Name: Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Lernen Sie die Erstellung transgener Zebrafisch-Linien zur Visualisierung zellulärer elektrischer Aktivität während Embryogenese und Tumorbildung. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Tracking elektrischer Signale in vivo.

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Die Forschungsarbeit, die in dieser Publikation berichtet wurde durch das National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health Award Anzahl R35GM124913, Purdue University PI4D Incentive-Programm und PVM internen Wettbewerb unterstützt. Grundlagenforschung-Fonds-Programm. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der finanziellen Mittel. Wir danken für das Konstrukt Tol2, Michael Lin für das Konstrukt ASAP1 Koichi Kawakami und Leonard Zon für die Ubi -Promoter zu konstruieren, durch Addgene.

Der Zebrabärbling in eine AAALAC genehmigt Tierstation untergebracht sind, und alle Versuche erfolgten nach den Protokollen von Purdue Animal Care und Nutzung Committee (PACUC) genehmigt.
1. Tol2 Transposon Plasmid Konstrukt Vorbereitung
Hinweis: Tol2, ein Transposon, das Medaka Fisch entdeckt wurde hat in der Zebrafisch Forschung Gemeinschaft8,9verbreitet wurde. Es wurde erfolgreich an das Gateway ortsspezifische Rekombination basierende Klonen System angenommen und als Tol2 Kit10bekannt. Das Tol2-Kit ermöglicht eine sehr komfortable Möglichkeit individuelle Ausdruck Konstrukte, während auch die Effizienz der Transgenese zu schaffen. So war es eine leichte Entscheidung, nutzen die Vorteile dieses Systems, und eine allgegenwärtige ASAP1 Ausdruck Zebrafisch Linie mit einem validierten Ubiquitin Promotor ASAP111fahren.
<ol><li>Erstellen einer mittleren Eintrag ASAP1 Konstrukt: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Das genetisch codierte Spannung Sensor ASAP1 Konstrukt, pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (Plasmid #52519), von Addgene zu erwerben. Um die ASAP1 kodierenden Region zu verstärken, richten Sie eine PCR unter Verwendung der benutzerdefinierten Zündkapseln (attB1-ASAP1F und attB2-ASAP1R) flankiert mit AttB Sequenzen am 5'-Ende der Primer (Abbildung 1). Phusion-DNA-Polymerase wählte für seine hohe Effizienz und PCR-Zustände wurden basierend auf den zuvor veröffentlichten Protokoll12optimiert.</li>
		<li>Laden Sie die 50 µL-PCR-Produkte in eine 1 % TAE gel mit einer regelmäßigen Pipette mit 200 µL Spitzen und führen Sie Elektrophorese bei 160 V in einem horizontalen Gel Tank für ca. 30 min.</li>
		<li>Überprüfen Sie das Gel unter einem UV-Transilluminator (353 nm), Verbrauchsteuern, das gewünschte Band mit einem Messer/Skalpell unter einem UV-Transilluminator als bisher erschienen13,14, und setzen die DNA mit Gel-Probe in eine saubere 1,5 mL Microcentrifuge Rohr.</li>
		<li>Durchführen Sie Gel-Reinigung für die ASAP1 PCR-Produkte. Erholen Sie die DNA in den ausgeschnittenen Gel mit einem kommerziellen DNA-Gel Reinigung Kit nach Anweisungen des Herstellers zu, und eluieren Sie die DNA in 20 µL Wasser. 1 µL als Beispiel zu nehmen, und die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen. Fließen Sie die Anweisungen der Software, die mit Wasser als ein leeres Steuerelement15.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 ng des PCR-Produktes gereinigt und mischen Sie es mit 150 ng pDONR221 Plasmid in 10 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8.0)16. Fügen Sie 2 µL BP Clonase II in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.</li>
		<li>Am zweiten Tag fügen Sie 1 µL Proteinase K in die Reaktion und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 30 min.</li>
		<li>Führen Sie die Transformation. Übertragen Sie die Reaktion und mischen Sie es mit 50 µL der Top10 kompetente E. Coli Zellen und inkubieren Sie die Zellen für 30 min auf Eis. Dann Transfer das Reaktionsgefäß in ein Wasserbad 42 ° C für 1 min. sofort entfernen Sie den Schlauch und inkubieren Sie für 2 min auf Eis. Als nächstes legen Sie den Schlauch in einen Shaker 37 ° C und 1 h inkubieren.</li>
		<li>Das Rohr herausnehmen und die Zellen auf eine Kanamycin LB-Platte-Platte. Als nächstes inkubieren Sie die Platte über Nacht (16-18 h) bei 37 ° c</li>
		<li>Wählen Sie einzelne und gut getrennte Kolonien und in 14 mL Zelle Kultur Röhren mit 3 mL LB-Medium zu impfen. Kultur sie über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min (Umdrehung pro Minute).</li>
		<li>Führen Sie Miniprep mit einem kommerziellen Miniprep Kit nach seiner Anweisung manuelle17.</li>
