Name: Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie eine minimalinvasive Injektionstechnik für Mikropartikel in das Nieren-Kreislaufsystem von adulten Zebrafischen. Diese Methode ermöglicht wiederholte in-vivo-Messungen des Blut-pH-Werts mittels intravitaler Bildgebung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autoren erkennen stark Hilfe von Bogdan Osadchiy und Evgenii Protasov (staatliche Universität Irkutsk, Russland) in Vorbereitung des video-Protokolls. Diese Forschung wurde von der russischen Science Foundation (#15-14-10008) und der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (#15-29-01003) unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren wurden im Einklang mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche und die Tier Themen Forschung Ausschusses des Instituts für Biologie an Irkutsk Landesuniversität genehmigt worden.
1. Herstellung von Mikrokapseln
Hinweis: Mikrokapseln mit einem Fluoreszenzfarbstoff werden mit einer Schicht für Schicht Versammlung entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8zubereitet. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
<ol><li>Um poröse CaCO3 Microcores umschließt den Fluoreszenzfarbstoff zu synthetisieren, mischen Sie 2 mL der SNARF-1-Dextran-Lösung (die meisten Polymer gebundener Fluoreszenzfarbstoff wie FITC-BSA kann verwendet werden) in einer Konzentration von etwa 2 mg/mL mit 0,6 mL jeweils 1 Mol/L-Lösungen von CaCl2 und Na2CO3 unter schnell rühren. Hinweis: Achten Sie auf die unterschiedlichen Empfindlichkeiten von Fluoreszenzfarbstoffen, Immunofluoreszenz; Wenn eine lichtempfindliche fluoreszierende Sonde (wie SNARF-1) verwendet wird, müssen die Manipulation und Lagerung der Mikropartikel mit so wenig Licht wie möglich durchgeführt werden.</li>
	<li>Nach ca. 5-10 s Agitation, übertragen die Aussetzung auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 15 s bei 10.000-12.000 g zu CaCO3 Microcores Pellets.</li>
	<li>Den überstand verwerfen, die Kerne mit ~ 2 mL entionisiertem Wasser waschen und Aufschwemmen der Pellets durch Schütteln.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation Waschvorgang in insgesamt drei Mal. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren. Achtung: Vergessen Sie nicht, Ohren mit Kopfhörern zu schützen.</li>
	<li>Um die erste Polymerschicht auf die Vorlagen einzuzahlen, Aufschwemmen der Kerne in ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von Poly(allylamine hydrochloride) (PAK) in 1 Mol/L NaCl.<ol>
<li>Halten Sie die Microcores in der Lösung für ~ 5 min mit konstanter schütteln.</li>
		<li>Nach 15 s der Zentrifugation, verwerfen den Überstand mit dem ungebundenen PAH. Waschen Sie die überdachte Microcores mit entionisiertem Wasser mindestens 3 Mal durch mehrere Zentrifugation und Waschschritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Microcores für 1 min in ein Ultraschallbad, deren Aggregation zu reduzieren. Hinweis: Wenn die angewandte Fluoreszenzfarbstoff kationischen ist, starten von Poly (Natrium-4-Styrenesulfonate) (PSS) in 1 Mol/L NaCl (siehe Schritt 1,7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.6 mit ~ 2 mL einer 4 mg/mL Lösung von PSS (auch mit 1 Mol/L NaCl) die zweite Polymerschicht auf die Vorlagen zu hinterlegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 sechs mal 12 Polymere Schichten zu hinterlegen. Hinweis: Es empfiehlt sich nicht für eine lange Pause (~ 12 h oder mehr) in der Prozedur bis ~ 3-5 Schichten weil CaCO3 Microcores ohne Abdeckung kann tendenziell recrystallize hinterlegt worden. Beachten Sie, dass PSS Abdeckung eine höhere Ansammlung von den Microcores bewirkt und die lange Pause empfiehlt sich nur dann, wenn PAH oder Poly-L-Lysin mit Polyethylenglykol veredelt (PLL-g-PEG) ist die äußerste Schicht.</li>
	<li>Inkubieren Sie die überdachte Microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pro reaktionscup) für mindestens 2 h.<ol>
<li>Waschen Sie die Microcores mit Wasser über sequentielle Zentrifugation und Wiederfreisetzung Schritte. Nach der letzten Zentrifugation verwerfen des Überstands.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um hohle Mikrokapseln zu erhalten, Auflösen der CaCO3 Vorlagen durch Zugabe von 2 mL 0,1 Mol/L Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Säurelösung (eingestellt auf 7,1 pH mit NaOH) auf die überdachten Microcores.<ol>
<li>Nach ca. 5 min Inkubation, Zentrifugieren die Mikrokapseln für 45 s und entsorgen des Überstands mit EDTA.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.10.1 zweimal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Mikrokapseln mit 0,9 % NaCl dreimal durch mehrere Zentrifugation innerhalb 45 Schritte s gefolgt von Waschschritten. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt verwerfen des Überstands. Hinweis: Die endgültige Mikrokapsel Injektionslösung muss gehalten werden steril (z. B. durch Hinzufügen von Ampicillin, 0,1 mg/mL), und die Medien sollen biokompatible mit dem Ziel, Untersuchung (isotonische Medien mit neutralem pH-Wert).</li>
	<li>Schätzen Sie die Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln in einer Hemocytometer unter dem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie eine Reihe von Bildern der Mikrokapseln, Messen Sie den Durchmesser von über hundert Mikrokapseln mit ImageJ9 oder gleichwertige Software und untersuchen Sie die Größenverteilung mit ein Histogramm.</li>
