Name: Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Live-Cell-Imaging verwendet wird, um das Zellschicksal nach Paclitaxel-Behandlung zu bewerten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung individueller Zellantworten auf verschiedene Dosen des anti-mitotischen Medikaments.

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AFB, MAV und NJG möchte Ryan Quinton für Kommentare auf dem Manuskript und Adrian salischen für das TDRFP-NLS-Konstrukt zu danken. AFB und MAV sind NIGMS biomolekularen Pharmakologie Ausbildung Grant 5T32GM008541 finanziert. NJG ist Mitglied der Shamim und Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories und stützt sich auf NIH-Stipendien GM117150 und CA-154531, Karin Grunebaum Foundation, die Smith-Familie-Awards-Programm, Searle Scholars Program und Melanoma Research Alliance.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung nicht-transformierten und chromosomal stabilen retinalen pigmentierten epithelialen (RPE-1) Zelllinie für live Cell imaging Experimente. Jedoch kann dieses Protokoll an jedem adhärente Zell-Linie angepasst werden, so lange Zelle Kulturbedingungen nach Bedarf angepasst werden. Alle Verfahren müssen institutionelle Biosafety und ethischen Richtlinien und Vorschriften einhalten.
1. Vorbereitung der Zellen für Live Cell Imaging
<ol><li>
Verwenden Sie frisch aufgetaut und frühe Passage RPE-1 Zellen mit dem Ausdruck menschlichen Histon, die H2B verschmolzen zu einem fluoreszierenden Protein (z.B. H2B-GFP) oder das FUCCI-System (ein detailliertes Protokoll zum FUCCI exprimierenden Zellen erzeugen finden Sie im Referenz-45) mitotische Zelle Schicksal zu beurteilen.
	<ol>
<li>Um die Häufigkeit der nuklearen Bruch zu messen, verwenden Sie RPE-1-Zellen H2B-GFP und ein Tandem-Dimer rot fluoreszierenden Proteins verschmolzen zu einem einzigen nuklearen Lokalisierung-Signal (TDRFP-NLS) zum Ausdruck bringt. Hinweis: Konstrukte der drei grüne fluoreszierende Proteine verschmolzen im Tandem zu einem einzigen nuklearen Lokalisierung-Signal (GFP3- NLS) wurden auch verwendet, um Bruch (wie in Referenz42) zu demonstrieren.</li>
		<li>Pflegen Sie Zellen auf 10 cm Gewebekultur Platten in das entsprechende Wachstumsmedium. RPE-1-Zellen in Phenol rotfrei-, bestehen Dulbeccos Eagle Medium/Nährstoff-Mischung geändert f-12 (DMEM:F12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 IU/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aspirieren Sie Medium aus den Zellen, waschen Sie das Gewebe Kulturschale mit 10 mL steril, Raumtemperatur Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verbleibenden Medium zu entfernen, und dann Aspirieren der PBS.
	<ol>
<li>Hinzufügen von 0,25 % 2 mL Trypsin mit Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) in die Zellen und Inkubation bei 37 ° C für 3 Minuten oder bis der Großteil der Zellen von der Platte gelöst haben. Hinweis: Bewahren Sie Zellen nicht im Trypsin länger als nötig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fügen Sie 10 mL der kompletten Medium zu sammeln die trypsiniert Zellen mit einer 10 mL serologische Stripette und in einem 15 mL konische Röhrchen zu verzichten.
	<ol>
<li>Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 180 X g für 3 min bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie den überstand, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Pellet und dann Aufschwemmen Sie gründlich das Pellet in 10 mL frisches Medium durch sanft pipettieren des Mediums nach oben und unten in der serologischen Stripette.</li>
	<li>
Verwenden Sie eine Hemocytometer oder eine automatisierte Zelle zählen Maschine Zellen46zu zählen.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie Zellen in einem neuen konischen Rohr bis 30.000 Zellen/mL des kompletten Medium.</li>
		<li>Platte 30.000 RPE-1 Zellen (1 mL Volumen) pro Bohrloch eine 12-Well Glasboden (#1.5 Dicke) imaging Gericht um die nötige zelluläre Dichte am nächsten Tag (30 – 50 % Zusammenfluss) zu erreichen. Hinweis: Immer verarbeiten Sie die Platte mit Handschuhen und achten Sie darauf, nicht den Glasboden berühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Können Sie Zellen in einem 37 ° C Gewebekultur Inkubator wachsen, bis sie vollständig legen und flach auf die Glasboden-Bildplatte. Während Zellen in weniger als 4 h angefügt werden können, empfiehlt es sich, dass Zellen nicht mit Medikamenten behandelt und bis zum nächsten Tag abgebildet.</li>
	<li>
Fügen Sie Paclitaxel (aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) auf die gewünschte Endkonzentration im kompletten Medium und Mischung gründlich hinzu.
	<ol>
<li>Bereiten Sie komplette Medium mit ein gleiches Volumen an DMSO allein, als ein Steuerelement zu verwenden.</li>
		<li>Drogen- oder DMSO auf 37 ° C vor dem Hinzufügen zur Zellen-haltigem Medium warm. Dadurch wird fokal Drift durch eine plötzliche Temperaturwechsel verhindert.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Paclitaxel oder DMSO allein zu einzelnen Vertiefungen der bildgebenden Schale 12-Well-haltigem Medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Einrichten der Mikroskop für Live Cell Imaging
<ol><li>Reinigen Sie den Glasboden der bildgebenden Schale mit optischen Reiniger entfernen alle Fingerabdrücke oder Staub, die Bildgebung stören können. Verwenden Sie ausreichend optischen Reiniger zu die gesamten Glasfläche benetzen.</li>
	<li>Die Glasboden Form auf den Mikroskoptisch in den bildgebenden Dish-Adapter, die Kunststoffabdeckung aus der Schale, und bedecken Sie die Schüssel mit einer Glasplatte Kammer. Sicherstellen Sie, dass die Kammer hat ein Ventil, um einen stetigen Luftstrom bestehend aus 5 % CO2zu ermöglichen. Hinweis: Um die 5 % CO2befeuchten, fließt das Gas durch Schläuche in ein steriles Wasser-Bad-Gehäuse eingesetzt. Dies ermöglicht das Gas bis zu 95 % Luftfeuchtigkeit equilibriert geworden.</li>
