Name: Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Synthese thioether-verknüpfter zyklischer Peptide durch photoinduzierte Thiol-En/Yn-Hydrothiolation. Diese Methode nutzt Click-Chemie für hohe Ausbeuten und funktionelle Gruppentoleranz.

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Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung durch die Natural Science Foundation von China Grants (Nr. 21372023, 21778009 und 81701818); Das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China (Nr. 2015DFA31590); die Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 und GJHS20170310093122365); und die China Postdoc Wissenschaftsstiftung (Nr. 2017 M 610704).

1. Ausrüstung Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie für die manuelle Peptid-Synthese-Apparat einen Vakuum-Verteiler (Table of Materials) in einen effizienten Abzug. Als nächstes legen Sie drei-Wege-Hähne auf Vakuum Krümmer und verbinden Sie diese mit Stickstoff oder Argon Gas-Linie. Verschließen Sie alle unbenutzten Eingänge mit Kautschuk Septen.</li>
	<li>Schließen Sie Harz gefüllten Spalten (0,8 x 4 cm, 10-mL-Behälter, siehe Tabelle der Materialien) an die monteurhilfe mit der drei-Wege-Hähne (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Pumpe ein Vakuum-System als Vakuumfiltration oder einer Pipette Gummiball durch Extrudieren verbunden, um das Lösungsmittel in den Spalten zu entfernen.</li>
	<li>Verwendung eines Photoreactor (Abbildung 2), ausgestattet mit zehn 350 nm-Lampen (Table of Materials) für UV-Bestrahlung. Schließen Sie diese an einem Argon-Gas-Tank über der Photoreactor Lufteinlass um sicherzustellen, dass die Photoreactor mit Argon-Gas vor und während der lichtreaktionen gefüllt ist.</li>
	<li>Sicherstellen Sie vor der Inbetriebnahme der UV Lampe von der Photoreactor, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass es gibt Einstrahlung von UV-Licht.</li>
</ol>(2) Harz-Vorbereitung
Hinweis: In der Regel der Bau von Peptid Substrate erfolgt mit Fmoc-basierte Festphasen-Peptid-Synthese-Protokolle. Diese werden mit der Eisbahn Amid Harz, das Blätter eine C-terminalen Amid verbleibenden folgende Peptid Spaltung durchgeführt. Dieses Protokoll wird in dem Papier verwendet.
Achtung: N, N- Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), 4-Methylmorpholine (NMM) und N, N- Diisoproylethylamine (DIPEA) sind giftig und schädlich durch Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt. Diethylether ist Hochentzündlich. Trifluoroacetic Säure (TFA) ist ätzend. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist sehr übelriechend. Daher sollten alle organischen Lösungsmitteln und Chemikalien mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Nitril-Handschuhe, Kittel und schützende Brillen) behandelt und innerhalb einer chemischen Dampfhaube behandelt werden.
<ol><li>Berechnen Sie die Menge des Harzes erforderlich, mithilfe der folgenden Formel: Skalieren (Mmol) / (Harz Ladekapazität (Mmol/g) (mg/g) 1.000) = Masse des Harzes (mg) Z.B., die Höhe der Eisbahn Amid MBHA Harz (0,5 Mmol/g) für 25 µmol = 0,025 Mmol / (0,5 Mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Als nächstes wiegen Sie 50 mg des Harzes in einer Spalte und legen Sie es auf dem Vakuum Verteiler mit drei-Wege-Hähne.</li>
	<li>Das Harz in einer Spalte (0,8 x 4 cm, 10-mL-Reservoir) 1-2 mL von DCM hinzufügen. Um das Harz zu Schwellen, schütteln Sie sanft ihn mit Stickstoff oder Argon Stream für 10 Minuten. Als nächstes Entfernen des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration.</li>
</ol>(3) N-terminale Fmoc Deprotection und waschen
<ol><li>Bereiten Sie die N-terminale Fmoc deprotecting Lösung: bereiten Sie eine angemessene Lautstärke (200 mL) von 50 % (V/V) Morpholine in DMF in einer Glasflasche.</li>
