren Spannung differenzielle angepasst werden (IS1 versus IS2).
Weile optimierte Probenvorbereitung und Erwerb Parameter bieten Präzision, Massengenauigkeit kann nur durch wirksame Kalibrierung erreicht werden. Die Flugzeit für eine gegebene Masse kann subtil in Bezug auf die Variable Aufnahmeparameter und sogar Platte Positionen variieren, daher eine Kalibrierung sollte durchgeführt werden für jeden Satz der optimierten Aufnahmeparameter um genaue Masse zu erzielen Bestimmungen5,30. Sobald die Aufnahmeparameter und Probenvorbereitung optimiert wurden, sollten die Spektren mit diesen genauen Bedingungen kalibriert werden.
Aufgrund der außergewöhnlichen Auflösung und Massengenauigkeit verzeichneten die optimierte MALDI-TOF-Massenspektren von Polymeren ist diese Technik ein wertvolles kostenloses Werkzeug zur Bestimmung Polymer Massenverteilung Daten geworden. Doch seine Fähigkeit, einzelne Wiederholung Einheiten innerhalb der Massenverteilung Polymer zu lösen bietet einen besonderen Vorteil für Ende Gruppenanalyse im Vergleich zu anderen Polymer Charakterisierung Techniken wie Gel Permeation Chromatographie (GPC) und nukleare Kernspinresonanz (NMR). Dies ist besonders nützlich für die Bestimmung der Treue Ende Gruppe Funktionalisierung Reaktionen und quantitativer Art Ende Gruppe Konjugationen Reaktionen. Diese Handschrift zeigte die Fähigkeit, die Masse der einzelnen Polymer wiederholen Einheiten mit bis zu zwei Dezimalstellen Massengenauigkeit ermöglicht die Bestätigung der Ende Gruppe Änderungen mit einem hohen Maß an Vertrauen zu lösen. Mit der erheblichen Fortschritte, die kürzlich im Bereich der Präzision Polymersynthese vorgenommen wurden, MALDI-TOF-MS wird ein zunehmend wichtiges Werkzeug für Makromolekulare Struktur und Funktionalität zu bestimmen.

