Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu untersuchen, die sich spezifisch um ein Paar interagierender Proteine von Interesse ansammeln, und zwar mit Hilfe von split-BioID, einem Proteinfragment-Komplementationsassay, der eine proximity-abhängige Protein-Biotinylierung in lebenden Zellen induziert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie sich Proteinkomplexe dynamisch umgestalten, um verschiedene zelluläre Funktionen zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die einfache Identifizierung kontextspezifischer Proteinkomplexe in ihrer nativen zellulären Umgebung und mit sehr hoher Auflösung ermöglicht.

Für die abschließende massenspektrometrische Analyse sind die folgenden Schritte unter keratinfreien Bedingungen durchzuführen und alle Materialien und Reagenzien sollten so keratinfrei wie möglich sein. Nach der Klonierung der ORFs von zwei Proteinen von Interesse in das Split-BioID-Plasmid, der Durchführung einer transienten Transfektion und der anschließenden Zugabe von Biotin-supplementiertem Medium gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Geben Sie 1,5 Milliliter PBS auf jede Platte und verwenden Sie einen Schaber, um die Zellen zu ernten, dann übertragen Sie die Zellen für jede Bedingung in ein separates 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.200-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie die Überstände und frieren Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff ein. Anschließend lagern Sie die Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius. Zur Herstellung von Zelllysaten verwenden Sie einen Milliliter RT-Lysepuffer, um die Pellets zu resuspendieren.

Führen Sie dann die Zellen 10 bis 20 Mal durch eine 25-Gauge-Nadel. Als nächstes beschallen Sie die Proben. Fügen Sie dann 100 Mikroliter 20 % Triton X-100 pro 900 Mikroliter zurückgewonnenes beschalltes Lysat für eine Endkonzentration von 2 % hinzuFügen Sie 2,3 Milliliter 50 Millimolar Tris, pH 7,4, pro Milliliter Lysat hinzu, um die NaCl-Konzentration auf 150 Millimolar für die Bindung an Streptavidin-Kügelchen einzustellen.

Dann verteilen Sie die eingestellten Lysate in 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren sie bei 16.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für zehn Minuten. Die Überstände werden in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und 50 bis 100 Mikroliter als Inputmaterial aufbewahrt. Um einen Streptavidin-Pulldown durchzuführen, werden für jede Bedingung 200 Mikroliter Streptavidin-gekoppelte magnetische Bead-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen.

Legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell und warten Sie etwa eine Minute, bevor Sie den Lagerpuffer entfernen. Mit einem Milliliter Äquilibrierungspuffer die Kügelchen durch leichtes Mischen waschen. Verteilen Sie dann die äquilibrierten Kügelchen gleichmäßig in die erforderliche Anzahl von Röhrchen und legen Sie sie wieder auf das Magnetgestell.

Nach Entfernen des Äquilibrierungspuffers resuspendieren Sie jeden Satz von Kügelchen mit der gleichen Menge der entsprechenden Zelllysate. Anschließend werden die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubiert. Legen Sie die Röhren am nächsten Tag auf ein Magnetgestell.

Warten Sie, bis die Kügelchen an der Seite der Röhrchen kleben, und geben Sie die Überstände in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das als Durchfluss gekennzeichnet ist. Mit 200 Mikrolitern Waschpuffer eins resuspendieren Sie die Kügelchen in jedem Röhrchen und kombinieren Sie jeden Satz resuspendierter Kügelchen, der einer Bedingung entspricht, in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie einen Milliliter Waschpuffer, einen Milliliter, um die Kügelchen acht Minuten lang zweimal auf einem rotierenden Rad zu waschen.

Führen Sie dann jeweils zwei Waschgänge für die Waschpuffer zwei, drei und vier durch. Um sicherzustellen, dass der Waschpuffer nach dem letzten Waschschritt vollständig entfernt wird, schleudern Sie die Proben nach dem Entfernen des größten Teils des Überstands herunter. Legen Sie sie dann wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie den restlichen Puffer.