	<li>Shop der erhaltenen gekapselt Sonde im Dunkeln. Hinweis: nach mehrmaligem Waschen in steriler 0,9 % NaCl, die Mikrokapseln können Monate bei 4 ° c gelagert Vollständige Trocknung der Mikrokapseln während der Lagerung wird nicht empfohlen.</li>
</ol>2. Vorbereitung des optischen Aufbau und Kalibrierung von mikroverkapselte SNARF-1
Hinweis: Grobe pH-Messung mit mikroverkapselte SNARF-1 kann mit Bildern in zwei Kanälen eines fluoreszierenden Mikroskop7erfolgen, aber in diesem Protokoll eine einkanalige fluoreszierende Mikroskop mit einem Glasfaser-Spektrometer verbunden angewendet wurde.
<ol><li>Die erforderlichen Satz von Fluoreszenz-Filter an das fluoreszierende Mikroskop nach den Merkmalen der angewandten Fluoreszenzfarbstoff und schalten Sie der Leuchtstofflampe ein.<ol>
<li>Ziehen Sie den Hebel in die Okulare. Achtung: Überschüssige Licht kann die Spektrometer-Matrix Schäden. So stellen Sie sicher, dass der Hebel in der "Okular" Modus ist, wenn das Spektrometer nicht verwendet wird.</li>
		<li>Schließen Sie ein Ende des Lichtleiters das Spektrometer und das andere Ende an einen Kollimator. Verwendung von Adaptern, legen Sie den Kollimator in den Fokus der Kamera Röhre oder anderen verfügbaren Port des fluoreszierenden Mikroskops.</li>
		<li>Schalten Sie das Spektrometer. Führen Sie das Spektrometer-Steuerprogramm und bereiten Sie das Spektrometer für Messungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie für die Kalibrierung der Mikrokapsel-Charge ~ 5 µL der Mikrokapsel Suspension (~ 10 000 Mikrokapseln pro Mikroliter in entionisiertem Wasser) auf einen Objektträger zu und trocknen Sie den Tropfen an einem dunklen Ort (z.B. in einem Thermostat bei 35 ° C).<ol>
<li>Um die spektralen Eigenschaften der mikroverkapselte SNARF-1 zu kalibrieren, verwenden Sie eine Reihe von Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten im Bereich von ~ 6-9. Drop ~ 10 µL eines Puffers auf die getrockneten Mikrokapseln mit SNARF 1 Dextran und mit einem Deckglas abgedeckt.</li>
		<li>Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Suchen Sie die Mikrokapseln mit einem × 40 Ziel.</li>
		<li>Durch Drehen des Hebels Mikroskop an den Kamera-Anschluss. Registrieren Sie ihre Fluoreszenz mit dem Spektrometer. Drehen Sie den Verschluss wieder in die Okulare. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die spektrale Signal weit jenseits der Hintergrund-Ebene ist, und sicherstellen Sie, dass die Mikrokapseln in das Sichtfeld nicht in einer Blase (durch die Umstellung auf eine geringere Vergrößerung bei Bedarf). Vermeiden Sie längere Beleuchtung der gleichen Mikrokapseln. SNARF-1 reagiert empfindlich auf Immunofluoreszenz.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.3 für unterschiedliche Mikrokapseln 10 - 15 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die Fluoreszenz-Peak-Verhältnisse (z. B. Verwendung von R oder Scilab) für alle registrierten Spektren und bestimmen Sie die Regressionsgerade zwischen dem Median Verhältnis (für jeden Puffer) und mittlerer pH-Wert mit Hilfe der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Hinweis: SNARF-1 hat ein Spektrum mit zwei Spitzen, die Emission des protonierten und deprotonierten Farbstoffs entspricht und das Verhältnis zwischen den Gipfeln reagiert auf den pH-Wert des Mediums. In dieser Studie wird das Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität für 605 und 660 nm verwendet. Diese Wellenlängen sind je nach eingestellter Filter verwendet gewählt. a und b sind Koeffizienten durch nicht-lineare Regression (z. B. Verwendung von R) bestimmt werden. Werte 0,15 bis 1.1 sind, bzw. die minimalen und maximalen Werte der ich605/i660 beobachtet während der Kalibrierung.</li>
	<li>Sammeln Sie etwa 10 µL Blut Fisch von ca. 5 Erwachsene Tiere. Statt Fisch in eine Petrischale mit 1 µL/mL Wasser-Suspension von Nelkenöl für Anästhesie und warten, bis das Tier dreht sich auf der Seite und nicht mehr reagiert, drückt der Flosse (in der Regel ~ 2-3 min). Übertragen Sie die Fische auf einen Objektträger. Die Schwanzflosse mit einer Lanzette abgeschnitten und ca. 2 µL Blut der Fische von der Rute Vene zu sammeln. Hinweis: Um zu verhindern, Blutgerinnung, behandeln Sie den Schnitt mit Heparin (5000 U/mL) zu und verwenden Sie heparinisierten Glaskapillaren und Mikrozentrifugenröhrchen, um das Blut zu sammeln.<ol>
<li>Drip ca. 10 µL Blut mit einer Pipette auf die Spitze der Mikroelektrode und bestimmen den pH-Wert mit einem pH-Meter.</li>
		<li>Tropfen Sie Blut auf eine Folie mit getrockneten Mikrokapseln und registrieren Sie das Verhältnis von der Fluoreszenzintensität wie für die Kalibrierung Puffer (Schritte 2.2-2.3) beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anpassen der lineare Koeffizient der Eichkurve die Kurve die Messungen in der Fisch-Blut (für weitere Details siehe Borvinskaya Et Al. 20175) entsprechen.</li>
</ol>3. Vorbereitung für die Injektion
<ol><li>Lassen Sie die Stahl-Nadel von der Spitze des Insulin-Pen (oder Spritze) durch Entfernen des Kunststoffs mit einer scharfen Lanzette. Hinweis: Eine dünne Nadel (Ø0.33 mm oder weniger) oder Glas-Kapillare (in der Regel Ø1 mm) für die Mikroinjektion10,11zubereitet werden.</li>