Mit Verbesserungen in der lebenden Polymerisation Techniken, Präzision Polymere mit quantitativ funktionalisierten Endgruppen sind immer verfügbar1. Die gleichzeitige Entwicklung von azid-Alkinen und Thiolene klicken Sie Chemikalien ermöglichte die nahezu quantitative Kopplung von Makromolekülen zu anderen Moieties, den Zugang zu einer Reihe von Hybriden Materialien2,3,4 . Präzise analytischen Techniken sind jedoch erforderlich, um sowohl die Ausgangs- und Produkte dieser Polymer Konjugation Reaktionen zu charakterisieren. Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ist ein wertvolle weiche Ionisierung analytische Verfahren zur Charakterisierung von Polymeren weil es Polymer-Ionen in einem einzigen Ladevorgang Zustand mit minimalen erzeugen kann Fragmentierung5,6. MALDI-TOF MS hat wesentliche Vorteile gegenüber anderen konventionellen Methoden der Polymer-Charakterisierung, weil es Massenspektren mit Auflösung des einzelnen n-Mers innerhalb der Massenverteilung Polymer zur Verfügung stellen kann. Infolgedessen können solche Massenspektren liefern präzise Informationen über das mittlere Molekulargewicht, wiederholen Masseeinheit und Molekulargewicht Dispersität7, die wiederum zu konkurrierenden Polymerisation Mechanismen wie Kette Transfer8 erhellen können . MALDI-TOF MS ist besonders kraftvoll auf die Bereitstellung von Informationen über Polymer Ende Gruppen9,10, die verwendet werden können, um Ende Gruppe Änderungen10,11 bestätigen und andere Transformationen12 wie Polymer Cyclizations11,13. Ebenso wichtig, die relativ kleine Menge Analyt (Sub-Mikrogramm) für erforderlich Masse spektrometrische Analyse macht diese Technik nützlich für die Charakterisierung, wenn nur Spur Mengen des Materials zur Verfügung stehen.
Die MALDI-TOF MS-Analyse von Polymeren kann vier verschiedene Schritte unterteilt werden: Vorbereitung, Kalibrierung, spektralen Erwerb und Datenanalyse zu probieren. Probenvorbereitung ist der wichtigste Schritt zur Erzeugung von MALDI-TOF Massenspektren optimiert und tritt ein, bevor die Probe in das Instrument14,15eingeführt wird. Die Auswahl einer geeigneten Matrix mit ähnlicher Löslichkeitsparameter als Polymer Analyten ist entscheidend für die hohe Qualität MALDI-TOF Massenspektren zu erhalten und Richtlinien für die Auswahl der Matrix wurden berichtet an anderer Stelle14,15, 16,17. Eine Datenbank mit Polymer MALDI "Rezepte" für die Probenvorbereitung wurde auch veröffentlicht online-18. Für neuartige Polymere kann Matrix Auswahl durch das erste Verständnis der Löslichkeit des Polymers und Auswahl einer Matrix mit ähnlichen Löslichkeit Parameter14,19angegangen werden. Polymere mit hohen Proton Affinität können protonierten durch die meisten Matrizen-14 (die häufig Carbonsäure-Gruppen enthalten), aber für andere Polymere ist ein Cationization-Agent benötigt14. Alkali-Ionen Addukt gut mit Sauerstoff enthaltenden Arten (zB. Polyestern und Polyether), während ungesättigte Kohlenwasserstoffe (zB. Polystyrol) Addukt mit Übergangsmetallen wie Silber- und Kupferionen14, 19. da die Polymerproben in diesem Experiment Sauerstoffatome im Backbone enthalten, Natrium oder Kalium Trifluoroacetate (TFA) wurden als der Cationization-Agent verwendet. Nachdem die Matrix und Cationization Agenten ausgewählt haben, müssen die relativen Anteile der Analyten, kation Agent und Matrix sorgfältig optimiert werden, dafür ein hohes Signal-Rausch. In diesem Verfahren die Parameter für die Probenvorbereitung sind bereits optimiert worden, aber eine empirische Beispielprozedur Optimierung (Schritt 1.4.1., Abbildung 1), die systematisch variiert die Konzentrationen der drei Komponenten (Analyt, Matrix und kation) ist wirksam zur Bestimmung schnell ihre optimale Verhältnisse.
