Name: Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Split-BioID Proteinfragment-Komplementation nutzt, um kontextspezifische Proteinkomplexe in natürlicher zellulärer Umgebung mit hoher Auflösung zu analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in dynamische Proteininteraktionen.

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Diese Arbeit wurde durch den deutschen Exzellenzinitiative (CellNetworks DFG-EXC 81) und eine Teilfinanzierung durch den Sonderforschungsbereich SFB638 vom deutschen Forschung Rat (DFG) finanziert.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das skizzierte Verfahren beschreibt, wie Gene von Interesse in der Split-BioID Klonen Plasmide, wie Interaktion-induzierte biotinylierungen getestet und biotinylierte Proteine für Massenspektrometrie Analyse isolieren. Wir beschreiben hier die Prozedur beruht auf Transiente Transfektion. Während der Ausdruck die Fusionsproteine um den Betrag der Dox hinzugefügt, um das Medium angepasst werden kann, kann Transiente Transfektion zu inhomogenen Proteinexpression mit einigen Zellen führen, die grob die Fusionsproteine im Vergleich zu den endogenen overexpress Pendants. Dies kann zu Verzerrungen des entsprechenden Interactomes und PPI, die nicht treu die Interaktionen widerspiegeln, die die körpereigene Proteine beinhalten. Es empfiehlt sich also in der Regel zu stabilen Zelllinien zu konstruieren, nach Split-BioID mit dem transient System etabliert hat. Plasmide sind kompatibel mit dem Flp-vermittelten Rekombinationssystem und legen beide Gene von Interesse im Rahmen der Verordnung des gleichen Tet-responsive Elements. Bei Bedarf und bei Verwendung mit kompatiblen Säugerzellen, ermöglichen sie die einfache Erstellung von stabil induzierbaren Zelllinien. Zum Beispiel verwenden wir die HeLa-EM2-11-Linie, die drückt den RtTA Tetracyclin-aktivierte Transkription Aktivator und eine einzigartige Aktionsleisten genomischen Locus aus dem Tetracyclin-vermittelten Genexpression streng regulierte12sein kann. Mit dieser Zelllinie und Flp-vermittelten Rekombination, stabilen Zelllinien, die nur eine Kopie des Transgens enthalten innerhalb von zwei bis drei Wochen erhalten. Alternativ könnte man auch aktuelle Genom Schnitttechniken verwenden, einzuführen die BirA * Fragmente in den nativen genomic Loci der Gene von Interesse.
Wie in jedem Assay, das Tagging ein Protein angewiesen ist, muss man prüfen, ob die resultierende Fusionsproteine funktionsfähig sind. Verfügbare Daten in die interessierenden Proteine (z. B. mit GFP für bildgebenden Verfahren) markiert wurden und funktional getestet eignen sich zu entscheiden, ob die BirA * Fragmente werden sollte geklont stromaufwärts oder stromabwärts die Gene von Interesse. Wenn keine solchen Daten verfügbar sind, sollte man N-Terminal Testen oder C-Terminal Tag Proteine in eine funktionelle Assay. Beispielsweise kann die Aktivität der Schmelzverfahren Proteine in einer Zelllinie getestet werden, in denen das körpereigene Protein herausgetrennten und wurde im Vergleich zu Wildtyp. Wenn die Proteine des Interesses beide N und C-terminalen Tags vertragen, sollten beide getestet werden. In der Tat kann die Ausrichtung des Fusionsproteins in BioID Experimente, die Effizienz der Kennzeichnung22beeinflussen. Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass wenn ein paar Proteine Split-BioID zuweisen, welche der beiden Proteine, entweder die NBirA angehängt wird * oder CBirA * fragment auch Einfluss die Effizienz der Beschriftung9. In den Split-BioID Plasmiden die 16 Aminosäuren lange Glycin/Serin Reich Linker Kopplung der interessierenden Proteine an die BirA * Fragmente wurden weitere PCA23 entnommen und für uns tätig sind, damit alle interagierenden Proteine haben wir bisher getestet. Allerdings sollte man bedenken, dass einige Protein-Paare mit kürzeren oder längeren Linker besser funktionieren könnte. Der letzte Hinweis wurde ein weiterer Test von Bollen Gruppe24beschrieben. In diesem Assay BirA * an einem anderen Standort (E140/Q141) als bei uns (E256/G257) gliedert. Wir haben beide Split-BioID Aromen Side-by-Side getestet und festgestellt, dass E256/G257, beschrieben in diesem Protokoll zu stärkeren Re-Aktivierung führt, wenn Sie an zwei interagierenden Proteine gekoppelt9.
Ein allgemeiner Nachteil dieser Methode ist die langsame Geschwindigkeit der Beschriftung. 6 bis 24 h Inkubationszeit mit Biotin ist normalerweise notwendig, spürbare biotinylierungen6, die Nutzung dieser Technik zur Untersuchung dynamischer Umbau von Proteinkomplexen ausschließt zu erhalten. Während dieser Assay teilweise diesem Vorbehalt befasst, da es nur aktiviert wird, wenn zwei Proteine interagieren, die langsame Geschwindigkeit der Kennzeichnung schließt seine Verwendung für das Studium als Reaktion auf sehr dynamische Prozesse oder kurzlebige Proteine zu analysieren. Veränderter Peroxidase bekanntermaßen APEX2 fördern effiziente Kennzeichnung der proximalen Proteine innerhalb von 1 min-3. Ein Partnerschafts-und Kooperationsabkommen basierend auf APEX2 könnte so die Grenzen der Kennzeichnung langsame BioID abgeleitet Assays einzugehen. Eine Proof of Principle Studie beschrieben so ein Split-APEX2 Assay25. Obwohl ein Homodimerizing Protein biotinylierte erfolgreich war, bleibt ob der Test auch verwendet werden kann, zu kennzeichnen und identifizieren Proteine, die zusammenbauen, um ein paar der interagierenden Proteine jedoch um nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde gerichtete Evolution zur Erstellung TurboID und MiniTurbo, zwei Varianten der BirA * mit verstärkten Aktivität, die viel kürzer Kennzeichnung Zeitfenster, bis zu 10 min26zu ermöglichen. Anpassung der Split-BioID für diese neuen Varianten wird die Verwendung dieser Technik, um ein breiteres Anwendungsfeld weiter ausbauen.

