Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine transgene Zebrafischlinie zu schaffen, die es ermöglicht, zelluläre elektrische Veränderungen während der Embryogenese, der Larvenbewegung und der Tumorgenese zu beobachten. Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie, Physiologie und Krebszellbiologie zu beantworten, wie z. B. welche grundlegende Rolle die zelluläre elektrische Signalübertragung während der Embryogenese und in Tumorzellen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die zelluläre elektrische Signalübertragung in vivo und in Echtzeit zu verfolgen.

Nach der Herstellung der Tol2-Transposase-mRNA und der Injektionslösung gemäß dem Textprotokoll werden am Nachmittag vor der Injektion vier bis sechs Aufzuchtbecken mit mindestens zwei Männchen und zwei Weibchen eingerichtet. Um die Menge an Fischabfällen zu reduzieren und eine Brutreaktion zu induzieren, vermeiden Sie es, die Fische am Nachmittag zu füttern. Nehmen Sie am nächsten Morgen die vorbereitete Injektionslösung aus dem Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis.

Ziehen Sie die Trennwände in den Zuchtbecken und lassen Sie die Fische sich paaren. In der Regel legen Fische innerhalb von 20 bis 30 Minuten Eier. Ziehen Sie während des Wartens mit einem Mikropipettenabzieher mit den folgenden Parametern die Nadeln aus dem Kapillarglas.

Verwende ein Labortuch, um das Ende der Nadel zu brechen und eine abgeschrägte Kante zu erzeugen. Ein kleinerer Durchmesser wird bevorzugt, um die Sterblichkeit der Embryonen zu verringern. Sobald die Fische Eier gelegt haben, sammeln Sie sie in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern.

Entfernen Sie sofort unter dem Präpariermikroskop alle abnormalen Embryonen und Fischabfälle. Pipettieren Sie dann die befruchteten Embryonen in eine vorbereitete 3%Agarose-Spritzgussform. Entferne überschüssiges Wasser, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.

Sobald alle Reihen mit lebensfähigen Embryonen gefüllt sind, ordnen Sie sie so an, dass die einzelnen Zellen alle in einem 45-Grad-Winkel horizontal zur Nadel ausgerichtet sind. Dies erleichtert die spätere Injektion erheblich. Verwenden Sie anschließend mit Handschuhen eine 20-Mikroliter-Ladepipettenspitze, um fünf Mikroliter des vorbereiteten Konstrukts aus dem Röhrchen auf Eis zu entfernen.

Führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in das hintere Ende des gebrochenen Kapillarrohrs ein, bis es sich zu verjüngen beginnt, um das Reagenz so nah wie möglich an die Spitze zu bringen und in die Kapillare auszustoßen. Wenn noch Luftblasen vorhanden sind, schütteln Sie die Nadel und achten Sie darauf, dass die Spitze nicht bricht. Führen Sie die Nadel gerade in den Mikroinjektionsnadelhalter ein und ziehen Sie sie vorsichtig fest, bis die Nadel an Ort und Stelle bleibt.

Stellen Sie dann den Winkel auf ca. 45 Grad ein. Sobald die Nadel vorbereitet und angebracht ist, schalten Sie das Mikroskop und den Gasdruckbehälter ein. Passen Sie das Injektionsvolumen an, indem Sie ca. 0,5 PSI für das Halten und 30 PSI für den Auswurf verwenden.

Prüfen Sie, ob die Lösung beim Drücken des Pedals aus der Nadel austritt. Stellen Sie mit einem Tischmikrometer mit einem Tropfen Mineralöl das Volumen und den Durchfluss der Lösung auf einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern ein. Stellen Sie sicher, dass durch den Gegendruck eine kleine Menge Lösung aus der Nadel tropfen kann.

Wenn nicht genügend Gegendruck vorhanden ist, führt die Kapillarwirkung dazu, dass Flüssigkeit in die Nadel eindringt und die mRNA zerstört. Sobald die Nadel kalibriert ist, führen Sie die Nadel in die einzelne Zelle der befruchteten Embryonen ein, indem Sie den Rand der Gelkerbe verwenden, um eine Unterlage zu schaffen, die den Embryo an Ort und Stelle hält und es der Nadel ermöglicht, Druck auszuüben, ohne den Embryo zu bewegen. Sobald sich die Spitze der Nadel in der Einzelzelle befindet, drücken Sie das Pedal, um die gewünschte Menge der Lösung freizusetzen.

Für die Erzeugung von transgenen Zebrafischen ist es wichtig, die Lösung und nicht das Eigelb in die Zelle zu injizieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Embryonen. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine 3,4-Milliliter-Transferpipette und Fischsystemwasser, um die injizierten Embryonen in eine beschriftete Schale zu übertragen, indem Sie sie aus der Agarosekerbe spülen.