Die Datenerfassung erfordert auch die Optimierung der eine Reihe von Parametern. Die wichtigsten Parameter sind die positiven oder negativen Ionen-Modus des Spektrometers, der Instrument-Betriebsart (linear versus Reflektor), die Beschleunigungsspannung und die Extraktion-Delay-Zeit. Eine weitere Möglichkeit, dass die Auflösung erhöht werden kann ist durch die Nutzung von "reflektron" Modus20,21,22,23. Reflektron Modus verdoppelt im Wesentlichen die Flugbahn der Ionen zum Detektor durch reflektieren die Ionen am Ende des Rohres Flug zurück in Richtung eines Detektors in der Nähe der Quelle während Neuausrichtung Ionen mit unterschiedlichen Impulse und somit Erhöhung der Auflösung, obwohl abnehmender Signalstärke. Darüber hinaus erhalten höhere Auflösung Spektren durch eine Verringerung der Laserleistung, die das Signal-Rausch-Verhältnis minimiert durch Verringerung der Zahl und Energie der Kollisionen und somit Verringerung der Fragmentierung und kinetische Inhomogenitäten24. Durch all diese Parameter optimieren, können die Ionen konzentriert werden, um minimieren die Auswirkungen jeder Inhomogenität in die ursprüngliche Position oder Geschwindigkeit, die während der Laser Desorption Prozess auftritt. Wenn die Aufnahmeparameter optimiert sind, kann isotopischen Auflösung oft für Ionen mit einer Masse von mehr als 10.000 Da erreicht werden, obwohl dies auch abhängig von der Länge des Rohres Flug und das Instrumentendesign. Die meisten organische Verbindungen, die mindestens ein Heteroatom enthalten sind anfällig für Komplexbildner mit Alkali kationen wie Lithium, Natrium und Kalium. Viele der Alkalimetalle sind Monoisotopes oder begrenzte Isotope und daher nicht die Verteilung zu erweitern.
Während die Geräteparameter optimiert werden können, um die Datengenauigkeit zu optimieren, ist Genauigkeit der Daten nur mit einer entsprechenden Kalibrierung11erreicht. Proteine und Peptide dienten ursprünglich als Kalibrierstandards aufgrund ihrer Monodispersity und Verfügbarkeit, aber Variable Stabilität und der Prävalenz von Verunreinigungen25leiden. Kostengünstige und stabile Alternativen enthalten Anorganische Cluster und Polydisperse Polymere26,27,28,29. Leider, diese alternativen Feature verteilen Massen, die Masse Aufgaben sowie kleinere Massen insgesamt erschweren nur für Kalibrierungen unter 10.000 Da nützlich machen. Gegen diese Probleme, Grayson Et Al. 25 ein Dendrimer-basierte, Polyester MS Kalibrierung System entwickelt, das ist monodispers, und verfügt über breite Matrix und Lösungsmittel-Kompatibilität, Haltbarkeit Stabilität (> 8 Jahre) und geringere Produktionskosten. Basierend auf den Stärken dieses Systems, wurde es als Kalibrator für diese Experimente ausgewählt.
Es gibt zwei Haupttypen von Kalibrierung: interne und externe30. Wenn Extern kalibrieren, ein Standard mit Massen, die Halterung der Analyten liegen auf MALDI-Zieltafel in einer unterschiedlichen Position als Analyten zu generieren eine separate Massenspektrum, aus denen eine Kalibrierung Datei erzeugt werden kann. Auf der anderen Seite erhöhter Genauigkeit oft mit einer interne Kalibrierung lässt sich einhergehende Vermischung der Kalibrator mit den Analyten, ein Hybrid-Spektrum mit Kalibrator und Analyten Signale zu erhalten. Das unten beschriebene Verfahren wurde eine externe Kalibrierung umgesetzt. Nach der korrekten Kalibrierung der Massenskala können genaue Analyten Massendaten erworben werden. Um die genaueste Kalibrierung zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Datenerfassung bald nach der Kalibrierung erfolgt.
Schließlich sobald der optimierten kalibriert Datensätze erworben wurden und die Daten wurden analysiert, um strukturelle Informationen über die Polymerproben. Der Abstand zwischen den n-Mers in der Polymer-Distribution bieten genaue Messung der sich wiederholende Einheit Masse. Die Zahl mittlere Molmasse (Mn) und andere Masse Verteilung Berechnungen (z.B.Mw (Gewicht mittlere Molekulargewicht) und Đ (Dispersität)) auch von der Signalverteilung in den Massenspektren (ermittelt werden Schritt 4.2 für Berechnungen). Vielleicht kann die meisten einzigartig bei Homopolymere, die Summe der Massen Ende Gruppe bestätigt werden durch die Bestimmung des Offset der Polymer-Verteilung in Bezug auf die Masse der Wiederholungseinheiten allein. Die informationsreichen MALDI-TOF Massenspektren liefern wertvolle Charakterisierungsdaten, die traditionellere Polymer Charakterisierung Techniken wie Größe Ausgrenzung Chromatographie, Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie, ergänzen und magnetischen Kernresonanz.