Da die zelluläre Funktionen von Proteinen, die dynamisch, makromolekulare Komplexe durchgeführt werden zusammenbauen, ist die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) eine große Bemühung in der biomedizinischen Forschung. In der Tat PPI sind oft bei Krankheit dereguliert und mögliche Ziele für Therapeutik1vertreten. Die am weitesten verbreitete Methode für die Identifizierung von PPI die Affinität Reinigung (AP) Ansatz in dem ist, nach Lyse der Zelle, ein Protein des Interesses wird speziell auf eine Matrix gereinigt und damit verbundenen Proteine werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert (MS). AP-MS eine leistungsstarke Ansatz ist, wird in der Regel nicht ausgeführt auf schwerlösliche Proteinkomplexe, sehr flüchtigen Interaktionen oder PPI, die eine intakte subzelluläre Struktur erfordern. Darüber hinaus kann die Interpretation der Daten durch die dynamische Natur der PPI-Netzwerke, kompliziert werden, da ein einziges Protein oft mehrere verschiedene Proteinkomplexe gehört.
Nähe-Kennzeichnung Techniken wie BioID2 oder APEX23,4 wurden vor kurzem entwickelt, um einige der Einschränkungen der AP-MS Ansätze zu beheben. In BioID katalysiert das Enzym BirA * (entspricht eine G115R Variante des Enzyms Wildtyp E. Coli ) die Bildung von labiler Biotinyl-AMP (Bio-AMP), die mit primären Aminen reagieren kann. Im Gegensatz zu der Wildtyp-Enzym, das Bio-AMP in seinem aktiven Zentrum behält, löst BirA * Bio-AMP, so dass ihre Verbreitung auf die benachbarte Umgebung. Daher können beim verschmolzen zu einem Protein des Interesses und in Zellen exprimiert, proximalen Proteine biotinylierte innerhalb einer Schätzung von 10 nm5sein. Diese gekennzeichnet proximalen Proteine werden dann durch Streptavidin Pulldown isoliert und identifiziert durch MS. Im Gegensatz zu AP-MS erfordert BioID Ausdruck ein Fusionsprotein. Es kann also nur an Proteine angewendet werden deren Funktion durch die Kennzeichnung nicht behindert wird. Darüber hinaus die Kennzeichnung ist langsam, in der Regel 6 – 24 h2,6, machen die Erkennung von kurzlebigen Proteine herausfordernd. Jedoch im Vergleich zu AP-MS, BioID-MS bietet mehrere Vorteile: Erstens sein nehmen die Interaktionen in ihrer natürlichen zellulären Umgebung; zweite, beschriftete Proteine anstatt montierten Anlagen sind isoliert nach Lyse der Zelle; Drittens können Streptavidin Pulldowns mit Geruchsstoffen Puffer und harte Wäsche Bedingungen. Daher ist die Methode mehr empfindlich, um vorübergehende oder schwachen Wechselwirkungen7 oder Interaktionen, die auf ein bestimmtes auftreten und schwer zu isolieren, subzelluläre Struktur8.
Die meisten Proteine sind jedoch in der Regel Teil des größeren komplexen, die umgestalten können, laut zelluläre Signale oder die Funktion, die ausgeführt werden muss. Ein einziges Protein gehört daher in der Regel mehrere komplexe, entsprechend unterschiedlichen Funktionseinheiten, an denen unterschiedliche und/oder überlappende PPI. Beide Ansätze geben einen Überblick über alle Vereine, die ein gegebenes Protein haben kann, doch sie scheitern an den Kontext der einzelnen PPI. Um die Auflösung des letzteren zu erhöhen, haben wir einen PROTEINFRAGMENTE Ergänzung Assay (PCA) entwickelt, in welche zwei inaktive Fragmente von BirA * (NBirA *, die die katalytische Domäne enthält, und CBirA *, die wie die Re-Aktivierung-Domäne angezeigt werden können) können wieder in ein aktives Enzym, wenn in der Nähe von zwei brachte Interaktion Proteine9. Die daraus resultierende Split-BioID Assay Nähe-abhängige biotinylierungen konzentriert sich auf Proteine, die um ein paar der interagierenden Proteine versammeln und somit ermöglicht die Identifikation von Kontext abhängige Protein Baugruppen. Wir demonstriert vor kurzem die herausragende Auflösung macht der Split-BioID durch Lösen von zwei verschiedene Proteinkomplexe der MiRNA-vermittelten gen-silencing Weg9beteiligt.