	<li>Stechen Sie die Nadel auf halbem Weg in die Glas-Microcapillary; Verlöten Sie schnell und schonend mit einem Gasbrenner.</li>
	<li>Schließen Sie die Glas-Microcapillary an die Microinjector an und spülen Sie es mit sterilem Wasser dreimal. Stellen Sie sicher, dass die Nadel die Flüssigkeit durchströmt.</li>
	<li>Füllen Sie das System mit destilliertem Wasser. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen im System.</li>
</ol>4. Injektion
<ol><li>Die vorbereitete Aussetzung der Mikrokapseln Aufschwemmen (in steriler 0,9 % NaCl oder ein anderes Medium die Injektionen verwendet, mit einer Konzentration von 0,5 bis 6 Millionen Mikrokapseln pro Mikroliter) mit Ultraschallbad für 1 min. Hinweis: Da die Mikrokapseln Niederschlag tendenziell, während der folgenden Injektion, schütteln Sie das Fläschchen mit der Mikrokapseln mechanisch (mit einem Rotor) oder manuell alle paar Minuten sie aufschwemmen und verhindern deren Aggregation.</li>
	<li>Legen Sie den Fisch in eine Petrischale mit Betäubung (0,1 mL/L von Nelkenöl in Wasser suspendiert) für ~ 2 – 3 min. warten, bis der Fisch stellt sich auf seiner Seite und reagiert auf eine leichte Prise die Flosse.</li>
	<li>Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch aus der Narkose zu und legen Sie sie vorsichtig mit einem feuchten Schwamm in einer seitlichen Position mit dem Kopf nach links (für Rechtshänder) oder nach rechts (für Linkshänder).</li>
	<li>Kurz vor der Injektion saugen Sie 1-2 mm Luft in das Glas-Kapillare mit Microinjector verbunden. Laden Sie es anschließend mit ca. 2 µL der dispergierten Mikrokapseln. Hinweis: Vor der Injektion muss die Mikrokapsel-Lösung auf die Temperatur eingestellt werden an dem die Fische gehalten werden.</li>
	<li>Stabilisieren Sie sanft den Körper des Fisches auf den Schwamm mit der nichtdominanten Hand.<ol>
<li>Die Seitenlinie des Fisches zu finden. Geistig markieren Sie ein Segment, das erstreckt sich von der Kiemendeckel bis zum Ende der Bauchhöhle. Die Mitte dieses Segments zu finden. Legen Sie die Nadel 1 mm niedriger ventralen.</li>
		<li>Bewegen Sie mit einer Schaben Bewegung sanft die Fische Skalen beiseite und machen einen Reifenschaden. Stechen Sie die Nadel in den Körper in einem Winkel von 45° auf der Tischoberfläche.</li>
		<li>Schieben Sie die Nadel in Richtung der Wirbelsäule, bis es sorgfältig anliegt.</li>
		<li>Lassen Sie etwa 1 µL der Mikrokapseln Suspension in der Niere und langsam zurückziehen der Nadelöhrs. Hinweis: Um die richtige Einstichstelle zu finden ist leichter, es sinnvoll zu üben, die Suche nach der Stamm Niere durch transilluminating die Fische mit einem unteren Licht, wie in Abbildung 2A und 2 bdargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie den Fisch von Kopf zu Endstück mit einem Strom des Wassers, eine verschütteten Mikrokapseln an der Injektionsstelle zu entfernen.</li>
</ol>5. in Vivo Visualisierung
<ol><li>Verwenden Sie die Dissektion Schere die Kiemendeckel aus den Fischkopf entfernen und entblößen die Kiemen. Spülen Sie die Kiemen mit Wasser.</li>
	<li>Mit einem Löffel, übertragen Sie den Fisch auf einen Objektträger, und legen Sie es auf der Bühne des fluoreszierenden Mikroskops. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Kiemen der Fische während der nachfolgenden Verfahren nicht austrocknen. Um dies zu vermeiden, Befeuchten Sie sie regelmäßig mit Wasser und einer Pasteurpipette (etwa alle 1-2 min).</li>
	<li>Verdunkeln den Raum und mit geringer Vergrößerung (x 10 Ziel) untersuchen die Kiemen, die fluoreszierenden Mikrokapseln zu finden. Hinweis: Wenn das Verfahren für die Einführung von einigen fluoreszierenden Partikeln in Fisch-Kreislauf-System verwendet wird, empfiehlt es Kiemen mehrerer Personen für unerwartete fluoreszierenden Partikeln vor Injektionen zu inspizieren. Kiemen von Wildtyp Zebrafisch haben keine Autofluoreszenz, aber in einigen Fällen können sporadische fluoreszierende Partikeln (z. B. Lebensmittel Stücke oder einzelligen Symbionten) auf Kiemen vorhanden sein. Wenn nötig, solche Partikel können basierend auf ihre spezifische Form erkannt werden (z. B. Lebensmittel Stücke haben unregelmäßigen Form, im Gegensatz zu kugelförmig Mikrokapseln) oder Fluoreszenz-Spektrum (z.B. Farbe).<ol>
<li>Wechseln Sie das Objektiv in eine höhere Größenordnung (× 40 Ziel) und positionieren Sie eine Mikrokapsel oder eine Gruppe von Mikrokapseln in der Mitte des Sichtfeldes.</li>
		<li>Durch Drehen des Hebels zum Hafen mit einem angeschlossenen Spektrometer. Die spektrale Signal aufzeichnen.</li>
		<li>Drehen Sie den Verschluss wieder in das Okular.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Messungen für unterschiedliche Mikrokapseln mehrmals.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Fische in das Aquarium mit der richtigen Belüftung für die Wiederherstellung. Hinweis: Mit minimalen Praxis ist es möglich zur Durchführung der Injektion und Signal Aufnahme mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 2 bis 3 min pro Fisch. Für eine individuelle mehrmals mit dem Einsatz von wiederholten niedrig, harmlosen Dosen der Narkose oder eine andere Methode der Fixierung kann die Messung wiederholt werden. Verwenden Sie für Langzeit-Beobachtung ein System mit kontinuierlicher Narkose12.</li>
</ol>

