Eine effiziente Vorbereitung Beispielmethode Kohlenhydrat Ionen-Signale in der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie verbessern

Um die konventionelle Methode der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie zu verbessern, wurde ein einfaches Probenvorbereitungsverfahren entwickelt, indem die einfache Morphologie während des Trocknungsprozesses reformiert wird. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Signalintensität von Kohlenhydratproben, die mit dieser optimierten Methode hergestellt werden, effektiv erhöht werden kann. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da der Schritt der Methanoldruckentlastung sehr wichtig ist und in einem Arbeitsgang durchgeführt werden muss.

Jedes Zögern verringert die Datenqualität. Verwenden Sie zunächst mit Nitrilhandschuhen 100 Milliliter Waschmittellösung, um die Probenplatte von Hand zu waschen. Verwenden Sie destilliertes, deionisiertes oder DD-Wasser, um den Teller von Hand zu waschen.

Spülen Sie dann mit 30 Millilitern Methanol die Oberfläche ab. Die Probenplatte wird in ein 600-Milliliter-Becherglas eingesetzt und mit DD-Wasser gefüllt, bis die Platte vollständig eingetaucht ist. Stellen Sie dann das Becherglas in ein Ultraschallbad und beschallen Sie die Platte 15 Minuten lang.

Nehmen Sie die Probenplatte aus dem Becherglas und blasen Sie die Wassertropfen mit unter Druck stehendem Stickstoff ab. Geben Sie dann 0,2 Mikroliter Methanol auf die Probenplatte, um zu prüfen, ob es sich auf andere Stellen ausbreitet. Wenn dies der Fall ist, wiederholen Sie die Waschung, Beschallung und Stickstoffbehandlung wie gerade gezeigt.

Nach Vorbereitung der Trockenkammer gemäß dem Textprotokoll werden 0,25 Mikroliter 2,5-Dihydroxybenzoesäurelösung und 0,25 Mikroliter Sialyl-Lewis A oder Maltoheptanoselösung im Mikrozentrifugenröhrchen vorgemischt. Wirbeln Sie dann das Rohr drei Sekunden lang durch. Die angemischte Lösung wird in der Minizentrifuge bei 2000 mal G zwei Sekunden lang heruntergeschleudert.

Pipettieren Sie dann sofort 0,1 Mikroliter der vorgemischten Lösung auf die Probenplatte. Wenn die Probe getrocknet ist, pipettieren Sie 0,2 Mikroliter Methanol direkt auf die Probenstelle, wobei Sie schnell arbeiten müssen, um eine Verdunstung zu vermeiden. Die Probe löst sich wieder auf und trocknet dann sofort aus.

Der Schritt der Methanolabscheidung ist der schwierigste Schritt, der die Datenqualität und Reproduzierbarkeit bestimmt. Um die beste Leistung zu gewährleisten, empfehlen wir, dass der Benutzer die Abscheidung in drei bis fünf Sekunden beendet, um einen signifikanten Verdampfungsverlust von Methanol zu vermeiden. Tragen Sie Nitrilhandschuhe und nehmen Sie die Probenplatte vorsichtig aus der Trockenkammer.

Untersuchen Sie dann die Probe unter einem Mikroskop. Wenn die Kristallmorphologien nicht wie erwartet sind, wiederholen Sie das Mischen der Probe und das Auftümmen auf die Probenplatte. Um sicherzustellen, dass die Probenkristalle nach der Rekristallisation die optimale Morphologie aufweisen, sollten sie immer mit einem Mikroskop untersucht werden.

Es ist schwierig, die Qualität der Kristallmorphologie mit bloßem Auge korrekt zu bestimmen. Um eine Ein-Mikroliter-Probe zu analysieren, mischen Sie 2,5 Mikroliter 2,5-Dihydroxybenzoesäurelösung und 2,5 Mikroliter Sialyl-Lewis A oder Maltoheptanose-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. Die vorgemischte Lösung fünf Sekunden lang vortexen.

Schleudern Sie die gemischte Lösung zwei Sekunden lang bei 2000-fachem G herunter und pipettieren Sie dann sofort einen Mikroliter der vorgemischten Lösung auf die Probenplatte. Nachdem die Probe ausgetrocknet ist, pipettieren Sie 1,5 Mikroliter Methanol direkt auf die getrocknete Probenstelle. Die Probe löst sich wieder auf und trocknet sofort aus.

Entnehmen Sie die Probe vorsichtig aus der Trockenkammer. Untersuchen Sie die Probe unter einem Mikroskop. Wenn die Kristallmorphologien nicht den Erwartungen entsprechen, wiederholen Sie die Lösungsvorbereitung wie gerade gezeigt.

Um Massenspektrometrie durchzuführen, öffnen Sie die Steuerungssoftware für das Massenspektrometer und setzen Sie die Probenplatte in die Maschine ein. Wählen Sie die voroptimierte Datenerfassungsmethode in der Software aus und registrieren Sie dann mit der Bildgebungssoftware den gesamten Probenbereich für die bildgebende Massenspektrometrie. Starten Sie die Datenerfassung im Batch-Modus der Steuerungssoftware.

Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um die Ionenbilder zu plotten und die Daten gemäß dem Textprotokoll zu analysieren. Repräsentative REM-Bilder von Sialyl-Lewis A gemischt mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure, hergestellt mit getrockneten Tröpfchen- und Rekristallisationsmethoden, sind hier zu sehen. Eine typische 2,5-Dihydroxybenzoesäure-Morphologie besteht aus großen, nadelförmigen Kristallen am Rand und feinen kristallinen Strukturen in der Mitte der Probenflecken.

Nach der Rekristallisation durch Methanol hat die Probe eine größere Fläche, die gleichmäßig mit feinen, flockenartigen Kristallen bedeckt ist. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der bildgebenden Massenspektrometrie von Sialyl-Lewis A und Maltohepeptao mit und ohne Methanol-Rekristallisation. Nach der Rekristallisation stimmt die Verteilung der Sialyl-Lewis A- und Maltohepaose-Signale gut mit den Hellfeldbildern der Probenflecken überein.

Auch die Signalintensitäten der rekristallisierten Kohlenhydratproben sind im Vergleich zu herkömmlichen trockenen Tröpfchenproben erhöht. Dieses Diagramm vergleicht die Signalintensität von sodiierten oder positiven Ionen-Kohlenhydraten und deprotonierten oder negativen Ionen-Kohlenhydraten von rekristallisierten Proben im Vergleich zu getrockneten Tröpfchenproben. Im Durchschnitt erhöhte die Rekristallisation von Sialyl-Lewis A- und Maltoheptanose-Proben die sodierten Signale um den Faktor 3,9 und 3,3.

Deprotonierte Sialyl-Lewis-A-Ionensignale wurden nach der Rekristallisation um den Faktor 4,7 verstärkt. Einmal gemeistert, können Proben mit dieser Technik in 10 Minuten vorbereitet werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass das Methanoltröpfchen sofort und präzise auf der Probenstelle abgeschieden wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kristallmorphologie von Mehrfachproben effektiv kontrollieren können, um die besten Ionensignale für die Routineanalyse zu erhalten.