	<li>Einleitung/Kalibrieren der codierten Bühne mit dem Softwareprogramm das Mikroskop zu kontrollieren. Dies sorgt für genaue X / Y-Koordinaten und fokale Drift verhindern.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich auf die Zellen mittels Phasenkontrast-Optik und führen Sie Kohler Beleuchtung (in Referenz47ausführlich beschrieben), um das Licht zu konzentrieren und optimalen Kontrast bieten.</li>
	<li>
Verwenden Sie Software zur Datenerfassung um zu bestimmen, die optimale Belichtungszeiten für weißes Licht und alle fluoreszierenden Kanäle verwendet wird (Aufnahmen, dass geben 75 % Pixel Sättigung auf der Kamera sind ideal, vorausgesetzt, diese Menge an Licht nicht giftig für Zellen).
	<ol>
<li>Datenerfassungs-Software verwenden, um mehrere, wählen nicht überlappende Gesichtsfelder aus jedem Brunnen für die Bildgebung. Wählen Sie Image Regionen wo Zellen haben auch den Glasboden eingehalten und liegen zwischen 50 % und 70 % Zusammenfluss. Vermeiden Sie Bereiche der aufgehäuften Zellen, wie dies die anschließende Analyse erschweren wird. Hinweis: Es ist wichtig, nicht überlappende Gesichtsfelder aus jedem Brunnen zu vermeiden, verfolgen die gleichen Zellen zweimal zu haben. Wenn Zellen sehr bewegliche sind, ist es möglicherweise notwendig, mehrere Bilder, die strahlenförmig von einem zentralen Punkt und Heften Sie sie wieder zusammen zu einem großen Sichtfeld zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aktivieren Sie das Mikroskop Autofokus Funktion um sicherzustellen, dass alle Punkte im Fokus für die Dauer des Experiments beibehalten werden.</li>
	<li>Zur Beurteilung der mitotischen Zellen Schicksal gesetzt der imaging-Software zum Sammeln von jedem ausgewählten Sichtfeld Bilder alle 10 Minuten für bis zu 96 h. Unperturbed Mitose dauert 20-40 min, und somit 10 min Abständen werden genug Probenahme zu identifizieren, wenn Zellen sich teilen. Um nukleare Bruch zu identifizieren, die eine vorübergehende Veranstaltung handelt, Abrufen von Bildern alle 5 Minuten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Computer Bild-Erfassungssoftware fahren Auto-Update, Bildschirmschoner und Energieeinsparung Modi deaktiviert, als diese Bildaufnahme über lange Experimente oft stören können.</li>
	<li>Das Image Experiment zu initiieren. In regelmäßigen Abständen bestätigen Sie, dass die Bildaufnahme im Laufe des Videos reibungslos abläuft.</li>
</ol>3. video Analyse zur Ermittlung von Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel
<ol><li>Bestätigen Sie, dass die abgebildete Zellen im Laufe des imaging Experiment gesund sind. Lebensfähig und aktiv wuchernden sollten DMSO behandelte Kontrollzellen. Hinweis: Wenn Zellen weisen Anzeichen von Stress, nicht das Video quantitate und stattdessen auf die Optimierung der bildgebenden Bedingungen48. Anzeichen von Stress Bildgebung sind Blebbing/sterben Zellen, Zellen, die nicht zu befestigen/Spread auf dem Teller und Zellen, die eine geringe mitotische Index und/oder längerer Mitose zeigen. Mögliche Quellen von Stress sind Schwankungen in der Temperatur oder CO2 -Konzentration im Inneren der bildgebenden Kammer oder Phototoxizität48.</li>
	<li>Wenn eine gesamte Sichtfeld mit einem 10 X oder 20 X Objektiv imaging, können Hunderte von einzelnen Zellen vorhanden sein. Deshalb um Quantifizierung zu unterstützen, teilen Sie das Sichtfeld in kleinere Quadranten mit verfügbaren Software-Tools. Punkten Sie Zellen in jedem Quadranten separat (siehe Schritte 3.3.1–3.6.2).</li>
	<li>
Bei der Analyse der des Videos verfolgen Sie jede Zelle in eine zusammengeführte Ansicht mit Phasenkontrast-und/oder fluoreszierende Bilder. Verwenden Sie Software-Analyse-Tools, um die zusammengeführte Ansicht zu erstellen.
	<ol>
<li>Beginnend am Anfang des Videos, identifizieren Sie eine einzigen Interphase Zelle zu und verfolgen Sie ihre Fortschritte durch den Zellzyklus mit Phase-Optik. Um eine einzelne Zelle zu verfolgen, beobachten Sie die Zelle von Frame zu Frame vom Auge. Interphase Zellen aufgrund ihrer abgeflachten Morphologie (als durch Phasenkontrast-bewertet) und ihren Mangel an DNA-Kondensation (wie H2B-GFP bewertet) zu identifizieren (Abb. 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellen, die Mitose durch Beobachtung der Zelle Rundung (mit Phasenkontrast-Optik) eingeben zu identifizieren und/oder Chromosom Kondensation (mit H2B-GLP) (Abb. 1A-C). Beide Zellen Rundung und Chromosom Kondensation werden leicht vom Auge visualisiert.
	<ol>
<li>Beschriften Sie die Zeit, wenn die Zelle Mitose betritt. Fahren Sie fort, die Zelle zu verfolgen, bis er seinem Schicksal (Anaphase wie in Schritt 3.5, Zelltod von Mitose wie in Schritt 3.6.1 oder mitotische Schlupf wie in Schritt 3.6.2) erreicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontrollzellen sollte effizient richten ihre Chromosomen und geben Sie Anaphase innerhalb von 1 h (Abbildung 1). Visualisieren Sie Anaphase durch Phasenkontrast-Optik, wie die Zelle beginnt, in zwei oder durch Visualisierung der polwärts verschieben Chromosomen gekennzeichnet mit H2B-GLP (Abbildung 1A) einklemmen. Beschriften Sie die Zeit, wenn die Zelle Anaphase erfährt.</li>
	<li>
Im Gegensatz dazu bleiben Zellen mit Paclitaxel behandelt abgerundet mit kondensierten Chromosomen für mehrere Stunden (3-40 h) (Abbildung 1 b-D).
	<ol>
<li>Mitotically verhaftet Zellen, die durchmachen Zelltod zu identifizieren. Hinweis: Zellen, die während der Mitose sterben werden durch Phasenkontrast-Mikroskopie visualisiert, wie Zellen auf, schrumpfen und/oder Bruch (Abbildung 1 b). Wenn H2B-GFP imaging, werden auch die Chromosomen während Zelltod fragment.</li>