	<li>Das Harz 1-2 mL der Lösung Deprotection hinzu, schütteln Sie sanft es 10 min und dann abgießen Sie die Lösung mit Vakuum. Mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge, das Harz und den Reaktionsbehälter gründlich für eine Gesamtmenge von 3 X waschen. Anschließend wiederholen Sie die Deprotection und Wash Verfahren 1 X.</li>
</ol>(4) Fmoc-geschützten Aminosäure-Kupplung
<ol><li>Mit der Kopplung von Alanin Rückstände als beispielsweise im Falle von 25 µmol-Skala manuelle Synthese, wiegen Fmoc-Ala-OH (5 Äquiv, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Hexafluorophosphate (HCTU; 4,9 Äquiv, 50,5 mg) in einer Polypropylen-Container und in DMF (0,5 mL) auflösen.</li>
	<li>Fügen Sie DIPEA (10 Äquiv, 43,5 µl) um 0,25-m generieren aktiviert Aminosäurelösung (Tabelle 1). Nach einer ca. 1 min vor Aktivierung des Harzes die Lösung hinzu, und dann Blase es mit N2 für ca. 1-2 h.</li>
	<li>Von diesem Schritt auf jede Aminosäure in der Peptid-Kette zu integrieren, als eine Abfolge von Schritten: zuerst die Deprotection von der N-terminalen Fmoc-Gruppe, und dann waschen, gefolgt durch die Kopplung der Aminosäure über Aktivierung unter Verwendung des HCTU. Hinweis: Kupplung länger (zB., 2 h) wird empfohlen, wenn nach einem sterisch gehinderten Aminosäurerest Kupplung [zB., Fmoc-Thr (tBu) - OH, Fmoc-Cys (Trt) - OH, Fmoc-HSI (Trt) - OH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Die Alken/Alkinen mit unnatürlichen Aminosäuren werden in 3 Äquivalente statt 5 verwendet und sind um 3 h einwirken gelassen.</li>
	<li>Der Peptid-Synthese Arbeitsfortschritt durch Kaiser oder Chloranil Tests wie von Arora Et Al. beschrieben 36 diese Tests liefern qualitative Bewertungen der Anwesenheit oder Abwesenheit von freien primären und sekundären Aminen. Alternativ können ca. 2-3 mg des Peptids abgespalten aus dem Harz und von LC-MS analysiert.</li>
</ol>5. Thiol-ene Hydrothiolation und Thiol-Yne Biosyntheseschritt
<ol><li>Konstrukt Thioether Linker durch auf-Harz biosyntheseschritt (Abbildung 3).<ol>
<li>Ca. 50 mL der Trt Deprotection Lösung (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0) vorzubereiten. Behandeln der Cys und mS5-Lager Harz [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-Harz, 50 mg] mit 1-2 mL der Trt Deprotection Lösung in einer 10-mL-Spalte. Schütteln Sie sanft die Lösung für 10 min mit N2. Schließlich waschen Sie ihn mit DCM (1-2 mL) für eine Gesamtmenge von 3 X. Hinweis: MS5 stellt der Alkylenoxide(s)-Lager-Baustein (siehe die Struktur in Abbildung 6dargestellt) für Peptid Kupplung und Thio-ene biosyntheseschritt38verwendet.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für eine Gesamtmenge von ca. 6 X um die Trityl-Schutz-Gruppe von Cystein, zu entfernen, bis die Farbe der Lösung nicht mehr gelb ist oben beschrieben.</li>
		<li>Sprudelte mit N2, waschen Sie die R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-Harz [Cystein mit kostenlosen Thio (-SH)] mit DMF (1-2 mL) und DCM (1-2 mL) in dieser Reihenfolge. Schrumpfen Sie des Harzes unter Verwendung von Methanol (1-2 mL) für 2 min und dann entfernen Sie des Lösungsmittels mit Filtration. Als nächstes nacheinander trocknen Sie das Harz unter Dampf von N2 Gas für ca. 5 min in der Spalte.</li>
		<li>Bereiten Sie entgast DMF vorher innerhalb einer Mund-Kolben, durch sprudelnden Stickstoffgas für ca. 1 h durch eine lange Nadel, die in dem Lösungsmittel gestreckt wurde.</li>
		<li>Übertragen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben durch wiegen Papier. Das Harz in 2 mL der entgast DMF, gefolgt durch die Zugabe von 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Photoinitiator auszusetzen (MMP; 1 Äquiv, 5,6 mg), 4-Methoxyacetophenone (Karte; 1 Äquiv, 3,8 mg).</li>
		<li>Fügen Sie Aufsehen bar (0,3 cm) in den Kolben und den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen verschließen, dann verdrängen die Luft in die Flasche mit Stickstoffgas mit einer Ölpumpe. Hinweis: Der inerte Atmosphäre ist nicht unbedingt erforderlich für die effektive Thio-ene Photoreaktion auf einer festen Phase. Allerdings ist es sehr notwendig für Thio-Yne Photoreaktion in der Lösungsphase in Abbildung 5. Andernfalls wird Schwefel während der UV-Bestrahlung oxidieren.</li>