<ol><li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li>
<li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427(2016).</li>
<li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li>
<li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).</li>
<li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/jm/b705419j#!divAbstract">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li>
<li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210020">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+-+Version+1.44%22">ImageJ User Guide - Version 1.44</a>. , 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ">imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ </a> (2012).</li>
<li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960(2008).</li>
<li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+renal+pathology%3A+Emerging+models+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li>
<li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092777570300195X">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li>
<li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl0259333">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li>
<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um die Injektion von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Niere zu demonstrieren, haben wir semipermeable Mikrokapseln mit einem indikatorfarbstoff geladen. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung der Mikrokapseln mit der Schicht für Schicht Versammlung von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8,15,16,17 ,18...

Die Verwaltung der Mikro-Größe Partikel in den tierischen Organismus ist eine wichtige Aufgabe in Bereichen wie Drogen und Impfstoff Lieferung1, Gefäßsystem Visualisierung2, transgenen Zelle Implantation3und winzigen optischen Sensor implantation 4 , 5. der Implantation für Microscale Partikel in das Gefäßsystem von kleinen Labortieren ist jedoch schwierig, vor allem für empfindliche Wasserorganismen. Für populäre Forschung Exemplare wie Zebrafisch, ist es ratsam, die diese Verfahren mit Videoprotokolle geklärt werden.
Intrakardialen und Kapillare Mikroinjektionen erfordert geschultes Personal und einzigartige Mikrochirurgie Einrichtungen für die Lieferung von Microobjects in Zebrafisch Blut. Zuvor wurde ein Retro-Orbital manuelle Injektion3 als eine einfache und effektive Methode für die Verwaltung ganzer Zellen vorgeschlagen. Aber nach unserer Erfahrung dauert wegen der kleinen Fläche des Auges Kapillaren Netzes, es viel Übung, um das gewünschte Ergebnis von dieser Technik zu erreichen.
Hier beschreiben wir eine Methode für die robuste und effiziente Mikropartikel Implantation in das Herz-Kreislauf-System durch manuelle Injektion direkt in das nierengewebe Erwachsenen Zebrafisch, die ist reich an Kapillaren und renaler Gefäße. Diese Technik basiert auf dem video-Protokoll für Stammzelltransplantation in der Zebrafisch Niere6, aber die traumatischen und zeitraubende mikrochirurgische Schritte wurden beseitigt. Die vorgeschlagene Methode zeichnet sich durch geringe Mortalität (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten.
Ein wichtiger Teil des vorgeschlagenen Protokolls ist die Visualisierung der implantierten Mikropartikel (wenn sie fluoreszierende oder eingefärbte) in den Kapillaren der Kieme, ermöglicht eine Überprüfung der Injektion Qualität, eine grobe relative Bewertung der Anzahl der injizierten Partikel und die Erkennung des spektralen Signals für physiologische Messungen direkt aus dem zirkulierenden Blut. Als ein Beispiel für die Einsatzmöglichkeiten von der beschriebenen Technik demonstrieren wir das Protokoll für in Vivo Messungen von Zebrafisch-Blut-pH mittels mikroverkapselte fluoreszierende Sonde, SNARF-1, ursprünglich vorgeschlagenen in Borvinskaya Et Al. 2017-5.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Leuchtstoffsonde. Jeder andere geeignete polymergebundene Fluoreszenzfarbstoff kann als Mikrokapselfüllstoff verwendet werden</td></tr><tr><td>Albumin-Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugat (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>Rhodamin B Isothiocyanat-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluoreszenzsonde</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO3 Template-Bildung</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3 Matrizenbildung</td></tr><tr><td>Poly(allylaminhydrochlorid), MW 50000 (PAK)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Kationisches Polymer</td></tr><tr><td>Poly(Natrium-4-styrolsulfonat), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionisches Polymer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysin [20 kDa] gepfropft mit Polyethylenglykol [5 kDa], g = 3,0 bis 4,5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)</td><td>Endpolymer zur Erhöhung der Biokompatibilität von Mikrokapseln</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Zum Auflösen aufgetragener Polymere</td></tr><tr><td>Wasseraufbereitungssystem</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Zur Herstellung von deionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>Stegler</td><td></td><td>Für die Bildung</td></tr> <tr><td>von CaCO3 TemplatesEppendorf&nbsp; Forschung&nbsp; plus Pipette, 1000 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosierlösungen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Forschung&nbsp; plus Pipette, 10 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosierlösungen</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, Volumenbereich 200 bis 1000 & Mikro; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dosierlösungen</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, Volumenbereich 0,1-10&nbsp; &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dosierlösungen</td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge Microspin 12, High-Speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>Für das Zentrifugations-Waschverfahren von Mikrokapseln</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Mikrokapselsynthese und -lagerung</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-Mischer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>Zur Reduzierung der Mikrokapselaggregation</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td></td><td></td><td>Zur Reduzierung der Mikrokapselaggregation</td></tr><tr><td>Kopfhörer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Zum Schutz der Ohren vor Ultraschall</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>Zum Auflösen der CaCO3 Schablonen</td></tr><tr><td>Mononatriumphosphat</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Herstellung von pH-Puffern</td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Herstellung von pH-Puffern</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>Zur Einstellung des pH-Werts der EDTA-Lösung und der Puffer</td></tr><tr><td>Thermostatkammer</td><td></td><td></td><td>Zum Trocknen von Mikrokapseln auf Glasobjektträger</td></tr><tr><td>Hämozytometer-Blutzahlkammer</td><td></td><td></td><td>Zur Untersuchung der Größe, Verteilung und Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In-vivo-Visualisierung von Mikrokapseln in Fischblut</td></tr><tr><td>Satz Fluoreszenzfilter für SNARF-1 (sollte je nach Mikroskopmodell gewählt werden; Beispiel wird mitgeliefert)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualisierung von Mikrokapseln mit Fluoreszenzsonden</td></tr><tr><td>Faserspektrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Kalibrierung von Mikrokapseln unter</td></tr> dem <tr><td>Mikroskop Optische Faser QP400-2-VIS NIR, 400 &mu; m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Zum Verbinden des Spektrometers mit dem Mikroskopanschluss</td></tr><tr><td>Kollimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Zum Verbinden des Spektrometers mit dem Mikroskopanschluss</td></tr><tr><td>Objektträger aus Glas</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Kalibrierung von Mikrokapseln unter</td></tr><tr><td>dem Mikroskop Deckgläser, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Kalibrierung von Mikrokapseln unter dem Mikroskop</td></tr><tr><td>Glas-Mikrokapillaren Intra MARK, 10 &micro; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Zur Sammlung von Fischblut</td></tr><tr><td>Nelkenöl</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Fischanästhesie</td></tr><tr><td>Lanzette Nr. 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>Zum Schneiden des Fischschwanzes und zum Lösen der Stahlnadel von der Spitze des Insulin-Autoinjektors</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Zur Behandlung aller Oberflächen, die bei der Blutentnahme von Fischen mit Fischblut in Berührung kommen</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-Meter mit Mikroelektrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Zur Bestimmung des pH-Werts von Fischblut</td></tr><tr><td>Insulin-Pen-Nadeln Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Für das Injektionsverfahren. Jede dünne Nadel (& Oslash; 0,33 mm oder weniger) ist geeignet</td></tr><tr><td>Glaskapillaren, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger & te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>Für Injektionsverfahren</td></tr><tr><td>Gasbrenner</td><td></td><td></td><td>Zum Löten von Stahlnadel an Glaskapillare</td></tr><tr><td>Mikroinjektor IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Für die präzise Dosierung von Mikrokapseln Suspension</td></tr><tr><td>Petrischale, 60 mm x 15 mm, Polystyrol</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose</td></tr><tr><td>Kunststofflöffel</td><td></td><td></td><td>Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose</td></tr><tr><td>Feuchter Schwamm</td><td></td><td></td><td>Für Manipulationen mit Fischen unter Narkose</td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Zum Entfernen der Kiemenabdeckung vom Fischkopf</td></tr><tr><td>Pasteurpipette, 3,5 mL</td><td>MARKE</td><td>Z331767</td><td>Zum Befeuchten von Fischkiemen</td></tr></tbody></table>