		<li>Identifizieren Sie mitotically verhaftet Zellen, die Zelle Schlupf zu unterziehen. Hinweis: Zellen, die mitotische Schlupf zu unterziehen sind durch Phasenkontrast-Mikroskopie, beobachtet, wie sie in Interphase abflachen und decondense Chromosomen ohne Anaphase (Abbildung 1). Zellen, die mitotische Schlupf unterziehen geben Anlass zu großen tetraploide Zellen, die sind oft mehrkernig (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weiter verfolgen Zellen aus der ursprünglichen Sehfeld. Sobald eine ganze Sichtfeld verfolgt wird, eine separate Blickfeld gewonnenen gleich gut bewegen und weiter tracking-Zellen.</li>
</ol>4. video Analyse zur Ermittlung von Zelle Schicksal nach mitotischen Schlupf
<ol><li>
Zelle Schicksal nach mitotischen Schlupf (wie in Schritt 3.6.2 beschrieben) zu bewerten mit RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck der FUCCI System. Neben Phasenkontrast-Bildgebung, ist es notwendig, rote Fluoreszenz (indikativ für G-1 -phasig) und grüne (indikativ für S/G2/m) Fluoreszenzbilder zu erwerben).
	<ol>
<li>Verfolgen Sie FUCCI RPE-1-Zellen wie unter Punkt 3.3 bis 3.7 beschrieben.<ol>
<li>Um zu bestätigen, dass das FUCCI System ordnungsgemäß funktioniert, überprüfen Sie, ob Kontrolle alternativer Ausdruck der rote und grüne fluoreszierende Proteine entsprechend aus der Analyse der Bilddaten der Leben-Zelle Zellen. Kontrollzellen sollte der Übergang von ausstellenden völlig nuklearen rote Fluoreszenz ausstellen ganz nuklearen grün fluoreszieren während Interphase Zellen Fortschreiten von G-1 , S-Phase. Zellen sollten weiterhin grün fluoreszieren in die Fertigstellung der Mitose ausstellen. Unmittelbar nach der Mitose sollen die Zellen wieder ganz rote Fluoreszenz während der Interphase aufweisen. Hinweis: Während Methoden existieren um RFP und GFP-Fluoreszenz-Intensitäten aus dem FUCCI System in einzelne Zellen mit fluoreszierenden Spuren49zu quantifizieren, ist dies oft nicht notwendig, da der Fluoreszenz-Farbwechsel robust und mit dem Auge sichtbar ist.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identifizieren Sie Zellen in Mitose mit Phasenkontrast-Mikroskopie verhaftet zu und verfolgen Sie bis mitotischen Schlupf zu unterziehen wie in 3.4 und 3.6.2 beschrieben. Zellen, die Rutschen aus Mitose und zurück in Interphase ändert der ausstellenden grün fluoreszieren bei Mitose, rote Fluoreszenz in G1 Phase (Abbildung 2A- C).
	<ol>
<li>Verfolgen Sie diese Zellen mittels Phasenkontrast- und Epifluorescent Bildgebung mit dem Auge beurteilen ihre Zelle Schicksal (Bild 2D) rutschte.<ol>
<li>Identifizieren Sie die Zellen, die den Zellzyklus erneut eingeben. Diese Zellen sind gekennzeichnet durch die rot-grün-Änderung der Fluoreszenz-Ausdruck mit dem FUCCI-System, das angibt, G1/s Übergang (Abb. 2A).</li>
			<li>Zellen, die G1 Zellzyklus Festnahme unterziehen zu identifizieren. Diese Zellen sind gekennzeichnet durch Ausdruck der rote Fluoreszenz, die weiterhin für > 24 h (Abb. 2 b).</li>
			<li>Zellen, die in Interphase sterben zu identifizieren. Diese Zellen werden durch Bruch/Blebbing/schrumpfen mit Phasenkontrast-Bildgebung (Abbildung 2) Zelle identifiziert.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. video Analyse zur Ermittlung der Häufigkeit der Kernhülle Bruch
<ol><li>Verwenden Sie RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck H2B-GFP und TDRFP-NLS Kernhülle Bruch zu beurteilen. Erwerben Sie neben Phasenkontrast-Bildgebung, rote Fluoreszenz (TRITC) und grüne (FITC) Fluoreszenzbilder. Abrufen von Bildern alle 5 min um Bruch zu visualisieren. Hinweis: Es ist entscheidend für die Zell-Linien zu erzeugen, in denen die TDRFP-NLS effizient in den Zellkern mit minimalen zytoplasmatischen Fluoreszenz importiert wird.</li>
	<li>Bildzellen wie unter Punkt 3.3 durch 3.4 beschrieben. Die TDRFP-NLS Fluoreszenzsignal und H2B-GFP sollte während der Interphase Co lokalisieren. Bei der Mitose (als visualisierte von Zelle Rundung mit Phase Optik und/oder Chromosom Kondensation durch H2B-GFP), die Kernhülle brechen und das TDRFP-NLS-Signal wird zytoplasmatisch (Abb. 3A). Nach Mitose wird die Kernhülle wird in den Tochterzellen zu reformieren und die TDRFP-NLS-Signal nukleare.</li>
	<li>Live Cell Imaging verfolgen Sie Tochterzellen während der anschließenden Interphase. Identifizieren Sie nukleare Bruch Ereignisse durch die Beobachtung einer transienten Platzen der nuklearen lokalisiert TDRFP-NLS in die umgebenden Zytoplasma. Innerhalb von Minuten die Kernhülle wird repariert und die TDRFP-NLS wird in den Zellkern (Abbildung 3A) relocalized. Hinweis: Oft wird der Zellkern-DNA, wie durch H2B-GFP, visualisiert eingesehen werden außerhalb der Bruch-Website als eine kleine Blase herausragen.</li>
	<li>Ergebnis der Bruchteil der Kerne, die eine Bruch-Veranstaltung während der Interphase unterzogen werden. Um diesen Anteil zu zählen, die Anzahl der Zellen, die eine Bruch-Veranstaltung über die Gesamtzahl der Zellen verfolgt zu unterziehen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der wichtigste Aspekt der langfristigen live Cell Imaging sichert die Gesundheit der Zellen wird abgebildet. Es ist wichtig, dass die minimale äußere Umwelt Stressoren, wie unwürdigen Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit und/oder CO2 -Konzentration Zellen ausgesetzt werden. Es ist auch wichtig, lichtbedingten von fluoreszierenden Erregung Beleuchtung zu begrenzen, wie imaging Stress genannt wird, auf die Zelle Verhalten50. Begrenzung der lichtbedingten kann auf vielfält...

