Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe der Lebendzellbildgebung Entscheidungen über das Zellschicksal nach der Behandlung mit dem Antimitotikum Paclitaxel zu beurteilen. Mit dieser Methode können wir visualisieren, wie einzelne Zellen auf unterschiedliche Dosen des Antimitotikums Paclitaxel reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Populationen liefert, die mit der Bildgebung fester Zellen oder populationsbasierten Assays nicht gewonnen werden können.

Diese Methode wird von Marc Vittoria, einem MD/PhD-Kandidaten im Ganem-Labor, demonstriert. Reinigen Sie zunächst den Glasboden der Bildgebungsschale mit optischem Reiniger, um Fingerabdrücke oder Staub zu entfernen, die die Bildgebung beeinträchtigen könnten. Verwenden Sie ausreichend optischen Reiniger, um die gesamte Glasoberfläche zu benetzen.

Platzieren Sie die Glasbodenschale mit den Zellen auf dem Mikroskoptisch in den Adapter für die Bildgebungsschüssel. Entferne die Plastikabdeckung von der Schale und decke die Schale mit einer Glaskammer ab. Stellen Sie sicher, dass die Kammer über ein Ventil verfügt, um einen gleichmäßigen Luftstrom zu ermöglichen, der aus 5 % Kohlendioxid besteht.

Um das 5%ige Kohlendioxid zu befeuchten, wird das Gas durch einen Schlauch geströmt, der in ein steriles Wasserbadgehäuse eingeführt wird. Dadurch kann das Gas auf eine Luftfeuchtigkeit von 95 % ausgeglichen werden. Initiieren und kalibrieren Sie den codierten Tisch mit dem Softwareprogramm, das das Mikroskop steuert.

Dies gewährleistet genaue XY-Koordinaten und verhindert Fokusdrift. Führen Sie als Nächstes die Kohler-Beleuchtung durch, indem Sie den Kondensor anheben und die Blende schließen, so dass das Feld dunkel ist. Senken Sie den Kondensor ab, bis eine scharfe, sechseckige Lichtform sichtbar ist.

Verwenden Sie dann die Zentrierschrauben, um das Sechseck des Lichts im Sichtfeld zu zentrieren. Sobald die sechseckige Form sichtbar ist, öffnen Sie die Blende, bis das gesamte Sichtfeld beleuchtet ist. Aktivieren Sie den Autofokus des Mikroskops, um sicherzustellen, dass alle Punkte während der gesamten Dauer des Experiments scharf bleiben.

Verwenden Sie die Erfassungssoftware, um aus jedem Well mehrere nicht überlappende Sichtfelder für die Bildgebung auszuwählen. Wählen Sie Bildgebungsbereiche aus, in denen die Zellen gut am Glasboden haften und zwischen 50 und 70 % konfluent sind. Vermeiden Sie Bereiche mit verklumpten Zellen, da dies die spätere Analyse erschwert.

Um das Schicksal mitotischer Zellen zu beurteilen, stellen Sie die Bildgebungssoftware so ein, dass sie bis zu 96 Stunden lang alle 10 Minuten Bilder aus jedem ausgewählten Sichtfeld sammelt. Die ungestörte Mitose dauert 20 bis 40 Minuten, so dass 10-Minuten-Intervalle genügend Proben liefern, um zu erkennen, wann sich die Zellen teilen. Um einen Kernbruch zu identifizieren, bei dem es sich um ein vorübergehendes Ereignis handelt, nehmen Sie alle fünf Minuten Bilder auf.

Identifizieren Sie Zellen, die in die Mitose eintreten, durch Beobachtung der Zellrundung unter Verwendung von Phasenkontrastoptiken und/oder Chromosomenkondensation unter Verwendung von humanem Histon H2B, das mit GFP fusioniert ist. Sowohl die Zellrundung als auch die Chromosomenkondensation sind mit dem Auge gut sichtbar. Kommentieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Zelle in die Mitose eintritt.

Verfolgen Sie die Zelle weiter, bis sie ihr Schicksal erreicht hat. Kontrollzellen sollten ihre Chromosomen effizient ausrichten und innerhalb einer Stunde in die Anaphase übergehen. Visualisieren Sie die Anaphase durch Phasenkontrastoptiken, wenn die Zelle beginnt, sich in zwei zu quetschen, oder durch Visualisierung von polwärts bewegten Chromosomen, die mit H2B-GFP markiert sind.

Kommentieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Zelle die Anaphase durchläuft. Im Gegensatz dazu bleiben Zellen, die mit Paclitaxel behandelt wurden, mehrere Stunden lang mit kondensierten Chromosomen gerundet. Identifizieren Sie mitotisch verhaftete Zellen, die den Zelltod durchlaufen.

Zellen, die während der Mitose absterben, werden durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht, da die Zellen blasen, schrumpfen und/oder platzen. Bei der Darstellung von H2B-GFP fragmentieren die Chromosomen auch während des Zelltods. Identifizieren Sie mitotisch verhaftete Zellen, die Zellschlupf erfahren.