		<li>Sequenz 3-4-Plasmide mit Sanger-Sequenzierung positiven pDONR221-ASAP1 identifizieren Klone mit M13F und M13R-Sequenzierung-Primern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen der Tol2 Konstrukt für die Mikroinjektion: pDestTol2 -Ubi-ASAP1<ol>
<li>Wählen Sie die Sequenzierung pDONR221 ASAP1 Klon und Maßnahme überprüft seine DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer folgenden der Software Anweisung mit Wasser, wie eine leere Steuern15.</li>
		<li>Nehmen Sie 100 µg pDONR221-ASAP1 und mischen Sie es mit 100 µg Tol2 Kit 5-End Plasmids (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-PolyA (Tol2 Kit #302) und 150 µg des pDestTol2pA2 (Tol2 Kit #394). Insgesamt Lautstärke zu 8 µL TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) in einer 1,5 mL Microcentrifuge Rohr und mischen Sie gut durch einen 2-5 s kurze Wirbel. Dann fügen Sie 2 µL des LR Clonase II plus und inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht.</li>
		<li>Am zweiten Tag 1 µL Proteinase K in die Reaktion mit einer 10 µL Pipette einfügen und die Reaktion bei 37 ° C für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie Transformation und identifizieren Sie positive Klone zu, wie oben (Schritte 1.1.7-11) beschrieben.</li>
		<li>Maßnahme die DNA-Konzentration der Sequenzierung überprüft pDestTol2 Ubi ASAP1 Klon (Abbildung 1 b) mit einem Spektrophotometer15. In der Regel ist die Konzentration um 200ng/µL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bereiten Sie Tol2 Transposase mRNA und Injektionslösung
<ol><li>Streak E. Coli Glycerin Bestand an pCS2FA-Transposase Plasmid (Tol2 Kit #396) auf eine LB-Platte (mit 100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten Impfschlinge. Über Nacht inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem Inkubator. Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen Sie es in 3 mL LB (100 µg/mL Ampicillin) mit einer sterilisierten 10 µL PIPETTENSPITZE zu. Kultur es über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker mit einer Drehzahl von 250 u/min.</li>
	<li>Führen Sie Miniprep auf die E. Coli -Kultur mit einem kommerziellen Miniprep Kit die Beachtung der Bedienungsanleitung. Eluieren Sie Plasmid-DNA in 30-50 µL TE-Puffer von 1 Minute Zentrifuge bei 14.000 u/min und Messen Sie seine DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Linearisieren 1-2 µg Plasmids mit nicht ich Endonuklease und Reinigen der DNA mit einer Reinigungs-Kit nicht ich die Bedienungsanleitung nach DNA Verdauung. Eluieren Sie die DNA in 5 µL Wasser durch Zentrifugieren bei 14.000 u/min für 1 Minute. Die erwartete Konzentration beträgt über 200-300 ng/µL.</li>
	<li>Führen Sie in Vitro Transkription mit nicht linearisiert ich pCS2FA-Transposase als DNA-Vorlage mit einem kommerziellen SP6 Transcription Kit.</li>
	<li>Wenn die Reaktion beendet ist, reinigen Sie Tol2 Transposase mRNA mit Hilfe einer Gebäudereinigung RNA kit nach den Anweisungen des Herstellers. Zu guter Letzt eluieren Sie mRNA in 20 µL RNAase-freies Wasser und Messen Sie die RNA-Konzentration in einem Spektralphotometer. Die erwartete Konzentration geht es um 1-3 µg / µL. Proben können in einem-80 ° C Gefrierschrank gelagert werden, wenn nötig.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mikroinjektion Lösung durch Mischen von 20 ng/µL pDestTol2 -Ubi-ASAP1 und Tol2 Transposase mRNA (100 ng/µL) in einem Microcentrifuge Schlauch durch pipettieren. Zur Verhinderung von Nukleinsäure-Beeinträchtigung durch wiederholtes Auftauen und Auftauens, aliquoten 6 µL pro Röhre und in einem-80 ° C Gefrierschrank für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
</ol>3. die Mikroinjektion
<ol><li>Richten Sie 4-6 Zucht Becken mit mindestens 2 Rüden und 2 Hündinnen am Nachmittag vor der Injektion. Diese Fische müssen nicht am Nachmittag gefüttert werden. Dieser Schritt wird reduzieren die Menge der Fischabfälle und sparen Sie Zeit, um sie am nächsten Morgen, während gleichzeitig eine Zucht Reaktion veranlassen zu reinigen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen, entfernen Sie die vorbereiteten Injektionslösung (pDestTol2 -Ubi-ASAP1 Konstrukt und Tol2 mRNA) aus der Tiefkühltruhe-80 ° C und auf Eis legen.</li>
	<li>Ziehen Sie den Teiler in der Fischzucht Panzer und lassen Sie den Fisch zu Paaren. Im Allgemeinen legen Fische Eiern innerhalb von 20-30 Minuten nach dem Herausziehen des Teilers. Wenn nicht, warten Sie 1-2 Stunden länger. Einige Fische können überhaupt keine Eiablage. In diesem Fall wiederholen Sie dieses Experiment für Embryo Fischsammlung.</li>