Anti-mitotische Drogen habe lange in der chemotherapeutischen Therapien verschiedener Arten von soliden Tumoren und zeigen oft große Wirksamkeit1,2,3. Mechanistisch, diese Medikamente stören normalen mitotischen fortschreiten und Förderung der mitotischen Verhaftung in rasch proliferierenden Krebszellen. Schicksal der Zelle als Reaktion auf mitotischen Verhaftung ist jedoch sehr unterschiedlich: während ein Teil der Zellen Absterben von Zellen direkt von Mitose erfährt, andere Mitose verlassen und zurückkehren, um als tetraploide Zellen interphase (ein Prozeß benannt mitotischen Schlupf)4, 5,6,7,8. Diese Interphase Zellen Apoptose führen, ständige Zellzyklus Festnahme zu unterziehen oder sogar erneut eingeben der Zellzyklus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Zellen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch Ausrutschen in Interphase, nur für den Zellzyklus, die nach dem Medikament entfernen, erneut eingeben können daher auf das erneute Auftreten von Krebs-Zell-Populationen beitragen. Darüber hinaus Rückfall Zellen, dass Slip von Mitose tetraploiden und tetraploidy bekannt ist, Chromosom Instabilität zu fördern, der Tumor antreibt12,13,14,15. Daher ist es wichtig, aktuelle Therapie zu optimieren, Festlegung der Faktoren, die Zelle Schicksal als Reaktion auf Anti-mitotische medikamentöse Behandlungen zu steuern.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um direkt zu beobachten und studieren das Schicksal der Zellen, die längeren mitotischen Verhaftung als Reaktion auf die Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu unterziehen. Paclitaxel ist eine etablierte Therapie in der Klinik und hat sich als sehr wirksam in vielen Arten von Tumoren, einschließlich der Brust, der Eierstöcke und der Lunge16,17,18,19, 20. Paclitaxel, die eine Pflanze Alkaloid aus der Rinde der Eibe abgeleitet ist, stabilisiert Mikrotubuli und verhindert so deren Dynamik21,22. Während Dämpfung der Mikrotubuli Dynamik von Paclitaxel Zellzyklus Progression von G1 bis G2, nicht beeinflusst führt das Medikament zu einer nachhaltigen Aktivierung der Spindel Baugruppe Prüfpunkt während der Mitose durch die Behinderung Kinetochor-Mikrotubuli Anlage (rezensiert in der Tiefe hier23,24)25. Infolgedessen ist Anaphase Beginn in Paclitaxel-behandelten Zellen und führt zu einer längeren mitotischen Verhaftung verhindert.
Dieses Protokoll wird zunächst Ansätze zur Identifizierung der mitotischen Zellen in live Cell imaging Experimente beschreiben. Mitose kann in adhärenten Gewebekultur Zellen durch zwei deutliche zellenveränderungen biologische visualisiert werden. Erstens werden Chromosomen unmittelbar vor dem Zusammenbruch der Kernhülle hoch verdichtet. Während oft nachweisbar durch standard Phasenkontrast-Mikroskopie, Chromosom Kondensation deutlicher zu erkennen, dass Leuchtstofflampen mit diesem Label Chromosomen (z.B. eindringmittel beschriftet Histon-Proteine) Stichwörter. Zweite, mitotische Zellen können auch durch die dramatischen morphologische Veränderungen identifiziert werden, die aus Zelle Rundung ergeben.
Dieses Protokoll wird dann zeigen, wie live Cell imaging Ansätze verwenden, um das Schicksal der Zellen erleben längerer mitotischen Verhaftung zu verfolgen. Zellen in Mitose verhaftet durchlaufen eine der drei unterschiedliche Schicksale. Erstens können Zellen Zelltod während der Mitose durchlaufen. Dieses Phänomen wird leicht durch Lichtmikroskopie, visualisiert, wie sterbende Zellen zu schrumpfen, Blase und/oder Bruch eingehalten werden. Zweitens: Zellen können Mitose verlassen und zurück zurück zur ohne Chromosom Segregation oder zytokinese interphase, bezeichnet ein Prozess mitotischen Schlupf. Die enttauung der Chromosomen und/oder die Abflachung der mitotischen Zellen leicht identifiziert dieses Prozesses. Zellen, die von Mitose abrutschen auch oft unregelmäßig, Multi-gelappte Kerne anzeigen und häufig mehrere Mikrokerne5Hafen. Drittens können Zellen in Mitose verhaftet Anaphase zu initiieren und fahren Sie durch Mitose nach einer langen Verzögerung. Während ungewöhnlich bei höheren Konzentrationen des Medikaments, schlägt dieses Verhalten, dass die verhafteten Zellen den Spindel Baugruppe Checkpoint erfüllt haben können oder die Spindel Baugruppe Checkpoint teilweise geschwächt oder defekt ist. Anaphase auftreten kann durch Chromosom Segregation und anschließende zytokinese mit live Cell Imaging sichtbar gemacht werden.
