High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform
23. August 2012
Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein modulares Proteinarray zu schaffen, das keinen Aufreinigungsschritt erfordert und damit mit jeder Proteinbibliothek kompatibel ist. Dies wird erreicht, indem zunächst synthetische Gene durch Assemblierungs-PCR erzeugt werden. Als nächstes werden die synthetischen Gene auf Epoxid-Objektträgern angeordnet.
Verwenden Sie zur Herstellung des mikrofluidischen Geräts PDMS mit Silikonsteuerung und Fließformen. Dann wird das mikrofluidische Gerät auf das gefleckte DNA-Array ausgerichtet. Schließlich wird Kaninchen-Retikulozyten-Lysat in das mikrofluidische Gerät gepumpt und Proteine werden exprimiert.
Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expression von Tausenden von Proteinen durch fluoreszierende Antikörpermarkierung zeigen. Die Verwendung der mikrofluidischen Technik bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden wie z. B. Protein-Microarrays. Wir microarrayn DNA und verwenden dann Cellis, um Proteine auf dem Gerät herzustellen.
Somit benötigen wir keine Proteinreinigung und die Proteine trocknen nie aus. Sie bleiben während des gesamten Experiments frisch. Die mikrofluidische Technik bietet auch eine höhere Empfindlichkeit: Um das mikrofluidische Gerät herzustellen, setzen Sie die Silikonsteuerung und die Fließformen 10 Minuten lang Chlortrimethylsilendampf aus, um die Freisetzung des Elastomers zu fördern.
Bereiten Sie nach den Einbrennschritten eine Mischung aus silikonbasiertem Elastomer und Härter in zwei verschiedenen Verhältnissen von fünf zu eins bzw. 20 zu eins für die Kontroll- bzw. Fließwerkzeuge vor. Gießen Sie das Fünf-zu-Eins-PDMS auf die Steuerungsschicht. Entgasen Sie die Kontrollschicht und backen Sie sie 30 Minuten bei 80 Grad Celsius.
Als nächstes schleudern Sie die 20 zu 1 PDMS-Mischung 60 Sekunden lang bei 2.600 U/min auf die Fließschicht und backen Sie sie dann 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Trennen Sie langsam die Kontrollschicht von der Form und achten Sie darauf, das SU-Acht-Muster nicht abzulösen. Schneiden Sie dann mit einem Skalpell das Gerät um seinen Umfang herum und stanzen Sie mit einer stumpfen Nadel Löcher, um unter einem Mikroskop Zugang zu den Kontrollkanälen zu erhalten.
Richten Sie die Durchfluss- und Regelschicht manuell beginnend mit der oberen linken Ecke aus und positionieren Sie das Knopfventil auf der Steuerschicht in der Mitte der Reaktionskammer. Richten Sie als Nächstes die erste Reihe aus und lassen Sie die Steuerebene Zeile für Zeile vorsichtig los. Stellen Sie sicher, dass sich alle Knopfventile in der Mitte der Reaktionskammern befinden und dass die Adress- und Eingangsventile die Strömungskanäle in der richtigen Position kreuzen.
Wiederholen Sie den Vorgang lokal, bis alle Zeilen ausgerichtet sind. Wenn es vollständig ausgerichtet ist, lösen Sie alle Spannungen im PDMS, indem Sie es vorsichtig von den Seiten und Ecken anheben. Anschließend backen Sie das Gerät nach dem Backen zwei Stunden bei 80 Grad Celsius.
Schneiden Sie um den Umfang herum und schälen Sie das zweischichtige Gerät aus den Löchern der Fließform, um Zugang zu den Strömungskanälen zu erhalten und DNA-Konstrukte für das Gerät zu generieren. Führen Sie eine PCR durch, um synthetische Gene herzustellen, die aus einem T-Sieben-Promotor, einer Ribosomen-Bindungsstelle, einem offenen Leserahmen mit unterschiedlichen Epitop-Tags an beiden Enden und einem T-Sieben-Terminator bestehen. Um die synthetischen Gene für das Arraying vorzubereiten, stellen Sie eine Mischung aus Polyethylenglykol und D-Triose-Dihydrat her. Geben Sie zwei Mikroliter pro Reaktion in die Vertiefungen eines 384.
