Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Diese Methoden vereinfachen die Erzeugung von Thioether-gebundenen zyklischen Peptiden aufgrund der Verwendung der Thio-en- oder Thio-yn-Click-Chemie, die eine überlegene Toleranz gegenüber funktionellen Gruppen und eine gute Ausbeute besitzt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein Thioether-Tether eine spurlose Modifikationsstelle bietet, die den chemischen Raum stabiler Peptide nach der Modifikation der Peptidsynthese erheblich erweitert. Um den Vorgang zu starten, befestigen Sie eine mit 50 Milligramm Rink Amide MBHA-Harz gefüllte Säule über einen Dreiwege-Absperrhahn sowohl an einen Tisch-Vakuumverteiler als auch an eine Stickstoff- oder Argongasleitung.

Geben Sie ein bis zwei Milliliter Dichlormethan in das Harzbett und quellen Sie das Harz auf, indem Sie die Mischung 10 Minuten lang vorsichtig mit einem Strom von Inertgasblasen bewegen. Lassen Sie das Harz mit einer Gummipipettenbirne abtropfen, wenn Sie fertig sind. Fügen Sie dann ein bis zwei Milliliter N-terminale Fmoc-Entschützungslösung zum Harz hinzu.

Rühren Sie die Mischung vorsichtig um, indem Sie sie 10 Minuten lang mit Inertgas sprudeln lassen, und lassen Sie das Harz dann mit einem Gummipipettenkolben ab. Waschen Sie die Säule auf die gleiche Weise mit ein bis zwei Millilitern DMF, gefolgt von ein bis zwei Millilitern DCM. Wiederholen Sie die Entschützungssequenz einmal.

Kombinieren Sie als nächstes 0,125 Millimol einer Fmoc-geschützten Aminosäure und 50,5 Milligramm HCTU mit 0,5 Millilitern DMF in einem Polypropylenbehälter. Schütteln Sie die Mischung eine Minute lang, um die Feststoffe aufzulösen. Fügen Sie dann 43,5 Mikroliter DIPEA hinzu und schütteln Sie den Behälter eine weitere Minute lang, um eine 0,25-molare aktivierte Aminosäurelösung zu erhalten.

Geben Sie diese Lösung zum gewaschenen Harz und lassen Sie ein bis zwei Stunden lang Inertgas durch die Mischung blasen. Danach entschützen und waschen Sie den gebundenen Aminosäurerest. Koppeln Sie Aminosäuren auf diese Weise weiter an die Peptidkette, um das lineare Peptid zu bilden.

Verwenden Sie die Festphasen-Peptidsynthese, um ein Harz herzustellen, das ein lineares Peptid unterstützt, das einen Trityl-geschützten Cysteinrest enthält, der durch drei Einheiten von einem Mono-S-Fünf-Rest getrennt ist. Geben Sie ein bis zwei Milliliter Trityl-Entschützungslösung zu 50 Milligramm des peptidhaltigen Harzes. Blasen Sie Stickstoffgas 10 Minuten lang durch das Gemisch.

Lassen Sie die Entschützungslösung ab und waschen Sie das Harz dreimal mit einem bis zwei Millilitern DCM. Wiederholen Sie den Entschützungsvorgang sechsmal oder bis die Lösung nicht mehr gelb erscheint, um das Cystein vollständig zu entschützen. Die vollständige Entschützung der Trt-Gruppe von Cystein ist für den folgenden Photoreaktionsschritt sehr wichtig.

Waschen Sie das Harz nacheinander mit ein bis zwei Millilitern DMF und DCM. Weichen Sie das Harz dann zwei Minuten lang in ein bis zwei Millilitern Methanol ein, um das Harz zu schrumpfen. Lassen Sie das Methanol ab und trocknen Sie das Harz fünf Minuten lang mit Stickstoffgas.

Übertragen Sie das trockene Harz über Wägepapier in einen 10-Milliliter-Kolben mit rundem Boden. Suspendieren Sie das Harz in zwei Millilitern stickstoffhaltigem DMF. Fügen Sie dann 5,6 Milligramm MMP und 38 Milligramm MAP als Photoinitiatoren hinzu.

Legen Sie einen Rührstab in den Kolben und verschließen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum. Die Kolbenatmosphäre wird dreimal mit Stickstoffgas gespült, was eine Gesamtspülzeit von etwa fünf Minuten ergibt. Der Reaktionskolben wird in einem Photoreaktor befestigt, der mit UVA-Lampen, einem Einlass für inertes Stickstoffgas und einer Rührplatte ausgestattet ist.

Beginnen Sie mit dem Rühren der Mischung und schließen Sie den Photoreaktor. Spülen Sie den Photoreaktor 10 Minuten lang mit Argon. Stellen Sie dann die Argonflussrate auf einen Liter pro Minute ein und bestrahlen Sie das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit UVA-Licht.