Insgesamt kann in einem einheitlichen und einfachen Assay Split-BioID entdecken und speziell definierten funktionalen Einheiten, in denen ein gegebenen Proteins beteiligt, sofern eine zusätzliche interagierenden Proteins des entsprechenden Proteins komplexe bekannt ist, PPI zuweisen.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure (glazial)</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td>Zur Herstellung von TAE-Puffer</td></tr><tr><td>Agarose Sigma</td><td></td><td>A9539</td><td>Einnahme von TAE-Agarose-Gelen für die DNA-Analyse und -Extraktion</td></tr><tr><td>Ammoniaklösung 25% NH3</td><td>Bernd Kraft</td><td>6012</td><td>Zum Auflösen von Biotin</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>Zur Selektion transformierter Bakterien</td></tr><tr><td>Bioruptor plus Sonifikationsgerät</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Andere Sonifikationsgeräte sind auch in Ordnung</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>Zur Zugabe zum Wachstumsmedium zur Stimulierung einer effizienten Biotinylierung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminfraktion V</td><td>Carl Roth</td><td>8076</td><td>Wird in Western-Blot-Puffern und einem Proteinstandard in Bradford-Assays verwendet</td></tr><tr><td>Bradford Ultra Reagenz</td><td>Expedeon</td><td>BFU05L</td><td>Jede andere Methode/jedes andere Kit zur Proteinbestimmung ist in Ordnung, dieses spezielle Reagenz ist toleranter gegenüber Detergenzien als andere Bradford-Reagenzien</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>TPP</td><td>99002</td><td>Jedes andere Modell ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197</td><td>Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (NBirA*-Fusion)</td></tr><tr><td>DMEM-Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td>Wenn Sie eine andere Zelllinie verwenden, verwenden Sie das entsprechende optimale Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>DNA-Miniprep-Kit</td><td>Sigma</td><td>PLN350</td><td>Jedes andere Kit ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Applichem</td><td>A2951</td><td>Dox ist lichtempfindlich</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Applichem</td><td>A2948</td><td>Stellen Sie 1M Stammlösung her, lagern Sie bei -20 &deg; C und verwenden Sie immer frisches</td></tr><tr><td>DyLight 680-konjugiertes Streptavidin</td><td>Thermo scientific</td><td>21848</td><td>zur Verwendung mit einem LiCor Western-Blot-Scangerät</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>Die C1-Kügelchen sind nicht BSA-beschichtet, was für nachgelagerte MS-Anwendungen vorzuziehen ist (kein Durchtreten von BSA in der endgültigen Elution)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A5097</td><td>Stellen Sie eine 500 mM Stamm her, stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein, während Sie das EDTA-Pulver auflösen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32205</td><td>Stellen Sie eine 70%ige Stammlösung her, in der Doxycyclin bei 10 mg.mL-1</td></tr><tr><td>Fastgene Gel/PCR DNA-Extraktionskit</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-91302</td><td>Jedes andere Kit ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td>Zur Einstellung des pH-Werts der Biotin-Stammlösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763</td><td>Stellen Sie eine 500 mM Stammlösung her, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4</td></tr><tr><td>ein Immobilon-FL PVDF-Membran, 0,45&nbsp; &Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Diese Membran zeigt eine minimale Autofluoreszenz, wenn sie mit einem LiCor Western Blot-Scangerät</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Gr&uuml; ssing GmbH</td><td>12083</td><td>Make a 5M stock</td></tr><tr><td>solution Odyssey CLx imaging system</td><td>LI-COR</td><td>N/A</td><td>Zum Scannen der Western-Blot-Membran, die mit einem fluorophor-markierten Antikörper dekoriert</td></tr><tr><td>ist Lineares Polyethylenimin (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td>Jedes andere Transfektionsreagenz ist ebenfalls fein</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Carl Roth</td><td>T145</td><td>Zum Blockieren von Western-Blot-Membranen</td></tr><tr><td>MluI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3198</td><td>Restriktionsenzym für die Klonierung in die Split-BioID-Plasmide (NBirA*-Fusion)</td></tr><tr><td>Na-Desoxycholat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td>Herstellung einer 10%igen (w/v) Stammlösung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>Herstellung einer 5M Stammlösung</td></tr><tr><td>NP-40 (Nonidet P40 Ersatz)</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td>Herstellung einer 20%igen (v/v) Stammlösung</td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td>Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (CBirA*-Fusion)</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td>Zum Waschen von Zellen vor dem Verschrotten</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0560</td><td>Restriktionsenzym zum Klonieren in die Split-BioID-Plasmide (CBirA*-Fusion)</td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Dem Lysepuffer zugesetzt, um Protein zu verhindern Abbau</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgen</td><td>90003</td><td>Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von NBirA*-FKBP und CBirA*-FRB, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgen</td><td>90004</td><td>Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von FKBP-NBirA* und CBirA*-FRB, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBP</td><td>Addgen</td><td>90008</td><td>Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von NBirA*-FKBP und FRB-CBirA*, FKBP und FRB können durch zwei andere ORFs ersetzt werden</td></tr><tr><td>pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir</td><td>Addgene</td><td>90009</td><td>Split-BioID Plasmid, vermittelt die Co-Expression von FKBP-NBirA* und FRB-CBirA*, FKBP und FRB können durch zwei weitere ORFs ersetzt werden</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity PCR Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E0555S</td><td>Zur Amplifikation der ORF-Kodierung für die zu testenden Proteine. Jede andere thermostabile DNA-Polymerase ist in Ordnung.