		<li>Die Photoreactor eingelassen Sie der Reaktionskolben und rühren Sie das Harz für 1 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2). Achtung: Vor dem Einschalten der Photoreactor UV-Lampe sicherstellen Sie, dass das Photoreactor geschlossen ist, für den Fall, dass gibt es schädliche Einstrahlung von UV-Licht. Hinweis: Häufig Probenahme des Reaktionsgemisches während der lichtreaktionen ist für neue Sequenzen empfohlen, da der linearen Peptid-Vorläufer der identische Molekulargewicht des Produktes hat. Im Allgemeinen zeigen lineare und zyklische Peptide deutlich unterschiedliche Hydrophilie. Dies könnte leicht mittels HPLC zu unterscheiden. Alternativ die 5, 5' - Dithiobis-(2-Nitrobenzoic Säure) (DTNB) Reagenz könnte auch verwendet werden, um das Vorhandensein von freien Thiol37zu studieren.</li>
		<li>Übertragen Sie das Harz aus der Flasche in der Spalte und entfernen Sie der Vakuumfiltration mit Lösungsmittel. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Bereiten Sie etwa 10 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Übertragen das Harz in einer 2-mL Polypropylen Behälter füllen 1 mL der Spaltung cocktail (TFA/Tipps/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) in den Behälter und verschließen der Behälter dicht mit einem Schraubverschluss. Dann schütteln Sie sanft den Container auf einem Orbitalschüttler mit einer Rate von 60 u/min in der Dunstabzugshaube für 1,5-2 h. Achtung: TFA ist stark ätzend. Tragen Sie Schutzkleidung und arbeiten in einer effizienten Abzug. EDT ist eine stark riechende Substanz und muss in einen effizienten Abzug gehandhabt werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die TFA-Cocktail durch Verdampfung unter einer N-2 -Gasstrom in der Dunstabzugshaube. Als nächstes Niederschlag den Rückstand mit kaltem Diethylether (1 mL) für 30 s und isolieren es durch Zentrifugation bei 12.000 x g 2 min. lang. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Wiederholen Sie der Niederschlag und Zentrifugation Schritte für 2 X. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit.</li>
		<li>Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und reinigen durch HPLC mit einer C18 analytische Säule (4,6 x 250 mm, Durchfluss 1,0 mL/min). Verwendung H2O (mit 0,1 % TFA) und reinem Acetonitril als Lösungsmittel bei einem linearen Farbverlauf 2%/min von 20 % bis 70 % Acetonitril über 25 min. Monitor HPLC Spektren mit UV-280 nm und 220 nm Wellenlängen (Tabelle 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Konstruieren Sie den Thioether Linker durch intermolekulare Thio-ene Reaktion und dann Cyclize das Peptid von Macrolactamization (Abbildung 4).<ol>
<li>Die Alkylenoxide(s) Rückstände mit linearen Peptid H2N-A-A-A-mS5zu synthetisieren (2-R'')-R'-Harz (50 mg) mit standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) im beschriebenen Schritte 2 bis 4. Anschließend waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Unterbrechen Sie das Harz in einem 10 mL Runde Talsohle Kolben, 2 mL entgast DMF enthalten, wie in Schritt 5.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie den Photoinitiator MMP und Karte (MMP: 1 Äquiv, 5,6 mg; Karte: 1 Äquiv, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3 Äquiv, 25,7 mg) und einen Stir bar (0,3 cm) in den Kolben. Verschließen Sie den Kolben mit einer geeigneten Gummistopfen und verwenden Sie die Öl-Pumpe, um die Luft in der Flasche mit Stickstoff zu ersetzen.</li>
		<li>Die Photoreactor der Reaktionskolben eingelassen. Rühren Sie für 1-2 h unter UV-Bestrahlung bei Raumtemperatur (Abbildung 2).</li>