Überwachen Sie die Reaktion mit HPLC. Waschen, spalten und reinigen Sie das zyklische Peptid, wenn es fertig ist. Bereiten Sie 50 Milligramm Harz vor, das ein lineares Peptid enthält, das einen gammasubstituierten Mono-S-Fünf-Rest enthält.

Waschen Sie das Harz nacheinander mit DMF und DCM. Schrumpfen Sie das Harz mit Methanol und trocknen Sie es mit Stickstoffgas. Anschließend wird das Harz in einem 10-Milliliter-Kolben mit rundem Boden in zwei Millilitern stickstoffhaltigem DMF suspendiert.

Fügen Sie der Mischung 5,6 Milligramm MMP, 3,8 Milligramm MAP und 25,7 Milligramm Fmoc-geschütztes Cystein hinzu. Geben Sie einen Rührstab in den Kolben, verschließen Sie ihn mit einem Gummiseptum und reinigen Sie die Kolbenatmosphäre mit Stickstoffgas. Bestrahlen Sie dann das Gemisch in einem mit inertem Stickstoffgas gefüllten Photoreaktor mit UVA-Licht, während Sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.

Überwachen Sie die Reaktion mit LC-MS. Wenn die Photoreaktion abgeschlossen ist, waschen Sie das gebundene Peptid und führen Sie die Makrolaktamisierungsreaktion durch. Setzen Sie anschließend die Kopplung von Aminosäuren an das zyklische Peptid fort, um die gewünschte Struktur zu bilden.

Spalten und reinigen Sie das Peptid, wenn es fertig ist. Bereiten Sie 50 Milligramm Harz vor, das ein lineares Peptid enthält, das einen Rückstand mit einem terminalen Alkin enthält, das durch drei Einheiten von einem Rückstand mit einem terminalen Thiol getrennt ist. Trennen Sie das Peptid vom Harz und fällen Sie es mit einem Milliliter kaltem Diethylether aus.

Zentrifugieren Sie das Peptidgemisch bei 12.000 g für zwei Minuten. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und fügen Sie einen weiteren Milliliter kalten Diethylether hinzu. Wiederholen Sie das Waschen noch zweimal und trocknen Sie dann den Peptidrückstand unter Vakuum.

Der Rückstand wird in 50 Millilitern stickstoffhaltigem DMF in einem Rundkolben gelöst. Geben Sie 3,2 Milligramm DMPA in die Peptidlösung und blasen Sie Stickstoff 10 Minuten lang durch das Reaktionsgemisch. Eine inerte Atmosphäre ist für eine effektive Thio-Yn-Photoreaktion in einer Lösungsphase unbedingt erforderlich.

Ansonsten beobachteten wir eine Oxidation von Schwefel während der UV-Bestrahlung. Bestrahlen Sie dann das Gemisch ohne Rühren in einem mit inertem Stickstoffgas gefüllten Photoreaktor bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis eine Stunde mit UVA-Licht. Isolieren und reinigen Sie das zyklische Peptid, wenn es fertig ist.

Die On-Resin-Cyclisierung dieses Peptids erzeugte ein Thioether-gebundenes ein, fünf cyclisches Peptid mit einem identischen Molekulargewicht wie das lineare Peptid. Die HPLC-Retentionszeit des zyklischen Produkts war zwei Minuten kürzer als die des linearen Peptids. Eine gute Umwandlung wurde auch für die On-Resin-Cyclisierung mehrerer anderer kurzer Peptide beobachtet.

Lineare Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Peptidheftung durch photoinduzierte Thiol-Yn-Hydrothiolierung untersucht. Die geringe Ausbeute von zwei c wurde auf eine Konformationspräferenz für das Einfangen des Thiylradikals am N-Terminus während der Kontraktion zu einem 20-gliedrigen Makrozyklus zurückgeführt. Die Peptide eins a und eins b erzeugten beide zwei Isomere mit einer achtgliedrigen Vinylsulfid-Vernetzung.

Die Produktpeptide zwei a-A und zwei a-b wiesen unterschiedliche Retentionszeiten auf und wurden in unterschiedlichen Verhältnissen zu unterschiedlichen Bestrahlungszeiten hergestellt. Die Protonen-NMR-Spektroskopie zeigte, dass zwei a-A das E-Isomer des Vinylsulfids und zwei a-B das Z-Isomer waren. Das Z-Isomer war das Hauptprodukt bei der Bildung der Peptide zwei d, zwei e und zwei f, was auf die Konformationspräferenz während der Bildung des siebengliedrigen Vinylsulfid-Vernetzungs zurückgeführt wurde.

Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie zeigte eine zufällige Spirale für alle Formen von Peptiden zwei a und zwei b und eine helikale Konformation für das Peptid zwei d. Wir haben eine Reihe chemischer Protokolle für die Konstruktion von Thioether- und Vinylsulfid-gebundenen Peptiden unter Verwendung der photoinduzierten Thio-en- und Thio-Yn-Click-Chemie entwickelt. Wir glauben, dass es für die Forschungsgemeinschaft hilfreich sein wird.