</td></tr><tr><td>Schnelles Ligatur-Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Für die Ligation von DNA-Fragmenten in die Split-BioID-Plasmide ist jedes andere DNA-Ligatursystem in Ordnung.</td></tr><tr><td>RunBlue 4-20% SDS-Fertiggele</td><td>Expedeon</td><td>BCG42012</td><td>Zur Verwendung bei der Probenentnahme für die MS-Analyse</td></tr><tr><td>RunBlue LDS Probenpuffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB31010</td><td>Laufpuffer für die RunBlue Fertiggele</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Kommt als 20%ige Stammlösung</td></tr><tr><td>tetfreies Serum</td><td>Biowest</td><td>S181T</td><td>verwenden wir tetfreies Serum, um die basale Expression der Fusionsproteine zu minimieren</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfersystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td>Hochgeschwindigkeits-Western-Blotting-Transfersystem, jedes andere Transfersystem ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855</td><td>Herstellung von 1M Stammlösungen mit adäquatem pH (7,4 und 8)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975</td><td>Herstellung einer 20%igen (v/v) Stammlösung</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127</td><td>Bei der Verwendung in Western-Blot-Puffern führt Tween 20 zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz und sollte im Blockierungs- und letzten Waschschritt weggelassen werden</td></tr></tbody></table>

split-bioid — proteomic analyse der kontextspezifischen proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären umgebung

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Ergänzend zur bestehenden Affinitätsreinigung (AP) nähert sich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI), Enzyme wurden eingeführt, die es ermöglichen die Nähe-abhängige Kennzeichnung der Proteine in lebenden Zellen. Ein solches Enzym, BirA * (verwendet in der BioID Ansatz), vermittelt die biotinylierungen der Proteine in einem Umkreis von ca. 10 nm. Daher können als zu einem Protein des Interesses verschmolzen und in Zellen exprimiert, die Kennzeichnung der proximalen Proteine in ihrer natürlichen Umgebung. Im Gegensatz zu AP, das stützt sich auf die Reinigung des montierten Proteinkomplexe, erkennt BioID Proteine, die gekennzeichnet worden sind, in den Zellen unabhängig davon, ob sie noch mit dem Protein von Interesse interagieren Wenn sie isoliert sind. Da es Biotinylates proximalen Proteine, man kann außerdem kapitalisieren die außergewöhnliche Affinität von Streptavidin für Biotin um sie sehr effizient zu isolieren. Während BioID besser als AP für identifizierende Transient oder schwachen Wechselwirkungen führt, bieten beide AP und BioID Mass Spectrometry Ansätze einen Überblick über alle möglichen Interaktionen, die ein gegebenes Protein haben kann. Jedoch bieten sie keine Informationen über den Kontext der einzelnen identifizierten PPI. In der Tat sind die meisten Proteine in der Regel Bestandteil mehrere komplexe, entsprechend unterschiedliche Reifung Schritte oder verschiedenen Funktionseinheiten. Um diese gemeinsamen Begrenzung beider Methoden zu lösen, haben wir einen PROTEINFRAGMENTE Ergänzung Assay basiert auf dem BirA * Enzym entwickelt. In diesem Test können zwei inaktive Fragmente von BirA * wieder zusammenbauen, in ein aktives Enzym, wenn in der Nähe von zwei interagierenden Proteine gebracht, die sie verschmolzen sind. Der daraus resultierende Split-BioID Test ermöglicht die Kennzeichnung der Proteine, die um ein paar der interagierenden Proteine zu montieren. Sofern diese beiden nur in einem bestimmten Kontext interagieren, ermöglicht Split-BioID dann die Analyse der spezifischen Kontext-abhängige Funktionseinheiten in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Hier bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll zu testen und ein paar von interagierenden Proteine Split-BioID zuweisen.

Um zu veranschaulichen, wie diese Methode funktioniert, die open Reading Frames (ORFs) der Proteine Ago2, waren TNRC6C und Dicer (alle Beteiligten in der MiRNA-vermittelten gen-silencing Weg) in Split-BioID Plasmiden geklont. Ago2 ist bekannt, in einem MiRNA-induzierte stummschaltungs-Komplex (MiRISC), die Übersetzung unterdrückt mit TNRC6C interagieren und Zerfall des Ziels mRNAs14zu stimulieren. Vor dem montieren der MiRISC, Ago2 interagieren mit Dicer, das Enzym, das produziert Reifen MiRNAs, in einem Komplex, in dem es mit einem MiRNA15geladen werden kann. Daher wurde Split-BioID Ago2/Dicer Paar oder das Ago2/TNRC6C paar angewendet. Für jedes Paar von geprüften Proteinen war Ago2 entweder mit NBirA * oder CBirA * über unsere Split-BioID Plasmide (Abbildung 2) verschmolzen und Dicer und TNRC6C zu den entsprechenden cognate BirA * fragment. Darüber hinaus war jedes Protein mit CBirA * verschmolzen und gepaart mit einer NBirA *-GFP Fusion als Negativkontrolle. Dies führt zu testen vier Iterationen für jedes Paar von getesteten Protein (Tabelle 1).