Leben-Zelle Bildgebungsverfahren, das Schicksal der Zellen zu verfolgen, die mitotische Zelltod zu entziehen, durch mitotische Schlupf unterziehen werden auch beschrieben werden. Zellen, die mitotische Schlupf zu unterziehen sterben in der anschließenden Interphase, auslösen eine dauerhaftere G1 Zellzyklus Festnahme oder geben Sie den Zellzyklus um eine neue Runde der Zellteilung4zu initiieren. Ein Ansatz mit FUCCI (fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus) Indikatorensystems der Anteil der Zellen zu bestimmen, die den Zellzyklus mitotischen Schlupf nach Wiedereintritt werden beschrieben. FUCCI ermöglicht die direkte Visualisierung des Übergangs G1/s und kann in Verbindung mit langfristigen live-Cell imaging in Vitro und in Vivo26,27verwendet werden. Das FUCCI System nutzt zwei eindringmittel markierte Proteine, verkürzte Formen des hCdt1 (Chromatin Lizenzierung und DNA-Replikation Faktor 1) und hGeminin, deren Ebenen schwingen basierend auf Zellzyklus Position. hCdt1 (verschmolzen zu einem rot fluoreszierende Protein) ist auf einem hohen Niveau in G1 Phase, wo es um DNA für die Replikation zu lizenzieren wirkt, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase, SCFSkp2 präsentieren und abgebaut, während S/G2/m Phasen, um zu verhindern, dass erneute Replikation von DNA-26. Im Gegensatz dazu hGeminin (verschmolzen zu einem grün fluoreszierendes Protein), ist ein Hemmstoff des hCdt1 dessen Ebenen Gipfel während S/G2/m, aber ist Ubiquitinated von der E3-Ubiquitin-Ligase APCCdh1 und am Ende der Mitose und im gesamten G1 abgebaut 26. infolgedessen FUCCI liefert eine einfache Fluoreszenz Auslesen der Zellzyklus-Phase, wie Zellen rote Fluoreszenz während G1, und grüne Fluoreszenz während S/G2/m aufweisen. Das FUCCI System ist ein wesentlicher Fortschritt gegenüber anderen Ansätzen (z. B. Bromodeoxyuridine Färbung), proliferative Zellen zu identifizieren, weil es keine Zelle Fixierung erfordert und für die einzelne Zelle Bildgebung ohne die Notwendigkeit für zusätzliche erlaubt pharmakologische Behandlungen, Zellpopulationen zu synchronisieren. Obwohl nicht in diesem Protokoll diskutiert, wurden zusätzliche live-Cell-Sensoren auch entwickelt, um Zellzyklus Fortschreiten, einschließlich eines Helikase B Sensors für G128, DNA Ligase-RFP29 und PCDNA-GFP30 Sensoren visualisieren für die S-Phase und die jüngsten FUCCI-4 Sensor erkennt die alle Phasen des Zellzyklus-31.
Schließlich wird ein live-Zelle bildgebendes Verfahren Kernhülle Bruch erkennen beschrieben. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die nukleare Umschläge von Krebszellen instabil und neigen zu platzen, wodurch der Inhalt des Nukleoplasma und Zytoplasma zu vermischen. Dieses Phänomen bezeichnet nukleare Bruch, kann DNA-Schäden und Stimulation der angeborenen Immunantwort32,33,34,35,36,37, fördern. 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. während die zugrunde liegenden Ursachen der nuklearen Bruch unvollständig gekennzeichnet bleiben, es ist bekannt, dass Verformungen im Kernstruktur mit einer erhöhten Inzidenz von nuklearen Bruch42 korrelieren. Ein bekannter Effekt von Paclitaxel Behandlung ist die Generation der auffallend abnorme atomaren Strukturen nach Mitose; als solche wird eine Methode mit Hilfe von live-Cell imaging, um nukleare Bruch zu quantifizieren beschrieben werden, während die Erkundung auch Paclitaxel Behandlung erhöht sich die Häufigkeit der nuklearen Bruch Ereignisse. Nukleare Bruch kann durch die beobachteten Auslaufen eines nuklearen gezielt fluoreszierenden Proteins in das Zytoplasma (z. B. ein Tandem-Dimer Wiederholen des RFP verschmolzen zu einem nuklearen Lokalisierung Signal, TDRFP-NLS) erkannt werden. Diese Leckage ist deutlich sichtbar durch Auge, die einfachen Quantifizierung der Bruch Ereignisse ermöglicht.
Dieses Protokoll erfordert ein Weitfeld Epifluoreszenz-Mikroskop, das mit einem codierten Bühne und Autofokus-Software ausgestattet ist. Die codierte Bühne ermöglicht eine präzise automatische Bewegung zu definierten X / Y-Koordinaten, während Autofokus-Software für die Dauer der bildgebenden Zellen im Fokus behält. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll Ausrüstung weiterhin Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2 befeuchtet Atmosphäre. Dies kann erreicht werden durch umschließen das gesamte Mikroskop innerhalb einer Temperatur und Atmosphäre kontrolliert Gehäuse oder mithilfe Bühne-Top-Boxen, dass lokal verwaltet, Temperatur und Umgebung. In diesem Protokoll verwendeten Phasenkontrast-Ziel ist es ein Plan Fluor 10 X mit einer numerischen Apertur von 0,30. 20 X Ziele sind aber auch ausreichend, um beide abgerundeten mitotischen und abgeflachte Interphase Zellen in eine einzelne Brennebene zu identifizieren. Wenn Phasenkontrast-durchführen kann bildgebende Verfahren (wie in diesem Verfahren beschrieben), die Abdeckung entweder aus Glas oder Kunststoff sein. Wenn differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie verwendet wird, ist es unerlässlich, eine Glasabdeckung verwenden, um zu verhindern, dass die Depolarisation des Lichts.

