Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Beginnen Sie mit einem lebenden, dechorionierten transgenen Zebrafischembryo, der in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und in eine mit Embryomedien gefüllte Kammer gelegt wird.

Der Embryo exprimiert verstärkte, mit grün fluoreszierendem Protein (EGFP) markierte Neuralleistenzellen.

Positionieren Sie die Kammer auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie das Objektiv mit Hellfeldbeleuchtung so ein, dass es den Embryo im Sichtfeld fokussiert und zentriert.

Wechseln Sie zum Wasser-Immersionsobjektiv und konzentrieren Sie sich wieder auf den Embryo.

Passen Sie die Bildgebungsparameter an, um Z-Stapel-Bilder vom lateralen bis zum medialen Rand aufzunehmen und die Breite des Auges zu erfassen.

Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung aus, decken Sie die Bühne ab und starten Sie die Zeitrafferaufnahme.

Füllen Sie die Kammer während der Bildgebung nach Bedarf mit Medien auf.

Unter Laserbeleuchtung fluoreszieren die Neuralleistenzellen.

Visualisieren Sie die Wanderung dieser Zellen aus dem Neuralrohr in die kraniofazialen Regionen, um das sich entwickelnde Auge zu umgeben, um das periokulare Mesenchym und den frontonasalen Prozess zu besiedeln, und ventral, um die Pharynxbögen zu bilden.

Nachdem Sie das gesamte Setup gemäß dem Textprotokoll auf den Tisch des Mikroskops gelegt haben, verwenden Sie das Fünffachobjektiv, um den Embryo zu lokalisieren. Heben Sie dann den Tisch manuell in die höchste Position und positionieren Sie den Embryo mit dem Feinfokus in der Mitte des Mikroskopbereichs.

Senken Sie den Tisch manuell ab und ändern Sie das fünffache Ziel in das 25-fache Wasserimmersionsobjektiv. Heben Sie die Bühne vorsichtig an, um den Embryo wieder in den Fokus zu bringen. Klicken Sie in der Software auf den xyzt-Modus, um mehrere Bilder gleichzeitig oder in t-Intervallen in der xy-Ebene über eine Tiefe von z zu erhalten.

Verwenden Sie die Epifluoreszenz- oder Hellfeldansicht, um die Tiefenschärfe im interessierenden Bereich zu ermitteln, die den Z-Stapel abgrenzt. Bei diesen Experimenten ist der laterale Rand des Auges der Anfang des Z-Stapels. Wenn Sie hier in der Software fokussiert sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Beginnen. Nachdem Sie bis zur Mittellinie des Embryos fokussiert haben, d. h. am Ende des Z-Stapels, klicken Sie auf die Schaltfläche Ende.

Ein wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der Z-Schritt den Interessenbereich umfasst. In unserem Fall wollen wir die Breite des Auges von den lateralen bis zu den medialen Rändern erfassen.

Klicken Sie auf das Menü, um die Aufnahmezeit und die Bildfrequenz anzupassen. Für eine angemessene Rückgewinnung des Fluorophors und das Überleben des Embryos ist ein Verhältnis von mindestens 1 zu 3 zwischen der Aufnahme des Z-Stapels bei eingeschalteter Laserleistung und der Erholungszeit bei ausgeschalteter Laserleistung zu berücksichtigen. Legen Sie mit der entsprechenden Zeit für die Embryogenesung die Zeit zwischen den Z-Stapeln und dem angegebenen Fenster fest. Legen Sie dann die Gesamtdauer des Experiments im entsprechenden Fenster fest.

Schalten Sie nun die Livebild-Einstellung ein, um letzte Anpassungen an den Lasereinstellungen vorzunehmen. Passen Sie die Schieberegler für Lasertransmission, Verstärkung und Versatz in der Software an, um das Fluoreszenzbild zu optimieren. Passen Sie auch die Ausrichtung des Embryos nach Bedarf an, abhängig von der Länge des Experiments, dem erwarteten Wachstum des Embryos usw. Stellen Sie sicher, dass der Interessenbereich während der gesamten Dauer des Experiments innerhalb des Rahmens bleibt.

Schalten Sie während der Zeitrafferaufnahme die Epifluoreszenzlichtquelle aus. Decken Sie die Bühne mit der Laserschutzbox ab, die zum Schutz vor Hintergrundlicht ausreichend ist. Drücken Sie dann Start.

Betreten Sie die offene Badekammer durch die Schiebetüren an der Lasersicherheitsbox, um sie alle 8 bis 12 Stunden mit Zeitraffer-Embryomedium zu befüllen. Öffnen Sie nach der Bildaufnahme die Dateien in der Bildverarbeitungssoftware. Markieren Sie die richtige Bildserie.

Wählen Sie in der Software das Menü Prozess. Klicken Sie auf 3D-Entfaltung und wenden Sie an, um jeden Z-Stapel zu entfalten. Importieren Sie einzelne TIFF-Dateien in eine Videoverarbeitungssoftware. Wählen Sie dann alle TIFF-Dateien aus und ziehen Sie sie in den Video-Editor. Passen Sie die Länge jedes Bildes innerhalb des Videos auf 0,1 Sekunden an. Exportieren Sie abschließend das Video als MOV- oder MP4-Datei.