Um zu testen ob Split-BioID auf das Zusammenspiel der beiden getesteten Proteine aktiviert ist, folgten wir das Schema in Abbildung 1dargestellt. Die Plasmide wurden vorübergehend in einer Tet-System kompatibel HeLa Zelllinie transfiziert. Der Ausdruck der Fusionsproteine mit Doxycyclin (Dox) induziert wurde und biotinylierungen wurde angeregt, indem das Wachstumsmedium überschüssiges Biotin hinzufügen. Nach einer Inkubationszeit von 20 h mit Dox und Biotin wurden Zellen lysiert und analysiert durch westliche Beflecken mit konjugierten Streptavidin biotinylierte Proteine erkennen. In Säugetierzellen zwei großen Bands werden in der Regel von der konjugierten Streptavidin im untransfected Beispiel (Abbildung 3, Sterne) erkannt und endogen biotinylierte Proteine (höchstwahrscheinlich mitochondriale Carboxylases) entsprechen. Diese beiden Bands sind vorhanden in allen Proben und können bequem als interne Belastung Steuerelemente verwendet werden, also die Erkennung eines Housekeeping Proteins, das Laden der gleichen Protein-Mengen zu kontrollieren ist überflüssig. Typisch für ein BioID/Split-BioID Experiment, sind die zusätzlichen großen Bands, die beobachtet werden können die Fusionsproteine, die selbst-biotinylierte bekam. Auch wenn kein anderer biotinylierte Protein zu sehen ist, zeigt biotinylierungen die Fusionsproteine bereits in diesem Stadium zu erkennen, dass die beiden getesteten Proteine in den Zellen interagiert. Im Experiment auf Abbildung 3dargestellt, es ist klar, dass ein NBirA *-Ago2 Fusionsproteins gepaart mit CBirA * Fusionen, TNRC6C oder Dicer ist effizienter als die gegenüberliegenden Kombinationen in der CBirA *-Ago2 paart sich zu NBirA * Fusionen der beiden anderen Proteine (Abbildung 3, obere Leiste vergleichen die Intensitäten der Fahrspuren 2-3 Bahnen 6-7). Darüber hinaus war die Aktivierung spezifisch, da keiner der Fusionen CBirA * NBirA * aktivieren konnte-GFP Kontrolle Schmelzverfahren Protein zu spürbaren Niveaus (Abbildung 3, vergleichen Bahnen 1, 4-5 auf Bahn 8, die untransfected Zellen entspricht). Da in unserem Plasmide NBirA * verfügt über ein Myc-Tag und CBirA * verfügt über ein FLAG-Tag (Abbildung 2), können die Ausdruck Ebenen der einzelnen Schmelzverfahren Protein mit Antikörpern gegen diese zwei Tags (Abbildung 3, Bodenplatte) analysiert werden.
Interaktion-induzierte biotinylierungen beobachtet wird, das Experiment kann hochskaliert werden, als die biotinylierte Proteine isoliert auf Streptavidin-gekoppelten Perlen wie in Ziffer 4 des Protokolls (Abbildung 4) angegeben. Wenn Sie die Isolierung zum ersten Mal durchführen, können alle Schritte der Reinigung durch Western Blot (Abbildung 5) analysiert werden. In der Regel sollte Bindung an die Perlen fast quantitative und praktisch kein Leck durch in den Waschungen beachtet werden. Vor der Verarbeitung der Proben für die Massenspektrometrie, empfehlen wir die Ausführung ein Western-Blot damit induzierte biotinylierungen arbeitete als erwartet und die Fusionsproteine zum Ausdruck gebracht wurden. Das Fehlen des Ausdrucks die Fusionsproteine ist aufgrund schlechter Transfektion Effizienz oder fehlerhafte Dox Induktion. Wenn die Fusionsproteine zum Ausdruck gebracht wurden, aber keine biotinylierungen beobachtet, überprüfen Sie, wenn überschüssiges Biotin (50 μM) tatsächlich auf das Medium hinzugefügt wurde und dass die Lager Biotin noch aktiv ist. Wenn der eluierten Material auf einem Coomassie gefärbt Protein Gel (Abbildung 6), in der Regel analysiert wurde, die stärkste Band zu beachten läuft bei etwa 17 kDa und Monomeren Streptavidin entspricht. Bands, die entsprechend der endogenen biotinylierte Proteine und die Fusionsproteine können auch beobachtet werden. Wir schneiden in der Regel Bereich der Probe Spur über dem Streptavidin-Band bis zu den Laden gut (Abbildung 6). Die ausgeschnittene Band kann in eine 1,5 mL-Tube gespeichert und an eine Massenspektrometrie-Anlage gesendet. Alternativ können gebundene Proteine auch an den Streptavidin-gekoppelten Perlen Trypsin verdaut und eluiert verdauten Peptide bilden die Spalte. Wir nutzen regelmäßig die MaxQuant Software16 (mit meist Standardparameter und Lysin biotinylierungen als eine mögliche Post-translationale Modifikation hinzufügen, finden Sie unter Referenz 9 für weitere Einzelheiten und typische MS-Ergebnisse), die MS-raw-Daten zu analysieren und die Perseus Suite17 für die anschließende statistische Analyse, beide sind freie Software. Beispiele sind in der Regel in drei biologische Wiederholungen ausgeführt. Verwendung von markierungsfreie Quantifizierung können speziell angereicherte Proteine über Kontrolle Bedingungen identifiziert werden. Um zu Filtern für endogen biotinylierte Proteine und Proteine, die nicht ausdrücklich durch das Enzym BirA * gekennzeichnet sind, betrachten wir nur Proteine, die deutlich über Hits aus sechs Datensätze generiert mit sechs unabhängigen Proteinen angereichert sind. Darüber hinaus berücksichtigen wir nur Hits, die über ein Split-BioID Dataset angereichert sind, wurden durch NBirA * NBirA * Fusionsproteine ersetzt-GFP. Andere Daten-Analyse-Strategien sind vor allem mit stabilen Isotopen Etikettierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) für quantitative Proteomik18vorgeschlagen worden. Darüber hinaus wurden verschiedene Strategien für die direkte Isolierung biotinylierte Peptide mit einer Streptavidin-Variante mit geschwächten Affinität zu Biotin18, spezielle Elution Bedingungen mit organischen Lösungsmitteln19 oder Biotin-spezifische beschrieben Antikörper-20,-21. Während nicht unbedingt führt zur Entdeckung von mehr Proteine, die Identifizierung von biotinylierungen Websites hinzufügen mehr Vertrauen hinsichtlich der Spezifität der Hits und ist nützlich, wenn Adressierung der Topologie einer Interaktion.