einfache und effektive verwaltung und visualisierung von mikropartikeln im herz-kreislauf-system von kleinen fischen mit niere injektion

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Die systemische Gabe von Mikro-Größe Partikel in einem lebenden Organismus kann zur Gefäßsystem Visualisierung, Drogen und Impfung, Implantation von transgenen Zellen und kleine optische Sensoren eingesetzt werden. Jedoch intravenöse Mikroinjektionen in kleine Tiere, die meist in biologischen und veterinärmedizinischen Laboratorien verwendet werden, sind sehr schwer und erfordert geschultes Personal. Hier zeigen wir eine robuste und effiziente Methode für die Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem der Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) durch Injektion in die Fisch-Niere. Um die eingeführten Mikropartikel in das Gefäßsystem zu visualisieren, schlagen wir eine einfache intravitalen bildgebende Verfahren in Kiemen. Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo wurde erreicht mit einem injizierten mikroverkapselte Leuchtstofflampen Sonde, SNARF-1, eine der möglichen Anwendungen von der beschriebenen Technik demonstrieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung der Kapselung des pH-sensitiven Farbstoffs und zeigt die Grundsätze der schnelle Injektion und Visualisierung der erhaltenen Mikrokapseln für in Vivo Aufnahme das Fluoreszenzsignal. Die vorgeschlagene Methode der Injektion zeichnet sich durch eine niedrige Sterblichkeitsrate (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten. Alle beschriebene Verfahren können auf anderen kleinen Fischarten wie Guppys und Medaka durchgeführt werden.

Die erzielten Ergebnisse stammen aus einer der drei Hauptkategorien des Protokolls präsentiert: die Bildung von fluoreszierenden Mikropartikel durch Verkapselung von einem Fluoreszenzfarbstoff (Abbildung 1), die Niere Injektion von Mikrokapseln mit weiteren Visualisierung in Gill Kapillaren (Abbildung 2 und 3) und schließlich die in Vivo spektrale Aufnahme SNARF-1 Fluoreszenz zu überwach...

Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Technik zur Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem von erwachsenen Zebrafischen durch Injektion in die Fischniere zu demonstrieren. Die eingebrachten Mikropartikel werden im Gefäßsystem durch eine einfache Technik der intravitalen Bildgebung in den Kiemen der Fische weiter sichtbar gemacht. Dieses Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um wiederholte Messungen des pH-Werts von Fischblut in vivo durchzuführen, indem mikroverkapselte Fluoreszenzsonden für den pH-Wert eingeführt werden.Zu diesem Zweck wird in einem ersten Schritt der pH-empfindliche Farbstoff SNARF-1, der mit Dextran konjugiert ist, in der semipermeablen Polyelektrolythülle im Schicht-für-Schicht-Ansatz verkapselt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird in poröse Kalziumkarbonat-Mikrokerne mitpräzipitiert, und die Kerne werden mit mehreren Schichten aus entgegengesetzten geladenen, nicht biologisch abbaubaren Polymeren beschichtet und mit einem biokompatiblen Polymer, das Polyethylenglykol enthält, überzogen. Als nächstes werden Kalziumkarbonatkerne aufgelöst, um ganze Mikrokapseln zu erhalten, die SNARF-1 enthalten.In der zweiten Phase der Fischanästhesie und -fixierung werden vorbereitete Mikrokapseln direkt in die Niere des Tieres injiziert, um den verkapselten Farbstoff in das Fischkreislaufsystem abzugeben. Als nächstes ist eine minimale Operation erforderlich, um die Kiemenabdeckung zu entfernen und die Kapillaren der Fischkiemen zu entblößen. Anschließend kann die Visualisierung von Mikrokapseln im Blut und die Aufzeichnung des Fluoreszenzspektrums in vivo durch Intravitalmikroskopie erfolgen, um den pH-Wert des Blutes zu überwachen.Wenn die Injektion richtig durchgeführt wurde, ist es möglich, fluoreszierende Mikrokapseln in den Kiemen der Fische unmittelbar nach dem Eingriff zu beobachten. Das Fluoreszenzspektrum der verkapselten Sonde kann mit Hilfe eines Spektrometers aufgezeichnet werden, das mit einem Fluoreszenzmikroskop gekoppelt ist. SNARF-1 hat zwei Emissionspeaks, und das Verhältnis zwischen zwei Wellenlängen, die diesen Peaks entsprechen, kann zur Messung des pH-Werts verwendet werden.Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, fluoreszierende Mikrokapseln in das Kreislaufsystem von Fischen einzubringen und die Fluoreszenz im Fischblut in vivo aus der Ferne zu überwachen. Im Falle der physiologischen Forschung besteht der Hauptvorteil dieser Methode in der wiederholten Messung von Blutparametern bei kleinen Labortieren, die in der Regel schwer durchzuführen sind. Wird eine lichtempfindliche Leuchtstoffsonde verwendet, empfiehlt es sich, den gesamten Eingriff in einem lichtreduzierten Raum durchzuführen.Mischen Sie zwei Milliliter Lösung eines ausgewählten polymergebundenen Fluoreszenzfarbstoffs, SNARF-1-Dextran, mit 0,6 Millilitern einer molaren Calciumchloridlösung und 0,6 Millilitern einer molaren Natriumcarbonatlösung unter schnellem Rühren. In diesem Schritt werden poröse Kalziumkarbonat-Mikrokerne synthetisiert, die den Fluoreszenzfarbstoff einschließen. Nach fünf, 10 Sekunden Rühren die Suspension in zwei Milliliter Mikroröhrchen überführen und 15 Sekunden lang zentrifugieren, um Kalziumkarbonat-Mikrokerne zu pelletieren.Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Kerne mit etwa zwei Millilitern entionisiertem Wasser und schütteln Sie die Suspension. Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschvorgang dreimal. Inkubieren Sie die Suspension eine Minute lang in einem Ultraschallbad, um die Aggregation der Mikrokerne zu reduzieren.Resuspendieren Sie die Calciumcarbonat-Mikrokerne in etwa zwei Millilitern einer Lösung mit vier Mikrogramm pro Milliliter des kationischen Polymers PAK, um die erste polymere Schicht auf den Matrizen abzuscheiden. Halten Sie die Mikrokerne etwa fünf Minuten lang unter ständigem Schütteln in der pH-Lösung. Nach 15 Sekunden Zentrifugation wird der Überstand mit ungebundenem PAK entsorgt und die Mikrokerne durch mehrere Zentrifugations- und Waschschritte dreimal mit Wasser gewaschen.Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit vier Milligramm pro Milliliter Lösung des anionischen Polymers PSS, um die zweite Polymerschicht auf den Schablonen abzuscheiden. Unmittelbar vor dem Hinzufügen der nächsten Schicht ist es ratsam, eine einminütige Inkubation im Ultraschallbad durchzuführen. Die Abscheidung von kationischen und anionischen Polymeren wird sechsmal nacheinander wiederholt, um eine 12-lagige Mikrokapselhülle zu erhalten.Inkubieren Sie anschließend Mikrokerne mit Schalen in dem mit Polyethylenglykol gepfropften Poly-L-Lysin für mindestens zwei Stunden. Waschen Sie dann die bedeckten Mikrokerne einmal mit Wasser durch sequentielle Zentrifugation und Resuspension. Zum Schluss lösen Sie die Calciumcarbonat-Templates in zwei Millilitern 0,1 molare EDTA-Lösung, die auf einen pH-Wert von etwa 7,1 eingestellt ist, um hohle Mikrokapseln zu erhalten.Entsorgen Sie den Überstand nach 45-sekündiger Zentrifugation und wiederholen Sie das Waschen mit EDTA zweimal. Verwerfen Sie den Überstand nach 45-sekündiger Zentrifugation und fügen Sie zwei Milliliter Kochsalzlösung hinzu. Wiederholen Sie die Waschzentrifugationsschritte mit Kochsalzlösung dreimal.Untersuchen Sie die Größenverteilung und Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln in einem Hämozytometer unter einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie ImageJ oder eine gleichwertige Software für die Größenanalyse der Partikel. Bewahren Sie die erhaltene gekapselte Sonde im Dunkeln auf.Um das optische System vorzubereiten, setzen Sie den erforderlichen Satz Fluoreszenzfilter entsprechend den Eigenschaften des angewendeten Fluoreszenzfarbstoffs in das Fluoreszenzmikroskop ein und schalten Sie die Leuchtstofflampe ein. Ziehen Sie den Hebel zu den Okularen heraus. Verbinden Sie die optische Faser von einem Ende mit dem Spektrometer und am anderen Ende mit einem Kollimator.Spielen Sie den Kollimator mit Hilfe von Adaptern im Fokus des Kameratubus oder eines anderen verfügbaren Anschlusses des Fluoreszenzmikroskops ab. Zur Kalibrierung der vorbereiteten Mikrokapseln legen Sie etwa fünf Mikroliter der Mikrokapselsuspension auf einen Objektträger und trocknen Sie den Tropfen an einem dunklen Ort. Schalten Sie das Spektrometer ein.Führen Sie das Spektrometer-Steuerprogramm