Gut anrichten. Geben Sie die synthetischen Gene in eine 384-Well-Platte. Fügen Sie dann destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 Mikrolitern hinzu.
Anschließend wird mit einem Microarray-Spot eine Reihe synthetischer Gene auf epoxidbeschichtete Glassubstrate aufgebracht. Richten Sie das mikrofluidische Gerät unter einem Stereoskop manuell auf das Genarray aus, wobei sich der DNA-Spot in der Mitte der DNA-Kammern befindet. Bringen Sie dann die restlichen Reihen in eine Linie.
Abschließend erfolgt die Feinabstimmung des gesamten Geräts, um die Belastung des PDMS zu verringern und sicherzustellen, dass es sich gut mit dem Microarray verbindet. Heben Sie es lokal an. Zum Schluss kleben Sie das Gerät mit dem Objektträger, indem Sie es über Nacht auf einer heißen Platte bei 80 Grad Celsius inkubieren.
Lebensmittelfarben werden in diesem Abschnitt zu Visualisierungszwecken verwendet. Die Ventile in der Steuerungsschicht werden vom Computer aus in der Lab-Ansicht angesteuert. Das Skript für die Laboransicht steuert eine Reihe von Magnet-Mikroventilen über einen elektronischen Schaltkasten.
Der Magnetventilverteiler ist mit Druckluft verbunden, die den Luftstrom und den Druck in die Regelventile am Gerät steuert. Verbinden Sie das Gerät mit einem flexiblen Kunststoffschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,02 Zoll und einem Edelstahlstift mit dem Verteiler der Magnetventile. Füllen Sie die Röhrchen mit doppelt destilliertem Wasser und stecken Sie den Stift in die Zugangslöcher der Kontrollschicht.
Stellen Sie sicher, dass jede Röhre mit dem entsprechenden Steuerkanal verbunden ist. Um die Steuerkanäle zu aktivieren, führen Sie die Lab-View-Anwendung aus, und stellen Sie den Luftdruck auf fünf PS ein. Dann wende ich Luftdruck an, indem ich das Ventil aus dem Skript für die Laboransicht aktiviere. Dadurch wird Wasser in die PDMS-Steuerkanäle gedrückt, um ein mögliches Übersprechen zwischen den Steuerkanälen defekter Geräte zu identifizieren.
Zuerst das Sandwich und die Adressventile füllen. Schließlich sind die Steuerkanäle und Ventile mit Wasser gefüllt, die Ventile werden so vorbereitet, dass sie die darunter liegenden Strömungskanäle blockieren. Zuerst wird der Luftdruck auf 15 PSI erhöht, dann in der Laboransicht durch einen Satz von Ein-Aus-Schaltern, die mit einzelnen Magnetventilen verbunden sind.
Aktivieren Sie alle Ventile, indem Sie alle Schaltknöpfe einschalten, um sicherzustellen, dass alle Ventile geöffnet sind. Schließen Sie einen Schlauch an einen der Durchflusseingänge an und strömen Sie mit vier bis fünf PSI Luft in das Gerät. Dadurch werden alle klebrigen Ventile vom Glasschieber gelöst.
Das Gerät ist nun vorbereitet und bereit für Visualisierungszwecke. Gelber Lebensmittelfarbstoff wird verwendet, um die Reagenzien in diesem Abschnitt zu visualisieren, und die farblose Lösung stellt die Hippies dar, um die Selbstorganisation eines Proteinarrays auf der Oberfläche zu erleichtern und eine unspezifische Absorption innerhalb des mikrofluidischen Geräts zu verhindern, modifizieren Sie die Oberfläche chemisch, indem Sie zuerst ein neues Rohr mit der erforderlichen Lösung mit einem der Strömungskanäle in dem Gerät verbinden. Verbinden Sie dann die freie Seite des Rohres mit dem manuellen Verteiler und öffnen Sie den Luftdruckstrom.
Laden Sie 40 Mikroliter Biotin berauschtes BSA in ein neues Röhrchen und lassen Sie etwa die Hälfte davon 20 Minuten lang durch das Gerät fließen. Verwenden Sie 50 Millimolar Hippies, um jedes nicht reaktive Substrat zwischen jedem der Schritte abzuwaschen. Als nächstes lassen Sie 20 Minuten lang 25 Mikroliter Streptavidin fließen.