<table><tbody><tr><td>phenolrotfrei, DMEM:F12-Medium</td><td>Hyclone</td><td>SH3027202</td><td></td></tr><tr><td>10 % fötalem Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>100 IE/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin.</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Gemini</td><td>50-753-3104</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Bildgebungsschüssel mit Glasboden</td><td>Cellvis</td><td>P12-1,5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>TSZ Chem</td><td>RS036</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>NC0215085</td><td></td></tr><tr><td>Umwelt Kammer</td><td>In Vivo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7432000201</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Polystyrol-Gewebekulturplatten</td><td>Falcon</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische Einwegpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>5804R 15 Ampere Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>97007-370</td><td></td></tr><tr><td>1000 Mikroliter Pipette</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>20 Mikroliter Pipette</td><td>Gilson</td><td>Pipetman Classic</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipettenspitzen</td><td>Sharp</td><td>p1126</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipettenspitzen</td><td>Sharp</td><td>p1121</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Galaxy 170S</td><td>Eppendorf</td><td>CO17011005</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td>Integra</td><td>156401</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E-PFS Inverses Mikroskop für die Bildgebung lebender Zellen</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MEA53100</tr><tr><td>Prior X-Y Stage System und Weißlicht-LED-Beleuchtung</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H117P1N4</td><td></td></tr><tr><td>Prior Proscan 3 Controller XYZ mit Encodern</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>500-H31XYZE</td><td></td></tr><tr><td>Andor Digitalkamera</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>D10NLC</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements AR Software</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MQS31000</tr><tr><td>SOLA LED-Beleuchtung für</td><td>Fluoreszenz-Mikrovideoinstrumente, Inc.</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>InVivo-Klimakammer mit CO2-Durchflussregelung</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td>Ti-IVS-100</td><td></td></tr><tr><td>Ti-ND6-PFS Motorisierter Objektivrevolver mit perfektem Fokus</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MEP59391</tr><tr><td>Ti-C System Kondensatorrevolver</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MEL51000</tr><tr><td>Ti-C LWD LWD-Objektiveinheit für Systemkondensatorrevolver</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MEL56200</tr><tr><td>Te-C LWD Ph1 Modul</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MEH41100</tr><tr><td>CFI Plan Fluor DLL 10X Objektiv 0,3 wd 16mm</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MRH10101</tr><tr><td>CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM Objektiv</td><td>Micro Video Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>MRH48230</tr></tbody></table>