Lagern Sie die Embryonen in einem 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, damit sie sich entwickeln können. Schauen Sie im Laufe des Tages regelmäßig vorbei, um tote Fischembryonen zu entfernen und das Wasser durch 0,1 % Methylenblau im Fischwasser zu ersetzen. Etwa sechs bis acht Stunden nach der Injektion verwenden Sie 10 injizierte Fischembryonen und die Hotshot-Methode, um genomische DNA herzustellen.

Verwenden Sie am nächsten Morgen ein Präpariermikroskop mit einer Fluoreszenzlichtquelle, um die Embryonen zu sortieren, die GFP im Nicht-Dottergewebe zeigen. Diese Embryonen sollten das injizierte Konstrukt enthalten. Führen Sie einen Tol2-Verbrauchsteuertest durch, um die Transposon-Aktivität wie zuvor beschrieben zu überprüfen.

Wenn exzidiertes Plasma nachgewiesen werden kann, bewahren Sie die injizierten Fischembryonen auf und ziehen Sie sie auf. Andernfalls wiederholen Sie die Tol2-mRNA-Synthese und den Mikroinjektionsprozess, bis Sie positive Ergebnisse mit dem Tol2-Excise-Assay erzielen. Um Zebrafischembryonen abzubilden, kreuzen Sie mehrere Gründerfische der F2-Generation mit Wildtyp-Fischen in Einzelpaaren.

Sammeln Sie Fischembryonen in verschiedenen gewünschten Entwicklungsstadien gemäß dem Zebrafisch-Staging-Leitfaden. Verwenden Sie für die Fischembryonen im Frühstadium im Wasser des Fischsystems unter einem Präparierbereich eine Pinzette, um die Chorionen vorsichtig zu schälen und zu entfernen. Verwenden Sie eine Entsorgungstransferpipette, um einige Embryonen in einen konkaven Objektträger mit 3% Methylcellulose zu übertragen.

Bringen Sie dann mit einer Nadel unter einem Präpariergerät die Embryonen in die gewünschten Positionen, um die zelluläre GFP-Aktivität zu sehen. Verwenden Sie für Embryonen im Somitenstadium von weniger als 12 Jahren ein Epifluoreszenz-Verbindungsmikroskop mit einer kompatiblen Kamera und Software für die Bildgebung. Bei Embryonen, die das 12-Somiten-Stadium überschritten haben, verwenden Sie ein Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop.

Um die Spannung der Tumorzellen abzubilden, identifizieren Sie zunächst Fische mit malignen Tumoren der peripheren Nervenscheide (MPNST). Legen Sie den Fisch in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern und führen Sie eine Bildgebung der gesamten Halterung durch. Nach der Bildgebung sezieren Sie schließlich den Tumor, bevor Sie die elektrische Aktivität der Tumorzellen betrachten.

Bei einer erfolgreichen Injektion weisen mehr als 50 % der injizierten Embryonen ein gewisses Maß an GFP in den somatischen Zellen auf, und die meisten von ihnen zeigen ein positives Ergebnis des Tol2-Transposon-Verbrauchsteuertests. In dieser Arbeit wurden Veränderungen des Membranpotentials während des gesamten Zellzyklus während der frühen Embryonalentwicklung des Zebrafisches untersucht. Wie in diesem Zeitraffervideo zu sehen ist, hyperpolarisierten sich die Zellen, bevor sich die Spaltfurche bildete.

Darüber hinaus zeigten verschiedene Gewebe eine Vielzahl von Membranpotentialen in ein- bis drei Tage alten Fischembryonen. Zum Beispiel waren Somiten und Notocord im Vergleich zu den angrenzenden Geweben und Organen im Allgemeinen hyperpolarisiert. In diesem zwei Tage alten Fischembryo zeigen sich neuromuskuläre elektrische Aktivitäten während der Bewegung mit Farbdichteänderungen, die der elektrischen Signaltransduktion entsprechen.

Die bioelektrischen Eigenschaften von Krebszellen wurden in Embryonen aus Kreuzungen von ASAP1-Reporterfischen mit einer RPL35-Mutante untersucht, die anfällig für spontanes MPNST ist. Im Vergleich zu umgebenden Geweben waren Tumorzellen stärker polarisiert. Einmal gemeistert, kann diese Mikroinjektionstechnik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass sich die Zebrafischembryonen für ideale Ergebnisse im Ein-Zell-Stadium befinden sollten. Mit ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie und Zellbiologie den Weg, um in vivo elektrische Signalveränderungen im Zebrafisch und anderen Modellorganismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine transgene Zebrafischlinie durch Mikroinjektion erstellt.