Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Technik zur Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem von erwachsenen Zebrafischen durch Injektion in die Fischniere zu demonstrieren. Die eingebrachten Mikropartikel werden im Gefäßsystem durch eine einfache Technik der intravitalen Bildgebung in den Kiemen der Fische weiter sichtbar gemacht. Dieses Verfahren kann beispielsweise verwendet werden, um wiederholte Messungen des pH-Werts von Fischblut in vivo durchzuführen, indem mikroverkapselte Fluoreszenzsonden für den pH-Wert

Zu diesem Zweck wird in einem ersten Schritt der pH-empfindliche Farbstoff SNARF-1, der mit Dextran konjugiert ist, in der semipermeablen Polyelektrolythülle im Schicht-für-Schicht-Ansatz verkapselt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird in poröse Kalziumkarbonat-Mikrokerne mitpräzipitiert, und die Kerne werden mit mehreren Schichten aus entgegengesetzten geladenen, nicht biologisch abbaubaren Polymeren beschichtet und mit einem biokompatiblen Polymer, das Polyethylenglykol enthält, überzogen. Als nächstes werden Kalziumkarbonatkerne aufgelöst, um ganze Mikrokapseln zu erhalten, die SNARF-1 enthalten.

In der zweiten Phase der Fischanästhesie und -fixierung werden vorbereitete Mikrokapseln direkt in die Niere des Tieres injiziert, um den verkapselten Farbstoff in das Fischkreislaufsystem abzugeben. Als nächstes ist eine minimale Operation erforderlich, um die Kiemenabdeckung zu entfernen und die Kapillaren der Fischkiemen zu entblößen. Anschließend kann die Visualisierung von Mikrokapseln im Blut und die Aufzeichnung des Fluoreszenzspektrums in vivo durch Intravitalmikroskopie erfolgen, um den pH-Wert des Blutes zu überwachen.

Wenn die Injektion richtig durchgeführt wurde, ist es möglich, fluoreszierende Mikrokapseln in den Kiemen der Fische unmittelbar nach dem Eingriff zu beobachten. Das Fluoreszenzspektrum der verkapselten Sonde kann mit Hilfe eines Spektrometers aufgezeichnet werden, das mit einem Fluoreszenzmikroskop gekoppelt ist. SNARF-1 hat zwei Emissionspeaks, und das Verhältnis zwischen zwei Wellenlängen, die diesen Peaks entsprechen, kann zur Messung des pH-Werts verwendet werden.

Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, fluoreszierende Mikrokapseln in das Kreislaufsystem von Fischen einzubringen und die Fluoreszenz im Fischblut in vivo aus der Ferne zu überwachen. Im Falle der physiologischen Forschung besteht der Hauptvorteil dieser Methode in der wiederholten Messung von Blutparametern bei kleinen Labortieren, die in der Regel schwer durchzuführen sind. Wird eine lichtempfindliche Leuchtstoffsonde verwendet, empfiehlt es sich, den gesamten Eingriff in einem lichtreduzierten Raum durchzuführen.

Mischen Sie zwei Milliliter Lösung eines ausgewählten polymergebundenen Fluoreszenzfarbstoffs, SNARF-1-Dextran, mit 0,6 Millilitern einer molaren Calciumchloridlösung und 0,6 Millilitern einer molaren Natriumcarbonatlösung unter schnellem Rühren. In diesem Schritt werden poröse Kalziumkarbonat-Mikrokerne synthetisiert, die den Fluoreszenzfarbstoff einschließen. Nach fünf, 10 Sekunden Rühren die Suspension in zwei Milliliter Mikroröhrchen überführen und 15 Sekunden lang zentrifugieren, um Kalziumkarbonat-Mikrokerne zu pelletieren.

Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Kerne mit etwa zwei Millilitern entionisiertem Wasser und schütteln Sie die Suspension. Wiederholen Sie den Zentrifugations- und Waschvorgang dreimal. Inkubieren Sie die Suspension eine Minute lang in einem Ultraschallbad, um die Aggregation der Mikrokerne zu reduzieren.