<img alt="Arbeitsablauf für die proteomische Analyse: Split-BioID, Klonierung, Transfektion, Biotinylierung, MS, Western Blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Überblick über das Split-BioID Verfahren. Eiweiß 1 interagiert mit Protein 2 im Rahmen der komplexen A oder Protein 3 als Teil der komplexen B. Um speziell die Zusammensetzung der Komplex A Sonde, kann Proteine 1 und 2 Split-BioID zugewiesen werden. Das Foto des Massenspektrometers ist unter einer Creative Commons Attribution-Share gleichermaßen 3.0 Unported Lizenz und wurde von https://commons.wikimedia.org mit Dateinamen von ThermoScientificOrbitrapElite.JPG heruntergeladen. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Gen-Editing-Plasmidkarten mit Restriktionsstellen BamHI, MluI, ClaI; Diagramm für das Klonen von Setups." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Split-BioID Plasmide Expressionskassetten. Wir bieten vier Plasmide um alle Kombinationen von NBirA * und CBirA * Fusionsproteine testen zu können. Die Plasmide und komplette Karten sind erhältlich bei addgene.org unter den angegebenen Nummern. Die Plasmide haben einen Tet-responsive Element (7 X TetO) und müssen in einer Zelllinie verwendet werden, die mit dem Tet-Ausdruck-System kompatibel ist. Beachten Sie auch, dass in allen Plasmiden ORFs FKBP und FRB zu NBirA verschmolzen * und CBirA * bzw. Fragmente. Diese beiden Proteine interagieren nur in Anwesenheit von Rapamycin und daher können Plasmide verwendet werden, um das System schnell in das Vorhandensein oder Fehlen von diesem chemischen9zu testen. Die angegebenen Restriktionsschnittstellen sind einzigartig. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Ergebnisse der Proteinelektrophorese; Western-Blot-Analyse von Dicer, TNRC6C, Ago2 mit Antikörpern." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: typische Western-Blot für ein Split-BioID Experiment. Obere Leiste: Erkennung von biotinylierte Proteine mit Gewebekulturen beschrifteten Streptavidin. Untere Leiste: Erkennung von Fusionsproteinen mit Anti-Myc und Anti-FLAG Antikörper. Zwei Paare der Proteine wurden getestet: Ago2/TNRC6C und Ago2/Dicer. In Gassen, 2 &amp; 3 war das CBirA * Fragment Ago2 angefügt. In Gassen 6 &amp; 7 war das NBirA * Fragment Ago2 angefügt. Kein signifikantes Signal wurde beobachtet, wenn jede der drei Proteine mit NBirA * kombiniert wurden-GLP (Bahnen 1, 4-5). Die Sterne zeigen die Bänder entsprechend endogen biotinylierte Proteine, die als interne laden Kontrollen dienen können. Diese Zahl ist aus Abbildung 5 b von Schopp Et Al. adaptiert 9 unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International-Lizenz. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Arbeitsablauf der Zellaufreinigung mit magnetischen Kügelchen; SDS-PAGE-Ergebnisse; Methode zur Proteinanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Überblick über die Streptavidin-Pulldown-Verfahren. Wichtige Schritte für die Isolierung von biotinylierte Proteine für Massenspektrometrie Analyse werden dargestellt. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Ergebnis der SDS-PAGE-Proteinreinigung, Konjugat-Streptavidin-Wechselwirkung, Elektrophorese-Gel." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: typische Western-Blot für ein Streptavidin-Pulldown-Experiment. Gleiche Volumina der angegebenen Samples auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel geladen wurden. Nach Western blotting, wurden mit HRP-gekoppelte Streptavidin biotinylierte Proteine entdeckt. Bands, die entsprechenden NBirA *-TNRC6C und CBirA *-Ago2 angegeben. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="SDS-PAGE Gel, Proteinbandentrennung, Split-BioID, Streptavidin, Molekulargewichtsmarker." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57479/57479fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Abbildung 6: typische Coomassie gefärbt Protein Gel für Massenspektrometrie Analyse. Die eluierten Probe von Streptavidin-gekoppelten Perlen war auf einem vorgefertigten Protein Gel geladen und ausgeführt, bis die Probe Migrieren von 2-3 cm. Die großen Band gesehen bei etwa 17 kDa ist Streptavidin. Direkt oberhalb der Band ist ausgeschnitten und an einer Massenspektrometrie-Anlage gesendet. Bands, die entsprechenden NBirA *-TNRC6C und CBirA *-Ago2 angegeben. <a href="/files/ftp_upload/57479/57479fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transfektion Probe</td>
			<td colspan="3">Zustand geprüft</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="3">CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GLP / CBirA *-protein1</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="3">NBirA *-GLP / CBirA *-protein2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="3">keine Transfektion</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: In der Regel getestet Bedingungen beim Split-BioID anwenden auf zwei Proteine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sequenzierung Grundierung</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassette 1 rückwärts-Primer (CBirA * Fusion)</td>
			<td>TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kassette 2 rückwärts-Primer (NBirA * Fusion)</td>
			<td>GTGGTTTGTCCAAACTCATC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Sequenzierung Primer für die Split-BioID Plasmide.