aus und bereiten Sie das Spektrometer für die Messungen vor. Um die spektralen Eigenschaften des mikroverkapselten SNARF-1 zu kalibrieren, verwenden Sie eine Reihe von Puffern mit unterschiedlichem pH-Wert. Geben Sie etwa 10 Mikroliter Natriumpuffer auf die getrockneten Mikrokapseln mit SNARF-1 und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie die Mikrokapseln mit einer Vergrößerung von etwa 400. Drehen Sie den Mikroskophebel auf den Kameraanschluss.Registrieren Sie die Fluoreszenz mit dem Spektrometer. Stellen Sie sicher, dass das spektrale Signal weit über dem Hintergrundpegel liegt, und beobachten Sie, dass sich die Mikrokapseln nicht in einer Blase befinden. Vermeiden Sie eine längere Beleuchtung der gleichen Mikrokapseln, da SNARF-1 empfindlich auf Photobleaching reagiert.Drehen Sie den Hebel zurück zu den Okularen. Berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzintensität von verkapseltem SNARF-1 bei der Wellenlänge, die den Emissionspeaks des protonierten und deprotonierten Farbstoffs entspricht. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve der Verhältnisabhängigkeit vom pH-Wert des Mediums.Sammeln Sie etwa 10 Mikroliter Blut von eingeschläferten Fischen. Bestimmen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät mit einer Mikroelektrode. Geben Sie dann Blut auf den Objektträger mit getrockneten Mikrokapseln und registrieren Sie das Verhältnis der Fluoreszenzintensität, wie für Kalibrierpuffer beschrieben.Da Sie den Einfluss der Blutbestandteile auf die Auslesung von verkapseltem SNARF-1 berücksichtigen sollten, passen Sie den linearen Koeffizienten der Kalibrierkurve an, damit die Kurve mit den Messungen im Fischblut übereinstimmt. Um die Nadel für die Injektion vorzubereiten, lösen Sie eine Stahlnadel von der Spitze der Insulinspritze, indem Sie den Kunststoff mit einer scharfen Lanzette entfernen. Führen Sie die Nadel zur Hälfte in die Mikrokapillare des Glases ein.Löten Sie es schnell und vorsichtig mit einem Gasbrenner an. Verbinden Sie die Glasmikrokapillare mit dem Mikroinjektor und spülen Sie sie dreimal mit sterilem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit durch die Nadel fließt.Füllen Sie das System mit Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im System befinden. Am Tag des Versuchs wird die vorbereitete Suspension von Mikrokapseln in steriler Kochsalzlösung eingenommen, die eine halbe bis sechs Millionen Mikrokapseln pro Mikroliter enthält.Suspendieren Sie es eine Minute lang wieder durch das Ultraschallbad. Schütteln Sie die Durchstechflasche während der folgenden Injektion regelmäßig, um die Mikrokapseln zu resuspendieren und ihre Aggregation zu verhindern. Holen Sie den Fisch mit einem Löffel aus der Narkose und legen Sie ihn vorsichtig auf einen feuchten Schwamm in einer seitlichen Position, mit dem Kopf nach links, wenn Sie Rechtshänder sind, oder nach rechts, wenn Sie Linkshänder sind.Saugen Sie kurz vor der Injektion ein bis zwei Millimeter Luft in die Glaskapillare, die mit dem Mikroinjektor verbunden ist. Beladen Sie es dann mit etwa zwei Mikrolitern der dispergierten Mikrokapseln. Stabilisieren Sie den Körper des Fisches vorsichtig mit Ihrer nicht dominanten Hand auf dem Schwamm.Finde die Seitenlinie des Fisches. Platzieren Sie die Nadel einen Milliliter unterhalb des Mittelpunkts eines Bauchsegments der Seitenlinie. Schieben Sie dann mit einer Schabebewegung die Fischschuppe beiseite und machen Sie einen Einstich.Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad zur Tischoberfläche in den Körper ein. Schiebe die Nadel in Richtung Wirbelsäule, bis sie vorsichtig auf der Wirbelsäule aufliegt. Geben Sie dann langsam etwa einen Mikroliter der Mikrokapselsuspension in die Niere ab und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.Spülen Sie den Fisch vom Kopf bis zum Schwanz mit einem Wasserstrahl ab, um verschüttete Mikrokapseln an der Injektionsstelle zu entfernen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Kiemenabdeckung vom Fischkopf zu entfernen und die Kiemen des Fisches zu entblößen. Spülen Sie die Kiemen mit Wasser ab.Übertragen Sie den Fisch mit einem Löffel auf einen Objektträger und legen Sie ihn auf den Tisch eines Fluoreszenzmikroskops. Wenn Sie die folgenden Verfahren durchführen, stellen Sie sicher, dass die Kiemen des Fisches nicht austrocknen. Befeuchten Sie sie dazu regelmäßig mit einer Pasteur-Pipette mit Wasser.Verdunkeln Sie den Raum und untersuchen Sie mit geringer Vergrößerung die Kiemen, um fluoreszierende Mikrokapseln zu finden. Wenn Sie es gefunden haben, schalten Sie das Objektiv auf eine höhere Helligkeit und positionieren Sie es in der Mitte des Sichtfelds. Drehen Sie den Hebel an den Anschluss mit angeschlossenem Spektrometer.Nehmen Sie das spektrale Signal auf. Drehen Sie den Hebel zurück zu den Okularen. Wiederholen Sie die Messungen für verschiedene Mikrokapseln mehrmals.Setzen Sie den Fisch zur Erholung mit der richtigen Belüftung in das Aquarium um. Der Messvorgang kann für eine Person mehrmals wiederholt werden, wobei eine wiederholte Anästhesie oder eine andere Fixationsmethode verwendet wird. Das Bild zeigt ein repräsentatives Beispiel für in vivo Messungen von Zebrafischblut und der Hyperkapnie mit dem verkapselten Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1.Unter Kontrollbedingungen bleibt der pH-Wert des Blutes vier Stunden nach der Injektion der Mikrokapseln stabil, während eine fünfminütige Exposition unter erhöhtem Kohlendioxid zu einer Übersäuerung des Fischblutes führt. Bei der Durchführung des Eingriffs ist es wichtig, den Stress der Tiere durch Handhabung und Operation zu minimieren. Mit etwas Übung dauern sowohl die Injektion als auch die Signalregistrierung im Durchschnitt etwa zwei, drei Minuten, so dass dieses Protokoll es ermöglicht, die Manipulationen abzuschließen, bevor der Fisch aus der milden Narkose erwacht.Achten Sie während des Eingriffs darauf, dass die Kiemen der Fische immer angefeuchtet sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine einfache und effektive Implantation von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem von kleinen Fischen durchführen können. Wie gezeigt, ist diese Technik sehr praktisch für wiederholte In-vivo-Messungen des Blut-pH-Werts bei erwachsenen Zebrafischen unter Verwendung von Mikrokapseln, die mit einer Fluoreszenzsonde gefüllt sind.