	<li>Während der Wartezeit stellen Sie sicher, dass Nadeln mit der Spitze in einem Winkel eine abgeschrägte Kante zu schaffen, mit der Pinzette oder durch brechen auf eine heikle Aufgabe Scheibenwischer gebrochen vorbereitet.<ol>
<li>Ziehen Sie Nadeln aus Kapillaren Glas auf einer Mikropipette Abzieher mit den folgenden Parametern: Erhitzen 545; 60 zu ziehen; Geschwindigkeit 80; Zeit 250; Druck 500. Die Nadel mit der Pinzette unter einer Dissektion Umfang (mit Okular Lineal für Durchmesser Schätzung) zu brechen, hält die Zange in einem Winkel von ca. 45 °. Gewünschte Nadel Durchmesser können variabel je nach den Microinjector-Einstellungen sein, aber kleinere Durchmesser wird bevorzugt für die Verringerung des Embryos Sterblichkeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald der Fisch Eiablage haben, sammeln sie in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale und bringen sie auf den Bereich der Dissektion. Entfernen Sie alle abnorme Embryonen und Fischen Sie Abfall zu.</li>
	<li>Pipettieren Schimmel die befruchteten Embryonen in die vorbereitete 3 % Agarose-Injektion. Entfernen Sie überschüssiges Wasser um die Embryonen im Ort zu halten.</li>
	<li>Sobald alle Zeilen mit Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so, dass die einzelnen Zellen, die alle die gleiche Richtung der Nadel Gesicht die etwa einen Winkel von 45° horizontal. Dies wird Injektion später viel leichter machen.</li>
	<li>Mit Handschuhen, verwenden Sie eine 20 µL laden pipettieren kippen und 5 µL des vorbereiteten Konstrukts aus der Tube auf dem Eis zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Spitze in das hintere Ende des gebrochenen kapillarröhrchens bis hin zu, Tapper beginnt, das Reagenz möglichst nahe an die Spitze zu erhalten. Wenn es noch Luftblasen immer, schütteln Sie die Nadel, und achten Sie auf die Spitze nicht zu brechen.</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel direkt in die Mikroinjektion Nadelhalter und ziehen Sie sorgfältig an, bis die Nadel an seinem Platz bleibt. Stellen Sie den Winkel auf ca. 45°.</li>
	<li>Sobald die Nadel vorbereitet und angeschlossen ist, schalten Sie das Mikroskop und Gas-Druck-Tank. Kommerzielle CO2 Tanks sind im Allgemeinen gut für diesen Zweck. Die Einspritzmenge wird durch die Holding und Auswurf Druck eingestellt: ca. 0,5 Psi gewartet und 30 Psi für Auswurf. Achten Sie darauf, zu prüfen, ob die Lösung kommt heraus, wenn das Pedal zu drücken.</li>
	<li>Passen Sie mithilfe einer Bühne Mikrometer mit einem Tropfen Mineralöl, das Volumen und die Lösung für ~ 150 µm im Durchmesser (ca. 2 nL). Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck wird eine kleine Menge der Nadel heraus Tropfen lassen. Wenn nicht genug Gegendruck vorhanden ist, bewirkt Kapillarwirkung Flüssigkeit, geben die Nadel und die mRNA zerstören.</li>
	<li>Sobald die Nadel kalibriert wird, beginnen Sie Injektion das Konstrukt in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen. Hinweis: Dies dauert viel Übung, Geduld und Finesse durch die Zellmembran, die schwer zu durchdringen. Es ist wichtig, die Lösung in der Zelle, nicht das Eigelb zur Erzeugung transgener Zebrafisch zu injizieren. Dies unterscheidet sich von Morpholino-Injektion. Es spielt keine Rolle, welche Seite die Nadel betritt die Zelle so lange, wie das Konstrukt in der Zelle geht. Die Transgenese haben eine sehr niedrige Rate des Erfolges, wenn das Eigelb statt der Zelle injiziert. Einzel-Zell-Stadium Injektion ist auch wichtig, oder somatischen Chimäre Fisch erstellt werden. Dies verringert die Chance des Transgens werde in den Keimzellen.</li>
	<li>Benutzen Sie den Rand der Gel-Kerbe, einen Rückhalt bieten, der hält den Embryo vorhanden und ermöglicht die Nadel, Druck auszuüben, ohne sich zu bewegen den Embryo. Sobald die Spitze der Nadel in die einzelne Zelle ist, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge an Lösung zu veröffentlichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle der Embryonen.</li>
	<li>Wenn abgeschlossen, übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale durch Spülen sie aus Agarose Kerbe mit System Fischwasser und ein Einweg-3,4 mL transferpipette. Speichern Sie die Embryonen in einem 28,5 ° C Inkubator zu entwickeln lassen. Überprüfen Sie zurück im Laufe des Tages entfernen Tote Fischembryonen und ersetzen Sie Wasser mit 0,1 % Methylenblau in Fischwasser zu.</li>
	<li>Ca. 6-8 Stunden nach der Injektion nehmen 10 einzelnen injiziert Embryonen zu Fischen und bereiten genomischen DNA daraus mit Hilfe der Hotshot Methode18.</li>