Wir bieten eine schrittweise Protokoll für Split-BioID, ein Protein-Fragmente-Ergänzung-Assay basiert auf der Nähe-labeling Technik BioID. Auf das Zusammenspiel der zwei bestimmte Proteine aktiviert, ermöglicht es die Proteomik-Analyse der Kontext-abhängige Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Die Methode ist einfach, kostengünstig und erfordert nur standard Laborgeräten.

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zusammensetzung von Proteinkomplexen zu untersuchen, die sich spezifisch um ein Paar interagierender Proteine von Interesse ansammeln, und zwar mit Hilfe von split-BioID, einem Proteinfragment-Komplementationsassay, der eine proximity-abhängige Protein-Biotinylierung in lebenden Zellen induziert. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie sich Proteinkomplexe dynamisch umgestalten, um verschiedene zelluläre Funktionen zu regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die einfache Identifizierung kontextspezifischer Proteinkomplexe in ihrer nativen zellulären Umgebung und mit sehr hoher Auflösung ermöglicht.Für die abschließende massenspektrometrische Analyse sind die folgenden Schritte unter keratinfreien Bedingungen durchzuführen und alle Materialien und Reagenzien sollten so keratinfrei wie möglich sein. Nach der Klonierung der ORFs von zwei Proteinen von Interesse in das Split-BioID-Plasmid, der Durchführung einer transienten Transfektion und der anschließenden Zugabe von Biotin-supplementiertem Medium gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Geben Sie 1,5 Milliliter PBS auf jede Platte und verwenden Sie einen Schaber, um die Zellen zu ernten, dann übertragen Sie die Zellen für jede Bedingung in ein separates 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.200-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius.Entfernen Sie die Überstände und frieren Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff ein. Anschließend lagern Sie die Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius. Zur Herstellung von Zelllysaten verwenden Sie einen Milliliter RT-Lysepuffer, um die Pellets zu resuspendieren.Führen Sie dann die Zellen 10 bis 20 Mal durch eine 25-Gauge-Nadel. Als nächstes beschallen Sie die Proben. Fügen Sie dann 100 Mikroliter 20 % Triton X-100 pro 900 Mikroliter zurückgewonnenes beschalltes Lysat für eine Endkonzentration von 2 % hinzuFügen Sie 2,3 Milliliter 50 Millimolar Tris, pH 7,4, pro Milliliter Lysat hinzu, um die NaCl-Konzentration auf 150 Millimolar für die Bindung an Streptavidin-Kügelchen einzustellen.Dann verteilen Sie die eingestellten Lysate in 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren sie bei 16.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für zehn Minuten. Die Überstände werden in ein 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und 50 bis 100 Mikroliter als Inputmaterial aufbewahrt. Um einen Streptavidin-Pulldown durchzuführen, werden für jede Bedingung 200 Mikroliter Streptavidin-gekoppelte magnetische Bead-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen.Legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell und warten Sie etwa eine Minute, bevor Sie den Lagerpuffer entfernen. Mit einem Milliliter Äquilibrierungspuffer die Kügelchen durch leichtes Mischen waschen. Verteilen Sie dann die äquilibrierten Kügelchen gleichmäßig in die erforderliche Anzahl von Röhrchen und legen Sie sie wieder auf das Magnetgestell.Nach Entfernen des Äquilibrierungspuffers resuspendieren Sie jeden Satz von Kügelchen mit der gleichen Menge der entsprechenden Zelllysate. Anschließend werden die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad inkubiert. Legen Sie die Röhren am nächsten Tag auf ein Magnetgestell.Warten Sie, bis die Kügelchen an der Seite der Röhrchen kleben, und geben Sie die Überstände in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das als Durchfluss gekennzeichnet ist. Mit 200 Mikrolitern Waschpuffer eins resuspendieren Sie die Kügelchen in jedem Röhrchen und kombinieren Sie jeden Satz resuspendierter Kügelchen, der einer Bedingung entspricht, in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie einen Milliliter Waschpuffer, einen Milliliter, um die Kügelchen acht Minuten lang zweimal auf einem rotierenden Rad zu waschen.Führen Sie dann jeweils zwei Waschgänge für die Waschpuffer zwei, drei und vier durch. Um sicherzustellen, dass der Waschpuffer nach dem letzten Waschschritt vollständig entfernt wird, schleudern Sie die Proben nach dem Entfernen des größten Teils des Überstands herunter. Legen Sie sie dann wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie den restlichen Puffer.Geben Sie 30 Mikroliter Elutionspuffer zu den Kügelchen, inkubieren Sie die Proben dann fünfzehn Minuten lang bei 98 Grad Celsius und bringen Sie die Röhrchen sofort in das Magnetgestell. Übertragen Sie die eluierte Probe in ein frisches Röhrchen und lagern Sie die Röhrchen bis zur weiteren Verarbeitung bei minus 20 Grad Celsius. Für jede Eingabeprobe wird eine PAGE-Probe vorbereitet, indem gleiche Mengen Protein mit dem entsprechenden Volumen von 3X SDS-Ladepuffer