Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine intraprostatische Injektion von murinen Krebszellen durchzuführen, um die Bildung von syngenen orthotopen Tumoren zu induzieren, die sowohl androgenabhängigen als auch kastrationsresistenten Prostatakrebs modellieren können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet des Prostatakrebses zu beantworten, z. B. was die Entwicklung von Prostatakrebs antreibt und welche Behandlungen bei der Beseitigung dieser Tumoren am besten wirken. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass orthotope Tumoren genetisch komplexer sind, sich in einer klinisch repräsentativen Tumormikroumgebung entwickeln und vor der Injektion genetisch verändert werden können.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von menschlichem Prostatakrebs, da orthotope Tumoren auf ähnliche Weise auf Therapien ansprechen wie bei menschlichen Patienten. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, tragen Sie Salbe auf die Augen der Maus auf und rasieren Sie das gesamte Fell vom Bauch des Tieres. Sterilisieren Sie die exponierte Haut mit drei Runden chirurgischem Peeling mit sterilen, nicht haftenden Pads, gefolgt von sterilen Alkoholtupfern.

Wenn die Haut trocken ist, legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine saubere Oberfläche über einem Heizkissen direkt unter dem Objektiv eines sauberen Operationsmikroskops. Und bedecken Sie das Tier mit einem sterilen Tuch mit einem kleinen Loch über dem Bauch. Machen Sie einen ein Zentimeter langen Schnitt in der Außenhaut und der inneren Bauchmuskulatur entlang der Mittellinie des Bauches oberhalb des Penis und der Präputialdrüsen.

Lokalisieren Sie eines der beidseitigen Samenbläschen und die daran befestigten vorderen Prostatalappen, die typischerweise posterior, lateral und etwas oberhalb der Blase liegen. Bitten Sie einen Assistenten, die MIC-CAP Matrigel Krebszelllösung durch sanftes Pipettieren zu mischen und 30 Mikroliter Zellen langsam in eine 28-Gauge-Nadel zu aspirieren, die an einer 50-Mikroliter-Spritze befestigt ist. Heben Sie dann mit der Graefe-Gewebezange vorsichtig die Spitze eines Samenbläschens an, um Spannung auf dem Gewebe zu erzeugen, ohne das Vesikel zu punktieren, und führen Sie die Abschrägung der Nadel vorsichtig parallel zur Längsachse des vorderen Prostatalappens ein. Injizieren Sie langsam das gesamte Zellvolumen in den Lappen, gefolgt von einem langsamen Zurückziehen der Nadel, um ein Auslaufen zu verhindern.

Eine erfolgreiche Injektion macht sich durch eine Schwellung des vorderen Prostatalappens bemerkbar. Halten Sie das Samenbläschen und den injizierten Prostatalappen vorsichtig und stetig etwa 30 Sekunden lang außerhalb der Maus, damit sich das Matrigel teilweise im Lappen verfestigen kann. Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Polyesterspitze, um austretende Zelllösung in den Bauch aufzufangen, um die Entwicklung eines nicht-orthotopen Tumors zu verhindern.

Eine präzise intraprothetische Injektion ist entscheidend für die Entwicklung nicht-orthotoper Tumoren. Wenn Sie besonders darauf achten, dass die Samenblase nicht durchstochen wird, die Krebszellsuspension langsam injiziert und eventuelle Zellleckagen aufgefangen werden, wird der Erfolg dieses Verfahrens erhöht. Bringen Sie nun die Samenblase und den injizierten Lappen vorsichtig in den Bauch zurück, ohne Druck auf den Lappen auszuüben, und ersetzen Sie das externalisierte Gewebe.

Mit 5-0 vicryl resorbierbaren Reverse-Cutting-Nadelnähten die innere Bauchmuskulatur mit durchgehenden Stichen schließen, gefolgt von einem Verschluss der äußeren Bauchhaut mit unterbrochenen Stichen mit 4-0 Nylon-Monofilamenten, nicht resorbierbaren Reverse-Cutting-Nadelnähten. Verabreichen Sie dann eine postoperative Analgesie und setzen Sie die Maus in einen Käfig ohne Einstreu auf halbem Weg auf ein Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Die stabile Transfektion von Myc-CaP-Zellen für Glühwürmchen-Luziferase und mCherry-Expression ermöglicht die Verfolgung der Prostatatumoren durch nicht-invasive in vivo Biolumineszenz und Fluoreszenz.

Hier sind repräsentative Tumoren dargestellt, die am Tag 30 nach intraprostatischer Injektion aus dem Abdomen präpariert wurden. Mit der richtigen Technik können Tumorvolumen und -gewicht mit relativ geringem Standardfehler aufgezeichnet werden, obwohl eine gewisse Variabilität zwischen kleinen und großen Tumormassen zu erwarten ist. Intraprostativ injizierte murine Krebszellen können auch immunhistochemisch auf das Vorhandensein von tumorinfiltrierenden CD3-positiven T-Zellen oder anderen Immunzellen von Interesse analysiert werden.

Darüber hinaus bietet dieses Modell einen objektiven Überlebensendpunkt, da die große Primärtumormasse einen hämorrhagischen Bauchaszites und/oder eine verminderte Gehfähigkeit, Fellpflege und/oder Piloerektion verursacht. Die Kastration drei Tage nach der intraprostatischen Injektion führt zu einer robusten Tumorregression, gefolgt von einem eventuellen Tumorrezidiv nach etwa 30 Tagen, repräsentativ für kastrationsresistentes Prostatakarzinom. Die Dissektion und histologische Analyse von kastrationsresistenten Prostatakrebstumoren zeigt keine neuroendokrine Differenzierung, da die Tumoren hohe Androgenrezeptorspiegel aufweisen und negativ für den neuroendokrinen Marker Synaptophysin sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 bis 30 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, prä- und postoperative Analgetika zu verabreichen und alle Operationen mit steriler Technik und mit Hilfe eines chirurgischen Assistenten durchzuführen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunhistochemie, Durchflusszytometrie und Beurteilung des Tumorvolumens und -gewichts sowie des Überlebens der Tiere durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Ansprechen auf Immuntherapien und andere experimentelle Therapeutika zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Prostatakrebszellen in den vorderen Prostatalappen von Mäusen für eine eventuelle chirurgische Kastration und Tumorregressions- und Rezidivanalyse injiziert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krebszellen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen der richtigen persönlichen Schutzausrüstung.