		<li>Überwachen Sie die Reaktion unter eine LC-MS-Analyse: 2-3 mg des Harzes mit der Spaltung Cocktail zu Spalten. Dann überstürzen sich die Rückstände mit kalten Diethylether (300 µL), isolieren Sie die Rückstände durch Zentrifugation und verdunsten des Rückstands zu Trockenheit, wie in Schritt 5.1.11 beschrieben. Danach lösen sich die Rückstände in 100 µL H2O/Acetonitril (2:1). Die peptidlösung unter Verwendung eines 0,22 µm mikroporösen Films filtrierbar und analysieren sie mit LC-MS mit der Verbindung in der Elektrospray-Ionisation (ESI) ionisiert und in positive Modus betrieben.</li>
		<li>Wenn nötig, wiederholen Sie 5.2.2 Schritte - erfolgt bis zur Fertigstellung 5.2.4 um die Reaktion zu gewährleisten.</li>
		<li>Übertragen Sie nach dem Abschluss der Foto-Reaktion das Harz aus der Flasche in die Spalte zu, und entfernen Sie des Lösungsmittels mit Vakuumfiltration. Waschen Sie und trocknen Sie des Harzes, wie unter Punkt 5.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie die DMF-Lösung von benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBob; 2,4 Äquiv, 31,2 mg), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4 Äquiv, 8,1 mg), und NMM (4 Äquiv, 11 µL) in das Harz in der Spalte für die Macrolactamization. Diese Lösung mit N2 2 h-Blase.<ol>
<li>Darüber hinaus überwachen Sie diese Koppelung Reaktion mit LC-MS, wie unter Punkt 5.2.3 beschrieben. Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt, um die Reaktion zu gewährleisten bis zur Fertigstellung durchgeführt wird.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verlängern Sie das Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben.</li>
		<li>Spalten Sie bei der Montage von allen Aminosäurereste das Peptid aus dem Harz zu, wie in den Schritten 5.1.10 und 5.1.11 beschrieben und reinigen Sie es zu, wie im Schritt 5.1.12. beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Konstruieren Sie Vinyl-sulfid-Linker in der Lösungsphase (Abbildung 5).<ol>
<li>Synthetisieren Sie die Alkinen Rückstände mit linearen Peptid mit standard Fmoc-basierte SPPS, wie in den Schritten 2 bis 4 beschrieben. Synthetisieren Sie die Alkinen mit Aminosäure nach einem etablierten Protokoll, wie in einer früheren Studie20beschrieben.</li>
		<li>Spalten Sie das Peptid aus dem Harz zu und überstürzen Sie es mit kalten Diethylether wie 5.1.9 - 5.1.11 beschrieben. Nach der Spaltung und Niederschlag des Harzes sammeln Sie das Peptid über 2 min Zentrifugation bei 12.000 x g.</li>
		<li>Trocknen Sie den daraus resultierende Rückstand in einem Vakuum. Auflösen den Rückstand im entgast DMF (50 mL) in einem 100 mL Runde Talsohle Kolben um eine Endkonzentration von 0,5 mM zu erreichen (basierend auf das Laden des Harzes, 0,025 Mmol (1000 mL/L / 0,5 Mmol/L) = 50 mL).<ol>
<li>Hinzufügen der Photoinitiator DMPA (0,5 Äquiv, 3,2 mg) und dann Entgasen der Reaktionslösung für 10 min mit N2 durch eine lange Nadel dehnte sich in der Lösung. Als nächstes bestrahlen Sie die Probe unter UV-Licht bei Raumtemperatur für 0,5 - 1 h ohne Aufregung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie das ZMS im Hochvakuum und überstürzen Sie sich die grobe Rückstände durch Zugabe von Diethylether um seine organische Nebenprodukte aufzulösen. Dann, Isolieren des Zentrifugation mit 12.000 x g für 2 min Rückstands. Nach der Zentrifugation sanft Ausgießen der Äther-Komponente. Verdunsten Sie den Rückstand auf Trockenheit. Schließlich lösen sich die Rückstände in 1 mL H2O/Acetonitril (2:1) und mittels HPLC wie in Schritt 5.1.7 beschrieben reinigen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der am Harz Intramolekulare Thio-ene biosyntheseschritt in Abbildung 3beschrieben die Beseitigung der Trityl Gruppe von Cystein-Rückstand erwies sich ein entscheidender Schritt für die anschließende Photoreaktion. Darüber hinaus dargestellt das Peptid Molekulargewicht vor und im Anschluss an die Reaktion erwies sich als identisch in Abbildung 6 b. Daher ist die Verwendung einer HPLC-Identifikation oder ein DTNB Assay erforderlich, um die Reaktion zu überwache...