<table><tbody><tr><td>Polyoxyethylen-Bis(azid) (Mn=2000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>689696</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)-2-aminoethyletheressigsäure (Mn= 5000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>757918</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Poly(L-Lactid), Thiol terminiert (Mn=2500)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>747386</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; Peptid niedrig</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS20</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; Peptidmedium</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS21</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; Peptid mit hohem</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS22</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>2,4-Dinitrofluorbenzol</td><td>TCI</td><td>A5512</td><td></td></tr><tr><td>Maleimid</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>129585</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1-ethynylfluorbenzol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>766-98-3</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>471283</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>N,N,N',N",N"-Pentamethyldiethylentriamin</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>369497</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Kupfer(I)bromid</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>254185</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38212</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetabisulfit</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>13459</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Kaliumtrifluoracetat</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>281883</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>trans-2-[3-(tert-butylphenyl)-2-methyl-2-properyliden]malononitril</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>727881</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure</td><td>MilliporeSigma (Sigma)</td><td>C8982</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-1</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von synthetischen polymeren matrix assisted laser desorption ionisation zeit der massenspektrometrie flug (maldi-tof)

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Es gibt viele Techniken, die in der Charakterisierung der synthetischen Homopolymere eingesetzt werden können, aber nur wenige bieten als nützliche Informationsquelle für Ende Gruppenanalyse als Matrix-assisted Laser Desorption ionisation Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS). Dieses Tutorial zeigt Methoden zur Optimierung der Probenvorbereitung, spektralen Erwerb und Datenanalyse von synthetischen Polymeren mit MALDI-TOF MS. kritische Parameter während der Probenvorbereitung gehören die Auswahl der matrix Kennung der eine entsprechende Cationization Salz und tuning die relativen Anteile der Matrix, kation und Analyt. Die Aufnahmeparameter wie Modus (linear oder Reflektor), Polarisation (positiv oder negativ), Beschleunigungsspannung und Delay-Zeit, sind ebenfalls wichtig. Da einige Kenntnisse der Chemie beteiligt, das Polymer und Optimierung der Daten Aufnahmeparameter und die Probe Herstellungsbedingungen zu synthetisieren, Spektren mit ausreichender Auflösung und Massengenauigkeit ermöglichen die eindeutige erhalten Sie Bestimmung der Endgruppen der meisten Homopolymere (Massen unter 10.000) zusätzlich zu den wiederholten Einheit Masse und die Gesamtverteilung Molekulargewicht. Obwohl auf einer begrenzten Anzahl von Polymeren nachgewiesen, gelten diese allgemeinen Techniken für eine viel breitere Palette von synthetischen Polymeren zur Bestimmung Massenverteilungen, obwohl Ende Gruppenentscheidung nur für Homopolymere mit schmalen Dispersität möglich ist.

Ein Protokoll für die Matrix-assisted Laser Desorption ionisation Zeit des Fluges, die Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) Charakterisierung von synthetischen Polymeren beschrieben wird unter anderem die Optimierung der Probenvorbereitung, spektrale Beschaffung und Analyse von Daten.

Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF)