Geben Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer zu den Kügelchen, inkubieren Sie die Proben dann fünfzehn Minuten lang bei 98 Grad Celsius und bringen Sie die Röhrchen sofort in das Magnetgestell. Übertragen Sie die eluierte Probe in ein frisches Röhrchen und lagern Sie die Röhrchen bis zur weiteren Verarbeitung bei minus 20 Grad Celsius. Für jede Eingabeprobe wird eine PAGE-Probe vorbereitet, indem gleiche Mengen Protein mit dem entsprechenden Volumen von 3X SDS-Ladepuffer in einem Gesamtvolumen von 28 Mikrolitern gemischt werden.

Bereiten Sie dann PAGE-Proben vor, indem Sie fünf Mikroliter jeder Elutionsprobe mit 2,5 Mikrolitern 3X SDS-Ladepuffer mischen. Laden Sie die Proben auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel. Fahren Sie dann mit der Elektrophorese und dem Western Blotting gemäß dem Textprotokoll fort.

Um die SDS-PAGE für die MS-Analyse durchzuführen, fügen Sie 6,25 Mikroliter 4X Probenpuffer zu 18,75 Mikrolitern jeder Elutionsprobe hinzu und lassen Sie die Proben auf einem vier bis 20% vorgegossenen SDS-Gel laufen, bis sie zwei bis drei Zentimeter in das Gel wandern. Färben Sie das Gel in einer 15 Zentimeter großen Petrischale mit dem kolloidalen Coomassie Brilliant Blue G250 Fleck. Verwenden Sie ein sauberes Skalpell, um die gesamten Spuren für jede Probe mit Ausnahme der Streptavidin-Bande zu exzidieren, und übertragen Sie die herausgeschnittenen Banden für die MS-Analyse in 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zusätzlich zu den endogenen biotinylierten Proteinen, die in einem BioID-Split-BioID-Experiment identifiziert wurden, sind die zusätzlichen Hauptbanden, die durch Western Blot beobachtet wurden, die Fusionsproteine, die sich selbst biotinylierten, was darauf hindeutet, dass die beiden getesteten Proteine, in diesem Beispiel Ago2 und TNRC6C oder Ago2 und Dicer, in den Zellen interagierten. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse des Western Blots darauf hin, dass ein NBirA*Ago2-Fusionsprotein in Kombination mit CBirA*-Fusionen zu TNRC6C oder Dicer effizienter ist als die entgegengesetzten Kombinationen, bei denen CBirA*Ago2 mit NBirA*-Fusionen der beiden anderen Proteine gepaart ist. Darüber hinaus war die Aktivierung spezifisch, da keine der CBirA*-Fusionen das NBirA*GFP-Kontrollfusionsprotein in nennenswertem Umfang aktivieren konnte.

Bei der erstmaligen Durchführung der Isolierung sollten alle Schritte der Reinigung durch Western Blotting analysiert werden. Wie hier dargestellt, sollte die Bindung an die Kügelchen nahezu quantitativ sein und in den Waschvorgängen praktisch kein Durchlaufen beobachtet werden. Wenn das eluierte Material nach Proteinexpression und induzierter Biotinylierung auf ein Coomassie-gefärbtes Gel aufgebracht wird, verläuft die stärkste beobachtete Bande bei etwa 17 Kilodalton und entspricht monomerem Streptavidin.

Der Bereich der Probenspur oberhalb des Streptavidin-Bandes in der Ladevertiefung wird für die MS-Analyse in der Regel herausgeschnitten. Bei der Anwendung dieses Verfahrens auf zwei gegebene Proteine ist es wichtig, unterschiedliche Kombinationen von Fusionsproteinen zu testen. In der Tat haben wir oft beobachtet, dass die Gesamteffizienz der Biotinylierung eng davon abhängen kann, welches Protein an die N- oder C-terminalen BirA-Fragmente angehängt wird.

Ebenso wichtig ist es, mindestens ein Negativkontroll-Split-BioID-Experiment hinzuzufügen. Zum Beispiel auf ein Paar interagierender Proteine, die nicht mit dem interessierenden Proteinpaar verwandt sind. Nach diesem Verfahren und der Massenspektrometrie sollte eine computergestützte Analyse angewendet werden, um die identifizierten Peptide anhand der Negativkontrollexperimente zu bewerten.

Wir verwenden zum Beispiel die Software MaxQuant und Perseus, die von den Laboren Cox und Mann in München entwickelt wurden.