langfristige leben-cell imaging zu zelle schicksal als reaktion auf paclitaxel bewerten

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live Cell Imaging ist eine kraftvolle Methode, die verwendet werden, um biologische Phänomene in Einzelzellen direkt über längere Zeit zu visualisieren. Im letzten Jahrzehnt haben neue und innovative Technologien die Praktikabilität des live Cell Imaging erheblich verbessert. Zellen können jetzt im Fokus gehalten werden und kontinuierlich über mehrere Tage während gepflegt unter 37 °C und 5 % CO2 Zelle Kulturbedingungen abgebildet. Darüber hinaus können mehrere Sichtfelder aus verschiedenen experimentellen Bedingungen gleichzeitig, wodurch Hochdurchsatz-experimentelle Daten erworben werden. Live Cell Imaging bietet einen erheblichen Vorteil gegenüber fixiert-Cell Imaging, da für die direkte Visualisierung und zeitliche Quantifizierung der dynamische zelluläre Ereignisse. Live Cell Imaging kann auch Unterschiede im Verhalten einzelner Zellen identifizieren, die sonst verpasst würde mit bevölkerungsbezogenen Assays. Hier beschreiben wir leben-Cell imaging Protokolle, um Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel zu beurteilen. Wir zeigen, dass Methoden, ob mitotically visualisieren Zellen sterben direkt von Mitose oder schlüpfen wieder in Interphase verhaftet. Wir beschreiben auch, wie das fluoreszierende Ubiquitination basierende Zellzyklus-Anzeigesystem (FUCCI) der Bruch der Interphase Zellen von mitotischen Schlupf geboren bewerten, die in der Lage, wieder in den Zellzyklus sind einsetzbar. Schließlich beschreiben wir eine Leben-Zelle bildgebende Methode zur Kernhülle Bruch Ereignisse zu identifizieren.