	<li>Verwenden Sie am nächsten Morgen Dissektion Mikroskop mit einer Fluoreszenz-Lichtquelle um zu sortieren, die Embryonen mit GFP in den Geweben nicht Eigelb. Diese Fischembryonen sollte das eingespritzte Konstrukt enthalten.</li>
	<li>Führen Sie Tol2 Verbrauchsteuern Assay Transposon-Aktivität wie bisher19beschrieben überprüfen. Wenn ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, halten die injizierten Embryonen zu Fischen und heben Sie sie. Wenn keine ausgeschnittenen Plasmid erkannt werden kann, wiederholen Sie den Tol2 mRNA-Synthese und Mikroinjektion bis die positiven Resultate des Tol2 Verbrauchsteuern Assays.</li>
</ol>4. Stellen Sie transgene ASAP1 Fisch, Tg (Ubi: ASAP1)
<ol><li>Heben Sie die injizierten Fische (F-0 -Generation) bis zum Erwachsenenalter, bereits in der Zebrafisch-Buch-20beschrieben. Dies dauert in der Regel ca. 4 Monate.</li>
	<li>Nehmen Sie eine einzelne Erwachsene F0 Fisch und überqueren sie mit einem einzigen gegenüber Geschlecht Wildtyp Fisch. Sammle Fischembryonen nach Zucht im Laufe des Tages. Halten Sie die gesammelten Fischembryonen im 28,5 ° C Inkubator in Fisch mit 0,1 % Methylenblau Wasser.</li>
	<li>Am dritten Tag überprüfen Sie Fischembryonen unter einem Mikroskop fluoreszierende Dissektion mit einem GLP-Filter. Grüne Fischembryonen zu klären, wenn es welche gibt, und heben Sie sie bis zum Erwachsenenalter als F1 Generation transgene Fische, Tg (Ubi: ASAP1). Hinweis: Mendelian Verhältnis wird nicht erwartet, da die meisten der elterlichen F0 Fische Keimbahn genetischer Chimären sind.</li>
	<li>Überqueren Sie einzelne F1 geschlechtsreifer Fische mit Wildtyp-Fisch und sammle Fischembryonen. Sortieren Sie grüne Fischembryonen und heben Sie sie zum Erwachsensein als F2 Generation Fisch. Hinweis: Grün und nicht-grüne Fischembryonen sollte in der Nähe von 1:1, wenn gibt es einen einzigen Transgen.</li>
	<li>Um elektrische mögliche Veränderungen im Tumor wie malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren (MPNST) anzuzeigen, überqueren Sie die F-2 -Generation Tg (Ubi: ASAP1) Fisch mit rpl35hi258/wt Fisch. Es ist bekannt, dass die sichtbare Tumoren beginnen in 6-8 Monate alte Erwachsene21,22zu finden.</li>
</ol>(5) Bildgebung
<ol><li>Bild von Zebrafisch-Embryonen, nehmen mehrere F2 Generation Gründer Fisch und mit Wildtyp-Fisch in einzelnen Paaren zu überqueren. Sammle Fischembryonen in unterschiedlichen gewünschte Entwicklungsstadien nach dem Zebrafisch Inszenierung Reiseführer23.</li>
	<li>Für die frühen Stadien von Fischembryonen schälen und Chorions der Embryonen mit einer Zange vorsichtig eine Dissektion Rahmen in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit Fischwasser System zu entfernen.</li>
	<li>Ein paar Fischembryonen in eine konkave Glas-Folie mit 3 % Methylcellulose mit einer Pipette 3,4 mL Einweg-Transfer zu übertragen. Passen Sie die Embryonen an die gewünschten Positionen, die Zellaktivität der GFP mit einer Nadel unter einem fluoreszierenden Dissektion Bereich anzuzeigen.</li>
	<li>Verwenden Sie für den beweglichen Phasen Fischembryonen (älter als 12 Somiten Bühne) 0,05 % Tricaine Mesylate, um den Fischembryonen zu betäuben, bevor Sie sie auf Folien übertragen. Kurz, waren Fischembryonen in 0,05 % Tricaine Mesylate in Fischwasser entstanden, bis sie schwimmen und Verlust Körperbalance gestoppt. Auch, Tropfen Sie einen 0,05 % Tricaine-Mesylat mit der Methylcellulose auf der Folie.</li>
	<li>Verwenden Sie für weniger als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Epi-Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem kompatiblen Kamera und Software für die Bildgebung. Verwenden Sie für älter als 12 Somiten Bühne Fischembryonen ein Fluoreszenzmikroskop Dissektion.</li>
	<li>Zu Bild Tumor Zellspannung, zuerst die Fische mit MPNST Tumoren zu identifizieren. Dann den Fisch mit 0,05 % Tricaine Mesylate zu betäuben. Für ganze Mount legen Bildgebung, Sie den Fisch in einem Durchmesser von 10 cm Petrischale. Um den Tumor Zelle elektrische Aktivität anzuzeigen, können Fische Tumoren, nach dem ganzen Berg Imaging seziert.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl die Mobilfunk- und Gewebe elektrische Aktivitäten während der embryonalen Entwicklung und Krankheit beim Menschen vor langer Zeit entdeckt wurden, bleiben die in Vivo dynamische elektrische Veränderungen und deren biologische Rollen noch weitgehend unbekannt. Eine der großen Herausforderungen ist zu visualisieren und zu quantifizieren, die elektrischen Veränderungen. Patch-Clamp-Technologie ist ein Durchbruch für die Verfolgung von Einzelzellen, aber seine Anwendung auf vertebrate Embryonen ist begrenzt, ...