Die Entwicklung des Liganden zu modulieren, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) bietet ein attraktives Konzept für die moderne Arzneimittelforschung. So wurde viel Aufwand in Studium neuartige chemische Modalitäten investiert, die effizient ppi1,2,3modulieren kann. Ppi in der Regel bestehen aus flachen, großen und/oder aufgegebenen wechselwirkenden Oberflächen und kleine Moleküle sind in der Regel als ungeeignet Liganden für die Modulation des ppi4,5. Mit einer geeigneten exponierten interagierende Fläche stellen kurze Peptide, die die strukturellen Merkmale des Proteins Schnittstellen imitieren ideale Kandidaten für dieses Problem6,7Adresse dar. Kurze Peptide sind jedoch in der Regel unstrukturiert in einer wässrigen Lösung. Dies ist die Wassermoleküle, die mit dem Intramolekulare Wasserstoff Verklebung Netzwerk der Peptidrückgrat und klar definierte Konformationen konkurrieren im Wasser8entropically ungünstig sind. Darüber hinaus die Peptide von Natur aus geringe Stabilität und Durchlässigkeit Zelleneigenschaften weitgehend beschränken ihre Verwendung in Anwendungen in der Biologie9,10. Nach der Protein Data Bank (PDB) Analyse > 50 % der PPI beinhalten kurze α-Helix-Wechselwirkungen-11. So wurden verschiedene chemische Methoden in Bezug auf Helix Stabilisierung entwickelt. Dazu gehören Disulfid/Thioether Anleihe Bildung12,13,14, Ring-Schließung Metathese15, Lactam-Ring Bildung16, "klicken" Chemie17, Zugabe von Perfluoroarenes18,19und Vinyl-sulfid Bildung20.
Stabilisierte spiralförmige Peptide werden weithin genutzt, für verschiedene intrazelluläre Ziele, einschließlich p53, Östrogen-Rezeptoren, Ras, BCL-2 Familie Proteine und andere21,22,23,24. ALRN-6924, eine All-Kohlenwasserstoff Peptid duale Inhibitor von MDM2 und MDMX geheftet, ist derzeit für klinische Untersuchung25verwendet wird. In den letzten Jahren konzentriert sich unsere Gruppe auf die Entwicklung von neuartigen Peptid-Stabilisierung-Methoden mit Thiol-ene und Thiol-Yne Reaktionen26,27,28. Im Allgemeinen haben wir gezeigt, dass diese Foto-initiierten Reaktionen sind effizient unter milden Bedingungen, wenn natürlich reichlich Cystein verwendet wird. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Reaktionen eine ausgezeichnete funktionelle Gruppe Toleranz haben, sind Bio-orthogonal und erwiesen sich als für Peptid und Protein Änderungen29anwendbar. Die daraus resultierende Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide weitgehend verbessern den chemischen Raum Einschränkung Peptide, bieten eine labile-Tether Modification Centers und erweist sich für den Einsatz in zahlreichen Anwendungen in der Biologie30 ,31,32. Bisher wurden nur begrenzte Berichte über Thiol-ene/Thiol-Yne Peptid biosyntheseschritt beschrieben. In einer Studie von Anseth Et Al. im Jahr 2009 war eine Reaktion auf Harz Intramolekulare Thiol-ene für Peptid-biosyntheseschritt zwischen aktivierten Alkenen mit Cystein demonstriert33. Im Jahr 2015 Chou Et Al. eine Zweikomponenten-radikale initiiert Thiol-ene Reaktion für Peptid Heften34 und eine anschließende, sequentielle Thiol-Yne/ene Kupplung Reaktion35beschrieben. Vor kurzem haben wir eine Reihe von arbeiten, die basierend auf Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide20,26,27beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Synthese der oben genannten Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide in der Hoffnung, dass es für die Allgemeinheit Forschung nützlich sind.