Zellen, die mitotischen Schlupf erleiden, werden mit der Phasenkontrastmikroskopie beobachtet, wie sie wieder in die Interphase abflachen und die Chromosomen dekondensieren, ohne eine Anaphase zu durchlaufen. Aus diesen Zellen entstehen große tetraploide Zellen, die oft mehrkernig sind. Setzen Sie die Verfolgung von Zellen aus dem ursprünglichen Sichtfeld fort.

Sobald ein gesamtes Sichtfeld verfolgt wurde, wechseln Sie zu einem separaten Sichtfeld, das aus demselben Well aufgenommen wurde, und fahren Sie mit der Verfolgung der Zellen fort. Beurteilen Sie das Zellschicksal nach mitotischem Schlupf mit der nicht transformierten und chromosomal stabilen retinalen pigmentierten Epithelzelllinie, die das FUCCI-System exprimiert. Um zu bestätigen, dass das FUCCI-System ordnungsgemäß funktioniert, validieren Sie, ob die Kontrollzellen die Expression der rot und grün fluoreszierenden Proteine entsprechend der Analyse der Lebendzell-Bildgebungsdaten abwechseln.

Kontrollzellen sollten von einer vollständig nuklearen roten Fluoreszenz zu einer vollständig nuklearen grünen Fluoreszenz während der Interphase übergehen, wenn die Zellen von der G1- in die S-Phase übergehen. Die Zellen sollten während des gesamten Abschlusses der Mitose weiterhin grüne Fluoreszenz aufweisen. Unmittelbar nach der Mitose sollten die Zellen während der Interphase wieder eine vollständig rote Fluoreszenz aufweisen.

Identifizieren Sie Zellen, die in der Mitose mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie verhaftet wurden, und verfolgen Sie sie, bis sie mitotisch gleiten. Zellen, die aus der Mitose heraus und zurück in die Interphase schlüpfen, wechseln von grüner Fluoreszenz während der Mitose zu roter Fluoreszenz während der G1-Phase. Verfolgen Sie diese verrutschten Zellen mit Hilfe von Phasenkontrast- und Epifluoreszenzbildgebung mit dem Auge, um ihr Zellschicksal zu beurteilen.

Identifizieren Sie Zellen, die wieder in den Zellzyklus eintreten. Diese Zellen werden durch die Rot-Grün-Änderung der Fluoreszenzexpression unter Verwendung des FUCCI-Systems identifiziert, das den G1/S-Übergang anzeigt. Identifizieren Sie Zellen, die einen G1-Zellzyklus-Arrest erleiden.

Diese Zellen werden durch die Expression von roter Fluoreszenz identifiziert, die länger als 24 Stunden anhält. Identifizieren Sie auch Zellen, die in der Interphase absterben. Diese Zellen werden durch Zellbruch, Blabbing und Schrumpfung mit Hilfe der Phasenkontrastbildgebung identifiziert.

Stellen Sie die Zellen wie zuvor dar. Das Fluoreszenzsignal aus der Tandem-Dimer-Wiederholung von RFP, das mit einem Kernlokalisationssignal (TDRFP-NLS) fusioniert ist, und H2B-GFP sollten während der Interphase kolokalisieren. Die Mitose wird durch Zellrundung mittels Phasenoptik und/oder Chromosomenkondensation mittels H2B-GFP sichtbar gemacht.

Bei der Mitose bricht die Kernhülle zusammen und das TDRFP-NLS-Signal wird zytoplasmatisch. Nach der Mitose bildet sich die Kernhülle in den Tochterzellen neu und das TDRFP-NLS-Signal wird nukleär. Verfolgen Sie Tochterzellen während der nachfolgenden Interphase durch Lebendzell-Bildgebung.

Identifizieren Sie Kernrupturereignisse, indem Sie einen vorübergehenden Ausbruch von nuklear lokalisiertem TDRFP-NLS in das umgebende Zytoplasma beobachten. Innerhalb weniger Minuten wird die Kernhülle repariert und das TDRFP-NLS in den Kern relokalisiert. Hier sind repräsentative Bilder einer verrutschten Zelle zu sehen, die grün wird und in die S-Phase eintritt, nachdem sie nach der Paclitaxel-Behandlung abgerutscht ist.

Ein Großteil der Zellen, die durch die Paclitaxel-Behandlung abgerutscht waren, wurde einem G1/G0-Arrest unterzogen und blieb mehr als 48 Stunden lang rot, ohne sich einer Apoptose zu unterziehen. Zellen, die nach dem Schlupf rot sind, durchlaufen ebenfalls eine Apoptose, wie in diesem Bild dargestellt. Die Ruptur der Kernhülle nimmt in mit Paclitaxel behandelten Zellen zu.

TDRFP-NLS- und H2B-GFP-Zellen, die mit 10-nanomolarem Paclitaxel behandelt wurden, weisen eine erhöhte Kernruptur auf, bei der RFP in Interphase-Zellen vom Zellkern in das Zytoplasma delokalisiert wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie Sie eine Langzeitbildgebung lebender Zellen durchführen können, um das Zellschicksal als Reaktion auf verschiedene medikamentöse Behandlungen zu beurteilen.