Bioelektrizität bezieht sich auf endogene elektrische Signalisierung durch Ionenkanäle und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran1vermittelt. Ionischen Austausch über die Zellmembran und die gekoppelten elektrischen potenziellen und aktuellen Änderungen sind unerlässlich für die Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen. Bioelektrizität und Ion Steigungen haben darüber hinaus eine Vielzahl von anderen wichtigen biologischen Funktionen wie Energiespeicher, Biosynthese und Metabolit Transport. Bioelektrische Signale wurde auch als Regulator des embryonalen Musterbildung wie körperachsen, Zellzyklus und Zelle Differenzierung1entdeckt. Daher ist es wichtig für das Verständnis der vielen menschlichen Erbkrankheiten, die sich aus der MIS Verordnung dieser Art der Signalisierung. Obwohl Patch-Clamp ist weit verbreitet für die Aufnahme einzelner Zellen, ist es immer noch bei weitem nicht Ideal für die gleichzeitige Überwachung mehrerer Zellen während der Embryonalentwicklung in Vivo. Darüber hinaus sind sensible kleine Moleküle Spannung auch nicht ideal für in-Vivo Anwendungen aufgrund ihrer Besonderheiten, Empfindlichkeiten und Toxizitäten.
Die Schaffung einer Vielzahl von genetisch codiert fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) bietet einen neuen Mechanismus, um dieses Problem zu umgehen, und ermöglicht die einfache Anwendung, Embryonalentwicklung, zu studieren, obwohl sie ursprünglich, für die Überwachung der neuronalen bestimmt waren 2,3Zellen. Eines der derzeit verfügbaren GEVIs ist die beschleunigte Sensor Aktionspotentiale 1 (ASAP1)4. Es besteht aus einer extrazellulären Schleife einer Spannung-sensing Domäne Spannung empfindlich Phosphatase und ein Zirkular permutierte grün fluoreszierendes Protein. Daher erlaubt ASAP1 Visualisierung der elektrische mögliche Zellveränderungen (Polarisation: hellgrün; Depolarisation: dunkelgrün). ASAP1 hat 2 ms ein- und Kinetik und Eingangssignale mögliche Änderung4verfolgen können. So ermöglicht dieses genetische Tool für ein neues Maß an Effizienz in bioelektrische Echtzeitüberwachung in lebenden Zellen. Weitere Verständnis der Rollen der Bioelektrizität in der embryonalen Entwicklung und vielen menschlichen Krankheiten wie Krebs, wird werfen ein neues Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die für Behandlung und Prävention von entscheidender Bedeutung ist.
Zebrafisch nachweislich eine leistungsstarke Tiermodell, Entwicklungsbiologie und menschliche Krankheiten einschließlich Krebs5,6zu studieren. Sie 70 % ortholog Gene mit Menschen teilen, und sie haben ähnliche vertebrate Biologie7. Zebrafisch bieten relativ pflegeleicht, eine große Kupplung Größe von Eiern, gefügig Genetik, leicht Transgenese und transparente externe embryonale Entwicklung, wodurch sie ein überlegenes System für in-Vivo imaging5,6. Eine bedeutende Quelle von mutant Fisch Linien bereits vorhanden und ein vollständig sequenzierte Genom wird Zebrafisch relativ unbegrenzt vielfältige wissenschaftliche Entdeckungen bieten.
Um die in Vivo in Echtzeit elektrische Aktivität von Zellen zu untersuchen, nutzen wir die Zebrafisch Modellsystem und ASAP1. In diesem Papier wir beschreiben, wie das Zebrafish Genom Tol2 Transposon Transgenese mit fluoreszierenden Spannung Biosensor ASAP1 einzubauen, und elektrische Zellaktivität zu visualisieren, während der Embryonalentwicklung, Fische Larven Bewegung, und im live tumor .