<table><tbody><tr><td>Eisbahn Amid MBHA Harz (0,53 mmol/g)</td><td>HECHENG</td><td>GRM50407</td><td></td></tr><tr><td>Standard Fmoc-geschützte Aminosäuren</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidinon</td><td>Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.</td><td>3230</td><td>hautschädlich</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>Energie</td><td>B020051</td><td>der Haut schädlich</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Energie</td><td>W330229</td><td>der Haut schädlich</td></tr><tr><td>N,N-Diisoproylethylamin</td><td>Aldrich</td><td>9578</td><td>reizend</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>J& K</td><td>101398</td><td>korrosives</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>J& K</td><td>973821</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>J& K</td><td>248897</td><td>Gestank</td></tr><tr><td>2-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorphosphat&nbsp;</td><td>GL Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td></td><td></td>851012</tr><tr><td>Morpholin</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td>reizend</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>entzündlich</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>Toxizität</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>Toxizität</td></tr><tr><td>2-Hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanon</td><td>Energie</td><td>A050035</td><td></td></tr><tr><td>4-Methoxyacetophenon</td><td>Energy</td><td>A050098</td><td></td></tr><tr><td>2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon</td><td>Energy</td><td>D070132</td><td></td></tr><tr><td>5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)</td><td>J& K</td><td>281281</td><td></td></tr><tr><td>Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat</td><td>Energie</td><td>E020172</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazol</td><td>Energie</td><td>D050256</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylmorpholin</td><td>Energie</td><td>W320038</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatographie</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-30AD</td><td></td></tr><tr><td>Elektrospray Ionisationsmasse</td><td>SHIMADZU</td><td>LCMS-8030</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>Labconco</td><td>FreeZone</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Konzentrationssystem</td><td>Thermo</td><td>Savant</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumverteiler</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhähne</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatographiesäulen&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr></tbody></table>

bau von thioether/vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige peptide über foto-induzierte thiol-ene/yne hydrothiolation

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung der Thioether angebunden Peptide mit am Harz Intramolekulare/intermolekulare Thiol-ene Hydrothiolation. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Vorbereitung der Vinyl-sulfid-angebunden Peptide mit in Lösung Intramolekulare Thiol-Yne Hydrothiolation zwischen Amino acids, die Alken/Alkinen Seitenketten besitzen und Cystein Rückstände am ich, ich + 4 Positionen. Mit einem standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) lineare Peptide synthetisiert. Thiol-ene Hydrothiolation erfolgt über eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion oder eine intermolekulare Thio-ene Reaktion abhängig von der Peptid-Länge. In dieser Studie erfolgt eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion bei kürzeren Peptiden mit auf Harz-Deprotection der Trityl Gruppen von Cystein-Rückstände, die nach der vollständigen Synthese von linearen Peptid. Das Harz wird dann auf UV-Bestrahlung mit Photoinitiator 4-Methoxyacetophenone (MAP) und 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) festgelegt. Die intermolekularen Thiol-ene Reaktion erfolgt durch Fmoc-Cys-OH in einem N, N- Dimethylformamid (DMF) Lösungsmittel auflösen. Dies wird dann mit dem Peptid mit der Alken-Lager Rückstand auf Harz reagiert. Danach die Macrolactamization erfolgt mit benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBop), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt) und 4-Methylmorpholine (NMM) als Aktivierung Reagenzien auf das Harz. Im Anschluss an die Macrolactamization die Peptidsynthese wird fortgesetzt mit standard SPPS. Im Falle der Thio-Yne Hydrothiolation der linearen Peptid gespalten aus dem Harz, getrocknet und anschließend in entgastem DMF gelöst. Dies wird dann bestrahlt, mit UV-Licht mit Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-Phenylacetophenone (DMPA). Nach der Reaktion DMF wird verdampft und die grobe Rückstände wird ausgefällt und gereinigt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Methoden könnte funktionieren, um die Generation der Thioether angebunden zyklische Peptide durch den Einsatz von Thio-ene/Yne Click-Chemie zu vereinfachen, die überlegene funktionelle Gruppe Toleranz und guten Ertrag besitzt. Die Einführung von Thioether Anleihen in Peptide nutzt der nukleophilen Natur von Cystein-Rückständen und Redox-inert gegenüber Disulfid-Bindungen.

Die HPLC und MS Spektren von Peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 und deren cyclisiert Produkt Ac - Y-(Cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 , die erstellt wurden mit der am Harz Intramolekulare Thiol-ene Photoreaktion in Abbildung dargestellt 6 b. das zyklische Peptid wurde festgestellt, dass eine identische Molekulargewicht im Verhältnis zu seinem linearen Vorläufer haben. Die HPLC-Verweilzeit wurde allerdings beobachtet, ca. 2 min früher...

Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Diese Methoden vereinfachen die Erzeugung von Thioether-gebundenen zyklischen Peptiden aufgrund der Verwendung der Thio-en- oder Thio-yn-Click-Chemie, die eine überlegene Toleranz gegenüber funktionellen Gruppen und eine gute Ausbeute besitzt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ein Thioether-Tether eine spurlose Modifikationsstelle bietet, die den chemischen Raum stabiler Peptide nach der Modifikation der Peptidsynthese erheblich erweitert. Um den Vorgang zu starten, befestigen Sie eine mit 50 Milligramm Rink Amide MBHA-Harz gefüllte Säule über einen Dreiwege-Absperrhahn sowohl an einen Tisch-Vakuumverteiler als auch an eine Stickstoff- oder Argongasleitung.Geben Sie ein bis zwei Milliliter Dichlormethan in das Harzbett und quellen Sie das Harz auf, indem Sie die Mischung 10 Minuten lang vorsichtig mit einem Strom von Inertgasblasen bewegen. Lassen Sie das Harz mit einer Gummipipettenbirne abtropfen, wenn Sie fertig sind. Fügen Sie dann ein bis zwei Milliliter N-terminale Fmoc-Entschützungslösung zum Harz hinzu.Rühren Sie die Mischung vorsichtig um, indem Sie sie 10 Minuten lang mit Inertgas sprudeln lassen, und lassen Sie das Harz dann mit einem Gummipipettenkolben ab. Waschen Sie die Säule auf die gleiche Weise mit ein bis zwei Millilitern DMF, gefolgt von ein bis zwei Millilitern DCM. Wiederholen Sie die Entschützungssequenz einmal.Kombinieren Sie als nächstes 0,125 Millimol einer Fmoc-geschützten Aminosäure und 50,5 Milligramm HCTU mit 0,5 Millilitern DMF in einem Polypropylenbehälter. Schütteln Sie die Mischung eine Minute lang, um die Feststoffe aufzulösen. Fügen Sie dann 43,5 Mikroliter DIPEA hinzu und schütteln Sie den Behälter eine weitere Minute lang, um eine 0,25-molare aktivierte Aminosäurelösung zu erhalten.Geben Sie diese Lösung zum gewaschenen Harz und lassen Sie ein bis zwei Stunden lang Inertgas durch die Mischung blasen. Danach entschützen und waschen Sie den gebundenen Aminosäurerest. Koppeln Sie Aminosäuren auf diese Weise weiter an die Peptidkette, um das lineare Peptid zu bilden.Verwenden Sie die Festphasen-Peptidsynthese, um ein Harz herzustellen, das ein lineares Peptid unterstützt, das einen Trityl-geschützten Cysteinrest enthält, der durch drei Einheiten von einem Mono-S-Fünf-Rest getrennt ist. Geben Sie ein bis zwei Milliliter Trityl-Entschützungslösung zu 50 Milligramm des peptidhaltigen Harzes. Blasen Sie Stickstoffgas 10 Minuten lang durch das Gemisch.Lassen Sie die Entschützungslösung ab und waschen Sie das Harz dreimal mit einem bis zwei Millilitern DCM. Wiederholen Sie den Entschützungsvorgang sechsmal oder bis die Lösung nicht mehr gelb erscheint, um das Cystein vollständig zu entschützen. Die vollständige Entschützung der Trt-Gruppe von Cystein ist für den folgenden Photoreaktionsschritt sehr wichtig.Waschen Sie das Harz nacheinander mit ein bis zwei Millilitern DMF und DCM. Weichen Sie das Harz dann zwei Minuten lang in ein bis zwei Millilitern Methanol ein, um das Harz zu schrumpfen. Lassen Sie das Methanol ab und trocknen Sie das Harz fünf Minuten lang mit Stickstoffgas.Übertragen Sie das trockene Harz über Wägepapier in einen 10-Milliliter-Kolben mit rundem Boden. Suspendieren Sie das Harz in zwei Millilitern stickstoffhaltigem DMF. Fügen Sie dann 5,6 Milligramm MMP und 38 Milligramm MAP als Photoinitiatoren hinzu.Legen Sie einen Rührstab in den Kolben und verschließen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum. Die Kolbenatmosphäre wird dreimal mit Stickstoffgas gespült, was eine Gesamtspülzeit von etwa fünf Minuten ergibt. Der Reaktionskolben wird in einem Photoreaktor befestigt, der mit UVA-Lampen, einem Einlass für inertes Stickstoffgas und einer Rührplatte ausgestattet ist.Beginnen Sie mit dem Rühren der Mischung und schließen Sie den Photoreaktor. Spülen Sie den Photoreaktor 10 Minuten lang mit Argon. Stellen Sie dann die Argonflussrate auf einen Liter pro Minute ein und bestrahlen Sie das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit UVA-Licht.