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

Das übergeordnete Ziel dieses MALDI-TOF MS-Tutorials ist es, den Benutzern die Probenvorbereitung, -erfassung und -analyse von Polymeren während der Charakterisierung mit MALDI-TOF MS näher zu bringen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Polymercharakterisierung zu beantworten, wie z. B. das Molekulargewicht des Polymers, die Dispersität und die Identität der Endgruppe. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Bestimmung von Homopolymer-Endgruppen ermöglicht. Zuerst wird eine Reihe von Lösungen hergestellt, indem zuvor vorbereitete Matrix-, Analyt- und Kationenlösungen gemischt werden, während die relativen Anteile der Komponenten so variiert werden, dass neun einzigartige Probenmischungen hergestellt werden.Kombinieren Sie für dieses Experiment 15 Mikroliter Poly(L-Lactid)lösung mit 15 Mikrolitern 2,5-Dihydroxybenzoesäurelösung und einem Mikroliter Natriumtrichloracetatlösung. Pipettieren Sie einen Mikroliter jeder Lösungsmischung in eine einzelne Probenvertiefung auf einer MALDI-Zielplatte. Geben Sie die Proben schrittweise in kleinen Portionen hinzu, um zu verhindern, dass die Probe aus der Probenvertiefung fließt, damit jedes Aliquot bis zur Trockenheit verdampfen kann, bevor Sie weitere Proben hinzufügen.Um die Datenerfassung zu starten, öffnen Sie zunächst die Datenerfassungssoftware Flexcontrol. Werfen Sie die Plattform aus, um das Laden der Zielplatte durch Drücken der Auswurftaste zu ermöglichen. Platzieren Sie die Zielplatte mit den geladenen Kalibrant- und Analytproben vorsichtig in der entsprechenden Ausrichtung auf der Plattform.Verwenden Sie anschließend die Erfassungssoftware, um die Zielplatte auf der Plattform zu injizieren, indem Sie die Auswurftaste erneut drücken. Wählen Sie eine geeignete Datenerfassungsmethode aus, indem Sie auf Datei drücken und Methode auswählen auswählen. Stellen Sie vor dem Erfassen von Daten sicher, dass ein geeigneter Massenbereich für die Datenerfassung ausgewählt ist, indem Sie auf die Registerkarte Erkennung klicken und den Massenbereich anzeigen.Wählen Sie in der Erfassungssoftware die Position auf der Zielplatte aus, die dem gewünschten Analyten entspricht. Um die Datenerfassung zu starten, drücken Sie Start und bewegen Sie das Laserziel um die Probe, um das Signal zu maximieren. Mit dem Schieberegler auf der linken Seite des Kamerafensters wird die Laserleistung so eingestellt, dass die minimale Leistung erreicht wird, die zum Erreichen der Isotopenauflösung erforderlich ist.Wenn Sie auf einen einzelnen Peak in der Mitte des interessierenden Massenbereichs zoomen, optimieren Sie die Auflösung, indem Sie die Differenz der Beschleunigungsspannungen anpassen, indem Sie den IS2-Wert auf der Registerkarte Spektrometer variieren. Optimieren Sie schließlich die Laserleistung, indem Sie sie so gering wie möglich reduzieren und gleichzeitig ein vernünftiges Signal-Rausch-Verhältnis erzeugen. Sobald die Erfassungsparameter optimiert sind, speichern Sie die Methode, indem Sie Datei und dann Methode speichern unter auswählen.Stellen Sie sicher, dass alle vorhandenen Kalibrierungen ungültig sind oder überschrieben werden können, indem Sie auf der Registerkarte Spektrometer auf Kalibrierung ungültig drücken.Bewegen Sie den Laser mit denselben Erfassungsparametern auf die Probenvertiefung, die das Kalibrant enthält, indem Sie die entsprechende Vertiefung mit dem Cursor auswählen, und erfassen Sie ein Spektrum, indem Sie Start drücken. Sobald ein ausreichendes Signal erfasst wurde, drücken Sie Start, um die Datenerfassung abzuschließen. Sobald ein Massenspektrum des Kalibrants erfasst wurde, wählen Sie auf der Registerkarte Kalibrierung das Dropdown-Menü Massenkontrollliste aus, das diesem Kalibrierstandard entspricht.Bevor Sie den entsprechenden Referenz-Peak mit jedem ausgewählten Kalibrant-Peak abgleichen, stellen Sie sicher, dass ein geeignetes Peak-Picking-Protokoll verwendet wird, indem Sie auf die Registerkarte Verarbeitung klicken. Wenden Sie die Referenzmasse aus der Massenkontrollliste auf das entsprechende Signal für das Kalibrant-Massenspektrum an, indem Sie den Bereich links vom interessierenden Peak auswählen und dann auf die entsprechende Masse in der Kontrollliste klicken, um sie anzuwenden. Setzen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Calibrant-Peaks fort.Erfassen Sie das Analytspektrum neu, sobald die Massenskala für die optimierten Erfassungsparameter kalibriert wurde. Öffnen Sie das Analytspektrum in der Datenanalysesoftware. Vergrößern Sie einen Peak, um festzustellen, ob eine Isotopenauflösung erreicht wurde, indem Sie die Schaltfläche In X-Bereich vergrößern auswählen.Drücken Sie nun Massenliste und wählen Sie Suchen, um Peaks auszuwählen. Wenn der Monoisotopen-Peak aufgelöst ist, wählen Sie diesen ersten Peak in der Isotopenverteilung aus, um seine Masse unter Verwendung eines Monoisotopen-Peak-Picking-Protokolls zu bestimmen. MALDI-TOF MS bestätigt die enge Verteilung des terminierten Poly(L-Lactid)thiols und es wurde eine Analysesoftware verwendet, um die hier gezeigten Polymereigenschaften zu berechnen.Die beobachtete Masse für das 26-mer beträgt 1973,62, was minus 0,07 Dalton vom theoretischen Wert unterscheidet. Ein kleineres Signal bei 2045,74 deutet auf eine Umesterung während der Ringöffnungspolymerisation von Milchsäure hin. Ein kleiner Peak bei 2057,73 ist wahrscheinlich die Folge der Initiierung aus Wasser während der ringöffnenden Polymerisation des Lactidmonomers.MALDI-TOF MS bestätigt die enge Verteilung des Poly(L-Lactid)thiols, das nach einer Thiol-En-Reaktion mit Maleimid beendet wurde, und es wurde eine Analysesoftware verwendet, um die hier gezeigten Polymereigenschaften zu berechnen. Die theoretische Masse des 26-mers von terminiertem Poly(L-lactid)thiol entspricht 2070,56891, was 0,03 Dalton von der beobachteten Masse unterscheidet. Die gleiche Spezies, die mit Kalium ionisiert, wird auch bei 2086,49 beobachtet.Ein kleiner Peak bei 2167,58 deutet auf die gleiche Verunreinigung durch Wasserinitiierung hin, die im Ausgangsmaterial beobachtet wurde. Die gleiche Massenverschiebung, die für die Thiol-En-Reaktionsprodukte beobachtet wurde, tritt nicht auf, was darauf hindeutet, dass dieser Carbonsäure-terminierten Verbindung die Thiol-Endgruppe fehlte, um die Funktionalisierungsreaktion zu durchlaufen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Probenvorbereitung und die Datenerfassungsparameter optimieren und die Daten analysieren können, die durch die MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Charakterisierung von Polymeren generiert werden.

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Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF) (Video) | JoVE Journal

Charakterisierung von synthetischen Polymeren Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Zeit der Massenspektrometrie Flug (MALDI-TOF)

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