Mit der oben beschriebenen Protokoll, wurden RPE-1-Zellen, die mit dem Ausdruck H2B-GFP mit einer Anti-mitotische oder Fahrzeug-Steuerung (DMSO) behandelt und analysiert von live Cell Imaging. Analyse ergab, dass 100 % der Kontrollzellen mitotischen RPE-1 Anaphase durchschnittlich 22 min. nach Eingabe von Mitose (Abbildung 1A, 1 D) eingeleitet. Im Gegensatz dazu ausgestellt RPE-1-Zellen mit Paclitaxel behandelt eine tiefgreifende mitotische V...

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Lebendzellbildgebung Entscheidungen über das Zellschicksal nach der Behandlung mit dem Antimitotikum Paclitaxel zu beurteilen. Mit dieser Methode können wir visualisieren, wie einzelne Zellen auf unterschiedliche Dosen des Antimitotikums Paclitaxel reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Populationen liefert, die mit der Bildgebung fester Zellen oder populationsbasierten Assays nicht gewonnen werden können.Diese Methode wird von Marc Vittoria, einem MD/PhD-Kandidaten im Ganem-Labor, demonstriert. Reinigen Sie zunächst den Glasboden der Bildgebungsschale mit optischem Reiniger, um Fingerabdrücke oder Staub zu entfernen, die die Bildgebung beeinträchtigen könnten. Verwenden Sie ausreichend optischen Reiniger, um die gesamte Glasoberfläche zu benetzen.Platzieren Sie die Glasbodenschale mit den Zellen auf dem Mikroskoptisch in den Adapter für die Bildgebungsschüssel. Entferne die Plastikabdeckung von der Schale und decke die Schale mit einer Glaskammer ab. Stellen Sie sicher, dass die Kammer über ein Ventil verfügt, um einen gleichmäßige

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf...

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Die zytotoxische Aktivität der Phenanthridin PJ-34 in Krebszellen Mitose wurde in Echtzeit Live-konfokale Bildgebung dokumentiert. PJ-34 ausgerottet menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231-Zellen, die extra Centrosomen in Mitose. Im Gegensatz zu normalen bifokalen Mitose wurden die extra Zentrosome in den beiden Spindelpole in Gegenwart von PJ-34 gruppiert.

Cell Death mit Abnormal Mitose Assoziierte Beobachtet von konfokalen Imaging im Live Cancer Cells

Hier beschreiben wir eine Methode der Langzeit-Zeitraffermikroskopie, um einzelne Zellen als Reaktion auf Anti-Krebs-Therapeutika longitudinal zu verfolgen.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

In diesem Artikel berichten wir über ein Protokoll, das eine in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen (MCF-7TXT) beschreibt. Bei dieser Methode wird ein Dekonvolutionsmikroskopie-Bildgebungssystem verwendet, um die Expression von GFP-Tubulin in Zielzellen nachzuweisen.

Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

Live Cell Imaging ist ein mächtiges Werkzeug, um dynamische Prozesse zu visualisieren. Die Prüfung der fixen Zellen bietet nur statische Bilder, was zu Fehlinterpretationen und Verwirrung über den Prozess führen kann. Dieses Werk stellt eine Methode zur Aufnahme, Wirkstofffreisetzung und intrazelluläre Lokalisation der liposomalen Nanopartikel in lebenden Zellen zu studieren.

Verwendung von In-vitro- Live Cell Imaging zur Erkundung Chemotherapeutika geliefert durch Lipid-basierte Nanopartikel

Aufbau einer stabilen Zelllinie überexprimierenden gen des Interesses Genfunktion zu studieren kann durch stabile Transfektion-Kommissionierung einzelnen Klone nach transfecting sie über retroviralen Infektion durchgeführt werden. Hier zeigen wir, dass HT29-DR3 Zelllinien erzeugt auf diese Weise die Mechanismen aufzuklären, welche, die Tod Rezeptor 3 (DR3) zum Mitosehemmstoffen-induzierten Apoptose beiträgt.

Gründung von Zelllinien überexprimiert DR3 um die Apoptotic Antwort auf Anti-mitotische Therapeutika zu bewerten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische Methode für Organoid-Wirkstoff-Screenings mit mittlerem bis hohem Durchsatz und mikroskopunabhängige, automatisierte Bildanalysesoftware zur Quantifizierung und Visualisierung multiparametrischer, einzelorganoider Arzneimittelreaktionen zur Erfassung der intratumoralen Heterogenität.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Multiplex-Lebendzell-Bildgebung für das Ansprechen auf Medikamente in patientenabgeleiteten Organoidmodellen von Krebs

Erfahren Sie, wie Live-Cell-Imaging verwendet wird, um das Zellschicksal nach Paclitaxel-Behandlung zu bewerten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung individueller Zellantworten auf verschiedene Dosen des anti-mitotischen Medikaments.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

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