<table><tbody><tr><td>14 ml Zellkulturröhrchen</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>E.Coli-Kultur</td></tr><tr><td>Agarose-Elektrophoresetank</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA-Eletrophorese</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Zur Herstellung der Injektionsgele</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F Primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>Amplifikation der ASAP1-kodierenden Region für die Subklonierung</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R Primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>ASAP1 kodierende Region-Amplifikation für die Subklonierung</td></tr><tr><td>Hellfeld-Dissektions-Scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Dechorionierung, Mikroinjektion, Montage</td></tr><tr><td>Farbkamera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Fischembryo Bildaufzeichnung</td></tr><tr><td>Konkaver Objektträger</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Zum Halten von Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses</td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipette 3,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Fischembryonen und Wassertransfer</td></tr><tr><td>Endonuklease-Enzym, nicht NEB</td><td></td><td>R0189L</td><td>Zur Linearisierung von Plasmid-DNA</td></tr><tr><td>Epifuoreszierendes Verbindungsendoskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Fisch Embryo-Bildgebung</td></tr><tr><td>Epifuoreszente Stereo-Dissektions-Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Embryo-Bildgebung von Fischen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzlichtquelle</td><td>Lumendynamik</td><td>X-cite seris 120</td><td>Lichtquelle für Fluoreszenzmikroskope</td></tr><tr><td>Pinzette #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionation und Nadelbruch</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzymmischung</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP Rekombinationsklonierung</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus Enzym</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR Rekombinationsklonierung</td></tr><tr><td>Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNA-Gel-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Ladespitze</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Zum Laden von Injektionslösung in Capilärnadeln</td></tr><tr><td>Methylcellulose (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Fischembryo-Montage</td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Unterdrückt Pilzausbrüche in Petrischalen</td></tr><tr><td>Mikrospritzgussform</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Zur Vorbereitung der Agaorse-Formschale für die Aufbewahrung von Fischembryonen während der Injektion</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>WPI</td><td>Pneumatische Picopump PV820</td><td>Mikroinjektionsinjektor</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>WPI</td><td>Mikroinjektor MM3301R</td><td>Mikroinjektionsbetrieb</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Zur Vorbereitung der Kapillarnadel</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Zur Kalibrierung des Injektionsvolumens</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA in vitro Transkription</td></tr><tr><td>Monocolor Kamera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Bildaufzeichnung von Fischembryonen</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Bereiten Sie eine kleine Menge Plasmid-DNA</td></tr> vor <tr><td>Petrischalen aus Kunststoff</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Zum Halten von Fischen oder Fischembryonen während des Bildgebungsprozesses</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA-Reinigung nach der In-vitro-Transkription</td></tr><tr><td>Spektrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Zur Messung von DNA- und RNA-Konzentrationen</td></tr><tr><td>Tischmikrometer</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Mikroinjektionsvolumenkalibrierung</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>DNA-Amplifikation für die Genklonierung</td></tr><tr><td>Dünnwandig Glaskapillaren</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Rohglas zur Herstellung von Kappilarnadeln</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 Primer</td><td>IDT DNA</td><td>GCAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 Excise</td></tr><tr><td>Assay Tol2-exR Primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 Excise Assay</td></tr><tr><td>TOP10 Chemisch kompetente E. coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Wird für die Transformation während der Genklonierung verwendet</td></tr><tr><td>Tricainmesylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Zur Betäubung von Fischen oder Fischembryonen</td></tr><tr><td>UV-Transilluminator 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNA-Visualisierung</td></tr><tr><td></td><td>Wasserbad Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Für den Transformationsprozess der Genklonierung</td></tr></tbody></table>

visualisierung von zellulären elektrische aktivität im frühen zebrafish embryos und tumoren

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelektrizität, endogene elektrische Signalisierung von Ionenkanälen vermittelt und Pumpen befindet sich auf der Zellmembran, spielt eine wichtige Rolle bei der Signalisierung Prozesse des erregbare muskulären und neuronalen Zellen und viele andere biologische Prozesse, wie z. B. embryonale Developmental Musterung. Allerdings gibt es eine Notwendigkeit für die in Vivo Überwachung elektrische Aktivität in vertebrate Embryogenese. Die Fortschritte der genetisch codierten fluoreszierende Spannung Indikatoren (GEVIs) machten es möglich, eine Lösung für diese Herausforderung zu bieten. Wir beschreiben hier, wie erstelle ich eine transgene Spannung Indikator Zebrafisch mit den etablierten Spannungsanzeige ASAP1 (beschleunigte Sensor von Aktionspotentialen 1), als Beispiel. Das Tol2-Kit und einem allgegenwärtigen Zebrafisch-Promotor, Ubi, wurden in dieser Studie ausgewählt. Wir erklären auch die Prozesse der Gateway ortsspezifische Klonen, Tol2 Transposon-basierte Zebrafisch Transgenese und den imaging-Prozess für Frühphasen-Fisch Embryonen und Fisch Tumoren mit regelmäßigen Epifluorescent Mikroskope. Mit diesem Fisch-Linie, fanden wir, dass während der Embryogenese Zebrafisch und Fische Larven Bewegung gibt es zelluläre elektrische Spannungsänderungen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass in ein paar Zebrafisch malignen peripheren Nerven Scheide Tumoren, Tumor, die Zellen in der Regel polarisiert waren im Vergleich zu das umliegende normale Gewebe.