Überwachen Sie die Reaktion mit HPLC. Waschen, spalten und reinigen Sie das zyklische Peptid, wenn es fertig ist. Bereiten Sie 50 Milligramm Harz vor, das ein lineares Peptid enthält, das einen gammasubstituierten Mono-S-Fünf-Rest enthält.Waschen Sie das Harz nacheinander mit DMF und DCM. Schrumpfen Sie das Harz mit Methanol und trocknen Sie es mit Stickstoffgas. Anschließend wird das Harz in einem 10-Milliliter-Kolben mit rundem Boden in zwei Millilitern stickstoffhaltigem DMF suspendiert.Fügen Sie der Mischung 5,6 Milligramm MMP, 3,8 Milligramm MAP und 25,7 Milligramm Fmoc-geschütztes Cystein hinzu. Geben Sie einen Rührstab in den Kolben, verschließen Sie ihn mit einem Gummiseptum und reinigen Sie die Kolbenatmosphäre mit Stickstoffgas. Bestrahlen Sie dann das Gemisch in einem mit inertem Stickstoffgas gefüllten Photoreaktor mit UVA-Licht, während Sie ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.Überwachen Sie die Reaktion mit LC-MS. Wenn die Photoreaktion abgeschlossen ist, waschen Sie das gebundene Peptid und führen Sie die Makrolaktamisierungsreaktion durch. Setzen Sie anschließend die Kopplung von Aminosäuren an das zyklische Peptid fort, um die gewünschte Struktur zu bilden.Spalten und reinigen Sie das Peptid, wenn es fertig ist. Bereiten Sie 50 Milligramm Harz vor, das ein lineares Peptid enthält, das einen Rückstand mit einem terminalen Alkin enthält, das durch drei Einheiten von einem Rückstand mit einem terminalen Thiol getrennt ist. Trennen Sie das Peptid vom Harz und fällen Sie es mit einem Milliliter kaltem Diethylether aus.Zentrifugieren Sie das Peptidgemisch bei 12.000 g für zwei Minuten. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und fügen Sie einen weiteren Milliliter kalten Diethylether hinzu. Wiederholen Sie das Waschen noch zweimal und trocknen Sie dann den Peptidrückstand unter Vakuum.Der Rückstand wird in 50 Millilitern stickstoffhaltigem DMF in einem Rundkolben gelöst. Geben Sie 3,2 Milligramm DMPA in die Peptidlösung und blasen Sie Stickstoff 10 Minuten lang durch das Reaktionsgemisch. Eine inerte Atmosphäre ist für eine effektive Thio-Yn-Photoreaktion in einer Lösungsphase unbedingt erforderlich.Ansonsten beobachteten wir eine Oxidation von Schwefel während der UV-Bestrahlung. Bestrahlen Sie dann das Gemisch ohne Rühren in einem mit inertem Stickstoffgas gefüllten Photoreaktor bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis eine Stunde mit UVA-Licht. Isolieren und reinigen Sie das zyklische Peptid, wenn es fertig ist.Die On-Resin-Cyclisierung dieses Peptids erzeugte ein Thioether-gebundenes ein, fünf cyclisches Peptid mit einem identischen Molekulargewicht wie das lineare Peptid. Die HPLC-Retentionszeit des zyklischen Produkts war zwei Minuten kürzer als die des linearen Peptids. Eine gute Umwandlung wurde auch für die On-Resin-Cyclisierung mehrerer anderer kurzer Peptide beobachtet.Lineare Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Peptidheftung durch photoinduzierte Thiol-Yn-Hydrothiolierung untersucht. Die geringe Ausbeute von zwei c wurde auf eine Konformationspräferenz für das Einfangen des Thiylradikals am N-Terminus während der Kontraktion zu einem 20-gliedrigen Makrozyklus zurückgeführt. Die Peptide eins a und eins b erzeugten beide zwei Isomere mit einer achtgliedrigen Vinylsulfid-Vernetzung.Die Produktpeptide zwei a-A und zwei a-b wiesen unterschiedliche Retentionszeiten auf und wurden in unterschiedlichen Verhältnissen zu unterschiedlichen Bestrahlungszeiten hergestellt. Die Protonen-NMR-Spektroskopie zeigte, dass zwei a-A das E-Isomer des Vinylsulfids und zwei a-B das Z-Isomer waren. Das Z-Isomer war das Hauptprodukt bei der Bildung der Peptide zwei d, zwei e und zwei f, was auf die Konformationspräferenz während der Bildung des siebengliedrigen Vinylsulfid-Vernetzungs zurückgeführt wurde.Die Zirkulardichroismus-Spektroskopie zeigte eine zufällige Spirale für alle Formen von Peptiden zwei a und zwei b und eine helikale Konformation für das Peptid zwei d. Wir haben eine Reihe chemischer Protokolle für die Konstruktion von Thioether- und Vinylsulfid-gebundenen Peptiden unter Verwendung der photoinduzierten Thio-en- und Thio-Yn-Click-Chemie entwickelt. Wir glauben, dass es für die Forschungsgemeinschaft hilfreich sein wird.

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Chemie

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In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

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