Waschen Sie auf dem mit Biotin angereicherten BSA fünf Minuten lang mit ihm, um die den Knopf umgebende Oberfläche zu essen, schließen Sie das Knopfventil und lassen Sie den Rest des biotinylierten BSA fließen, und waschen Sie ihn dann erneut fünf Minuten lang mit der Erbse. Um schließlich ein Anti-Hiss-Tag-Array unter dem Knopf zu erstellen, lassen Sie das Knopfventil los und lassen Sie 20 Minuten lang 30 Mikroliter Penta Hiss-Biotin fließen, um ein Array von Proteinen auf dem Gerät zu erzeugen. Öffnen Sie die Halsventile und lassen Sie Kaninchenretikulozyten fließen.
Schnelle gekoppelte Transkriptions- und Translationsreaktionslösung durch das Gerät in die DNA-Kammer. Schließen Sie anschließend die Sandwich-Ventile, um jedes Gen von seiner Umgebung zu trennen, und inkubieren Sie das Gerät 2,5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius auf einer heißen Platte. Dann markieren Sie den Endterminus der Proteine mit C-Mix SI drei Antikörpern.
Schließlich wird ein Microarray-Scanner mit einem 532-Nanometer-Laser und einem 575-Nanometer-Emissionsfilter verwendet. Bestimmen Sie den Proteingehalt. Diese Abbildung zeigt die unterschiedlichen Niveaus der Proteinexpression auf einem Proteinarray.
Normalerweise können 20 % einer Genbibliothek nicht in einem nachweisbaren Maß exprimiert werden. Die Hintergrundwerte wurden mit Hilfe von Kammern bestimmt, die nicht mit DNA befleckt waren. Signale aus den entsprechenden Proteinkammern sind also entweder auf Rauschen oder unspezifische Absorption der markierenden Antikörper zurückzuführen.
Wenn es richtig durchgeführt wird, dauert die Geräteverifizierung vier Stunden und das Chip-Experiment fünf Stunden.
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Überblick
Diese Studie präsentiert einen mikrofluidischen Ansatz für die Expression von Proteinarrays, wobei ein Gerät mit Tausenden von Reaktionskammern verwendet wird, die durch mikromechanische Ventile gesteuert werden. Die Integration einer mikroarray-gedruckten Genbibliothek ermöglicht Transkription und Translation auf dem Chip und führt zu einem einsatzbereiten Proteinarray.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrofluidik
- Proteinexpression
- Genbibliotheken
Hintergrund
- Proteinarrays sind für verschiedene biologische Assays unerlässlich.
- Traditionelle Methoden erfordern oft Reinigungsschritte, was die Kompatibilität einschränkt.
- Mikrofluidische Geräte können den Prozess der Proteinexpression optimieren.
- Assembly PCR wird verwendet, um synthetische Gene für das Arraying zu generieren.
Zweck der Studie
- Ein modulares Proteinarray ohne Reinigungsschritte zu erstellen.
- Die Kompatibilität mit jeder Proteinbibliothek zu verbessern.
- Die Effizienz der Proteinexpression mittels Mikrofluidik zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Generierung synthetischer Gene durch Assembly PCR.
- Arraying synthetischer Gene auf Epoxy-Slides.
- Herstellung eines mikrofluidischen Geräts mittels PDMS.
- Einführen von Kaninchen-Retikulozyten-Lysat in das Gerät für die Proteinexpression.
Hauptergebnisse
- Ein funktionsfähiges mikrofluidisches Gerät wurde erfolgreich erstellt.
- Proteine wurden on-chip ohne Reinigung exprimiert.
- Die Methode zeigte Kompatibilität mit verschiedenen Proteinbibliotheken.
- On-chip Transkription und Translation wurden effektiv erreicht.
Schlussfolgerungen
- Dieser mikrofluidische Ansatz vereinfacht die Erstellung von Proteinarrays.
- Es eliminiert den Bedarf an Reinigung und verbessert die Verwendbarkeit.
- Die Technik kann auf verschiedene Proteinbibliotheken für die Forschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