in einem Gesamtvolumen von 28 Mikrolitern gemischt werden.Bereiten Sie dann PAGE-Proben vor, indem Sie fünf Mikroliter jeder Elutionsprobe mit 2,5 Mikrolitern 3X SDS-Ladepuffer mischen. Laden Sie die Proben auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel. Fahren Sie dann mit der Elektrophorese und dem Western Blotting gemäß dem Textprotokoll fort.Um die SDS-PAGE für die MS-Analyse durchzuführen, fügen Sie 6,25 Mikroliter 4X Probenpuffer zu 18,75 Mikrolitern jeder Elutionsprobe hinzu und lassen Sie die Proben auf einem vier bis 20% vorgegossenen SDS-Gel laufen, bis sie zwei bis drei Zentimeter in das Gel wandern. Färben Sie das Gel in einer 15 Zentimeter großen Petrischale mit dem kolloidalen Coomassie Brilliant Blue G250 Fleck. Verwenden Sie ein sauberes Skalpell, um die gesamten Spuren für jede Probe mit Ausnahme der Streptavidin-Bande zu exzidieren, und übertragen Sie die herausgeschnittenen Banden für die MS-Analyse in 1,5-Milliliter-Röhrchen.Zusätzlich zu den endogenen biotinylierten Proteinen, die in einem BioID-Split-BioID-Experiment identifiziert wurden, sind die zusätzlichen Hauptbanden, die durch Western Blot beobachtet wurden, die Fusionsproteine, die sich selbst biotinylierten, was darauf hindeutet, dass die beiden getesteten Proteine, in diesem Beispiel Ago2 und TNRC6C oder Ago2 und Dicer, in den Zellen interagierten. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse des Western Blots darauf hin, dass ein NBirA*Ago2-Fusionsprotein in Kombination mit CBirA*-Fusionen zu TNRC6C oder Dicer effizienter ist als die entgegengesetzten Kombinationen, bei denen CBirA*Ago2 mit NBirA*-Fusionen der beiden anderen Proteine gepaart ist. Darüber hinaus war die Aktivierung spezifisch, da keine der CBirA*-Fusionen das NBirA*GFP-Kontrollfusionsprotein in nennenswertem Umfang aktivieren konnte.Bei der erstmaligen Durchführung der Isolierung sollten alle Schritte der Reinigung durch Western Blotting analysiert werden. Wie hier dargestellt, sollte die Bindung an die Kügelchen nahezu quantitativ sein und in den Waschvorgängen praktisch kein Durchlaufen beobachtet werden. Wenn das eluierte Material nach Proteinexpression und induzierter Biotinylierung auf ein Coomassie-gefärbtes Gel aufgebracht wird, verläuft die stärkste beobachtete Bande bei etwa 17 Kilodalton und entspricht monomerem Streptavidin.Der Bereich der Probenspur oberhalb des Streptavidin-Bandes in der Ladevertiefung wird für die MS-Analyse in der Regel herausgeschnitten. Bei der Anwendung dieses Verfahrens auf zwei gegebene Proteine ist es wichtig, unterschiedliche Kombinationen von Fusionsproteinen zu testen. In der Tat haben wir oft beobachtet, dass die Gesamteffizienz der Biotinylierung eng davon abhängen kann, welches Protein an die N- oder C-terminalen BirA-Fragmente angehängt wird.Ebenso wichtig ist es, mindestens ein Negativkontroll-Split-BioID-Experiment hinzuzufügen. Zum Beispiel auf ein Paar interagierender Proteine, die nicht mit dem interessierenden Proteinpaar verwandt sind. Nach diesem Verfahren und der Massenspektrometrie sollte eine computergestützte Analyse angewendet werden, um die identifizierten Peptide anhand der Negativkontrollexperimente zu bewerten.Wir verwenden zum Beispiel die Software MaxQuant und Perseus, die von den Laboren Cox und Mann in München entwickelt wurden.

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Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP). Diese neuartige Methode ermöglicht bestimmte Isolierung und Charakterisierung der nachgeschalteten Proteomic zwei interagierenden Proteine während ausgenommen un komplexiert einzelne Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden Bindungspartner gebildet.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Die AviTag-spezifische standortbeschränkte Beleuchtungsverstärkte Biotinylierung (ALIBi) ist eine neuartige optogenetetisch aktivierte Methode, die zur Markierung und Affinitätsreinigung subzellulärer Populationen von Ribosomen für die nachgelagerte Sequenzierung und proteomische Analyse entwickelt wurde.

Isolierung subzellulärer Ribosom-Subpopulationen basierend auf rekombinanten, peptid-tag-spezifischer, ortsbeschränkter Beleuchtungsverstärkter Biotinylierung

Das Protokoll stellt eine Methode für die kovalente In-vivo-Bindung von Biotin an Proteine vor, die auf ihrer Nähe zu einer Biotin-Ligase basiert, die mit einem Protein von Interesse fusioniert ist. Diese Modifikation ermöglicht eine selektive Anreicherung der Proteine mit Streptavidin-Kügelchen, wie sie in Proteininteraktionsstudien benötigt wird.

Im lebenden Organismus Proximity-Biotinylierung für Proteininteraktionsstudien in Paramecium tetraurelia

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Erfahren Sie, wie Split-BioID Proteinfragment-Komplementation nutzt, um kontextspezifische Proteinkomplexe in natürlicher zellulärer Umgebung mit hoher Auflösung zu analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in dynamische Proteininteraktionen.

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

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