In einer erfolgreichen Injektion, mehr als 50 % injiziert Fischembryonen zeigt ein gewisses Maß an grünen Fluoreszenz in den somatischen Zellen, und die meisten von ihnen werden positiv von Tol2 Transposon Verbrauchsteuern Assay (Abbildung 2). Nach 2-4 Generationen von Out-Kreuz mit Wildtyp-Fisch (bis der fluoreszierenden Fisch 50 %, die erwarteten Mendelian Verhältnis erreichen), wurden die transgene Fische für das imaging Experiment zur Zellmembran Potentia...

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine transgene Zebrafischlinie zu schaffen, die es ermöglicht, zelluläre elektrische Veränderungen während der Embryogenese, der Larvenbewegung und der Tumorgenese zu beobachten. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie, Physiologie und Krebszellbiologie zu beantworten, wie z. B. welche grundlegende Rolle die zelluläre elektrische Signalübertragung während der Embryogenese und in Tumorzellen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die zelluläre elektrische Signalübertragung in vivo und in Echtzeit zu verfolgen.Nach der Herstellung der Tol2-Transposase-mRNA und der Injektionslösung gemäß dem Textprotokoll werden am Nachmittag vor der Injektion vier bis sechs Aufzuchtbecken mit mindestens zwei Männchen und zwei Weibchen eingerichtet. Um die Menge an Fischabfällen zu reduzieren und eine Brutreaktion zu induzieren, vermeiden Sie es, die Fische am Nachmittag zu füttern. Nehmen Sie am nächsten Morgen die vorbereitete Injektionslösung aus dem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis.Ziehen Sie die Trennwände in den Zuchtbecken und lassen Sie die Fische sich paaren. In der Regel legen Fische innerhalb von 20 bis 30 Minuten Eier. Ziehen Sie während des Wartens mit einem Mikropipettenabzieher mit den folgenden Parametern die Nadeln aus dem Kapillarglas.Verwende ein Labortuch, um das Ende der Nadel zu brechen und eine abgeschrägte Kante zu erzeugen. Ein kleinerer Durchmesser wird bevorzugt, um die Sterblichkeit der Embryonen zu verringern. Sobald die Fische Eier gelegt haben, sammeln Sie sie in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern.Entfernen Sie sofort unter dem Präpariermikroskop alle abnormalen Embryonen und Fischabfälle. Pipettieren Sie dann die befruchteten Embryonen in eine vorbereitete 3%Agarose-Spritzgussform. Entferne überschüssiges Wasser, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.Sobald alle Reihen mit lebensfähigen Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so an, dass die einzelnen Zellen alle in einem 45-Grad-Winkel horizontal zur Nadel ausgerichtet sind. Dies erleichtert die spätere Injektion erheblich. Verwenden Sie anschließend mit Handschuhen eine 20-Mikroliter-Ladepipettenspitze, um fünf Mikroliter des vorbereiteten Konstrukts aus dem Röhrchen auf Eis zu entfernen.Führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in das hintere Ende des gebrochenen Kapillarrohrs ein, bis es sich zu verjüngen beginnt, um das Reagenz so nah wie möglich an die Spitze zu bringen und in die Kapillare auszustoßen. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, schütteln Sie die Nadel und achten Sie darauf, dass die Spitze nicht bricht. Führen Sie die Nadel gerade in den Mikroinjektionsnadelhalter ein und ziehen Sie sie vorsichtig fest, bis die Nadel an Ort und Stelle bleibt.Stellen Sie dann den Winkel auf ca. 45 Grad ein. Sobald die Nadel vorbereitet und angebracht ist, schalten Sie das Mikroskop und den Gasdruckbehälter ein. Passen Sie das Injektionsvolumen an, indem Sie ca. 0,5 PSI für das Halten und 30 PSI für den Auswurf verwenden.Prüfen Sie, ob die Lösung beim Drücken des Pedals aus der Nadel austritt. Stellen Sie mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl das Volumen und den Durchfluss der Lösung auf einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern ein. Stellen Sie sicher, dass durch den Gegendruck eine kleine Menge Lösung aus der Nadel tropfen kann.Wenn nicht genügend Gegendruck vorhanden ist, führt die Kapillarwirkung dazu, dass Flüssigkeit in die Nadel eindringt und die mRNA zerstört. Sobald die Nadel kalibriert ist, führen Sie die Nadel in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen ein, indem Sie den Rand der Gelkerbe verwenden, um eine Unterlage zu schaffen, die den Embryo an Ort und Stelle hält und es der Nadel ermöglicht, Druck auszuüben, ohne den Embryo zu bewegen. Sobald sich die Spitze der Nadel in der Einzelzelle befindet, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge der Lösung freizusetzen.Für die Erzeugung von transgenen Zebrafischen ist es wichtig, die Lösung und nicht das Eigelb in die Zelle zu injizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Embryonen. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine 3,4-Milliliter-Transferpipette und Fischsystemwasser, um die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale zu übertragen, indem Sie sie aus der Agarosekerbe spülen.Lagern Sie die Embryonen in einem 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sie sich entwickeln können. Schauen Sie im Laufe des Tages regelmäßig vorbei, um tote Fischembryonen zu entfernen und das Wasser durch 0,1 % Methylenblau im Fischwasser zu ersetzen. Etwa sechs bis acht Stunden nach der Injektion verwenden Sie 10 injizierte Fischembryonen und die Hotshot-Methode, um genomische DNA herzustellen.Verwenden Sie am nächsten Morgen ein Präpariermikroskop mit einer Fluoreszenzlichtquelle, um die Embryonen zu sortieren, die GFP im Nicht-Dottergewebe zeigen. Diese Embryonen sollten das injizierte Konstrukt enthalten. Führen Sie einen Tol2-Verbrauchsteuertest durch, um die Transposon-Aktivität wie zuvor beschrieben zu überprüfen.Wenn exzidiertes Plasma nachgewiesen werden kann, bewahren Sie die injizierten Fischembryonen auf und ziehen Sie sie auf. Andernfalls wiederholen Sie die Tol2-mRNA-Synthese und den Mikroinjektionsprozess, bis Sie positive Ergebnisse mit dem Tol2-Excise-Assay erzielen. Um Zebrafischembryonen abzubilden, kreuzen Sie mehrere Gründerfische der F2-Generation mit Wildtyp-Fischen in Einzelpaaren.Sammeln Sie Fischembryonen in verschiedenen gewünschten Entwicklungsstadien gemäß dem Zebrafisch-Staging-Leitfaden. Verwenden Sie für die Fischembryonen im Frühstadium im Wasser des Fischsystems unter einem Präparierbereich eine Pinzette, um die Chorionen vorsichtig zu schälen und zu entfernen. Verwenden Sie eine Entsorgungstransferpipette, um einige Embryonen in einen konkaven Objektträger mit 3% Methylcellulose zu übertragen.Bringen Sie dann mit einer Nadel unter einem Präpariergerät die Embryonen in die gewünschten Positionen, um die zelluläre GFP-Aktivität zu sehen. Verwenden Sie für Embryonen im Somitenstadium von weniger als 12 Jahren ein Epifluoreszenz-Verbindungsmikroskop mit einer kompatiblen Kamera und Software für die Bildgebung. Bei Embryonen, die das 12-Somiten-Stadium überschritten haben, verwenden Sie ein Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop.Um die Spannung der Tumorzellen abzubilden, identifizieren Sie zunächst Fische mit malignen Tumoren der peripheren Nervenscheide (MPNST). Legen Sie den Fisch in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern und führen Sie eine Bildgebung der gesamten Halterung durch. Nach der Bildgebung sezieren Sie schließlich den Tumor, bevor Sie die elektrische Aktivität der Tumorzellen betrachten.Bei einer erfolgreichen Injektion weisen mehr als 50 % der injizierten Embryonen ein gewisses Maß an GFP in den somatischen Zellen auf, und die meisten von ihnen zeigen ein positives Ergebnis des Tol2-Transposon-Verbrauchsteuertests. In dieser Arbeit wurden Veränderungen des Membranpotentials während des gesamten Zellzyklus während der frühen Embryonalentwicklung des Zebrafisches untersucht. Wie in diesem Zeitraffervideo zu sehen ist, hyperpolarisierten sich die Zellen, bevor sich die Spaltfurche bildete.Darüber hinaus zeigten verschiedene Gewebe eine Vielzahl von Membranpotentialen in ein- bis drei Tage alten Fischembryonen. Zum Beispiel waren Somiten und Notocord im Vergleich zu den angrenzenden Geweben und Organen im Allgemeinen hyperpolarisiert. In diesem zwei Tage alten Fischembryo zeigen sich neuromuskuläre elektrische Aktivitäten während der Bewegung mit Farbdichteänderungen, die der elektrischen Signaltransduktion entsprechen.Die bioelektrischen Eigenschaften von Krebszellen wurden in Embryonen aus Kreuzungen von ASAP1-Reporterfischen mit einer RPL35-Mutante untersucht, die anfällig für spontanes MPNST ist. Im Vergleich zu umgebenden Geweben waren Tumorzellen stärker polarisiert. Einmal gemeistert, kann diese Mikroinjektionstechnik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass sich die Zebrafischembryonen für ideale Ergebnisse im Ein-Zell-Stadium befinden sollten. Mit ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie und Zellbiologie den Weg, um in vivo elektrische Signalveränderungen im Zebrafisch und anderen Modellorganismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine transgene Zebrafischlinie durch Mikroinjektion erstellt.

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

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Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

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Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

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