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir, wie retro-orbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafisch zu tun.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Wir beschreiben eine Technik der Mikroinjektion der Aminoglykosid, Gentamicin, in 2 Tagen nach fetilization (dpf) Zebrafischlarven zu akutem Nierenversagen (AKI) zu induzieren. Wir beschreiben ein Verfahren zur whole mount Immunhistochemie, Kunststoff eingebettet und Schnitte mit Zebrabärblingembryonen der AKI-vermittelten Schaden zu visualisieren.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Injizieren von Plasmid DNA in der Mausniere über das Nierenbecken, Transgene Ausdruck speziell in der Niere zu produzieren.

Hydrodynamische Nierenbecken Injektion für nicht-virale Expression von Proteinen in der Niere

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Kombination von 2 grundlegenden Techniken der renalen Physiologie präsentieren wir Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie, einer Mikropipette Bowmans Harn Raum bei Mäusen zu platzieren. Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie überwindet kritische Grenzen der konventionellen Mikroskopie für mikropunktion renal Physiology Studien.

Mikropunktion Bowmans Platz bei Mäusen durch die 2-Photonen-Mikroskopie

Diese Methode basiert auf der Injektion von 0,5 − 3 μL der Lösung in den Thorax von erwachsenen Zebrafischen. Das Verfahren liefert Proteine und chemische Verbindungen effizient in die Nähe des Zebrafisch-Herzens, ohne das Organ zu beschädigen. Der Ansatz eignet sich für die Untersuchung von Wirkungen exogener Faktoren auf verschiedene Gewebe des Herzens.

Intrathorakische Injektion für die Erforschung des erwachsenen Zebrafischherz

Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

Hier präsentieren wir ein optimiertes und effektives Protokoll für die intravenöse Injektion von Zellen oder pharmakologischen Wirkstoffen in adulte Zebrafische, die zu einer verbesserten Zelltransplantation und erhöhten Überlebensraten der behandelten Zebrafische führen.

Optimierte intravenöse Injektion bei adulten Zebrafischen

Erfahren Sie eine minimalinvasive Injektionstechnik für Mikropartikel in das Nieren-Kreislaufsystem von adulten Zebrafischen. Diese Methode ermöglicht wiederholte in-vivo-Messungen des Blut-pH-Werts mittels intravitaler Bildgebung.

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion (Video) | JoVE Journal

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

Weitere Videos entdecken