Resuspendieren Sie die Calciumcarbonat-Mikrokerne in etwa zwei Millilitern einer Lösung mit vier Mikrogramm pro Milliliter des kationischen Polymers PAK, um die erste polymere Schicht auf den Matrizen abzuscheiden. Halten Sie die Mikrokerne etwa fünf Minuten lang unter ständigem Schütteln in der pH-Lösung. Nach 15 Sekunden Zentrifugation wird der Überstand mit ungebundenem PAK entsorgt und die Mikrokerne durch mehrere Zentrifugations- und Waschschritte dreimal mit Wasser gewaschen.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit vier Milligramm pro Milliliter Lösung des anionischen Polymers PSS, um die zweite Polymerschicht auf den Schablonen abzuscheiden. Unmittelbar vor dem Hinzufügen der nächsten Schicht ist es ratsam, eine einminütige Inkubation im Ultraschallbad durchzuführen. Die Abscheidung von kationischen und anionischen Polymeren wird sechsmal nacheinander wiederholt, um eine 12-lagige Mikrokapselhülle zu erhalten.

Inkubieren Sie anschließend Mikrokerne mit Schalen in dem mit Polyethylenglykol gepfropften Poly-L-Lysin für mindestens zwei Stunden. Waschen Sie dann die bedeckten Mikrokerne einmal mit Wasser durch sequentielle Zentrifugation und Resuspension. Zum Schluss lösen Sie die Calciumcarbonat-Templates in zwei Millilitern 0,1 molare EDTA-Lösung, die auf einen pH-Wert von etwa 7,1 eingestellt ist, um hohle Mikrokapseln zu erhalten.

Entsorgen Sie den Überstand nach 45-sekündiger Zentrifugation und wiederholen Sie das Waschen mit EDTA zweimal. Verwerfen Sie den Überstand nach 45-sekündiger Zentrifugation und fügen Sie zwei Milliliter Kochsalzlösung hinzu. Wiederholen Sie die Waschzentrifugationsschritte mit Kochsalzlösung dreimal.

Untersuchen Sie die Größenverteilung und Konzentration der vorbereiteten Mikrokapseln in einem Hämozytometer unter einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie ImageJ oder eine gleichwertige Software für die Größenanalyse der Partikel. Bewahren Sie die erhaltene gekapselte Sonde im Dunkeln auf.

Um das optische System vorzubereiten, setzen Sie den erforderlichen Satz Fluoreszenzfilter entsprechend den Eigenschaften des angewendeten Fluoreszenzfarbstoffs in das Fluoreszenzmikroskop ein und schalten Sie die Leuchtstofflampe ein. Ziehen Sie den Hebel zu den Okularen heraus. Verbinden Sie die optische Faser von einem Ende mit dem Spektrometer und am anderen Ende mit einem Kollimator.

Spielen Sie den Kollimator mit Hilfe von Adaptern im Fokus des Kameratubus oder eines anderen verfügbaren Anschlusses des Fluoreszenzmikroskops ab. Zur Kalibrierung der vorbereiteten Mikrokapseln legen Sie etwa fünf Mikroliter der Mikrokapselsuspension auf einen Objektträger und trocknen Sie den Tropfen an einem dunklen Ort. Schalten Sie das Spektrometer ein.

Führen Sie das Spektrometer-Steuerprogramm aus und bereiten Sie das Spektrometer für die Messungen vor. Um die spektralen Eigenschaften des mikroverkapselten SNARF-1 zu kalibrieren, verwenden Sie eine Reihe von Puffern mit unterschiedlichem pH-Wert. Geben Sie etwa 10 Mikroliter Natriumpuffer auf die getrockneten Mikrokapseln mit SNARF-1 und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.

Legen Sie einen Objektträger auf den Mikroskoptisch. Lokalisieren Sie die Mikrokapseln mit einer Vergrößerung von etwa 400. Drehen Sie den Mikroskophebel auf den Kameraanschluss.

Registrieren Sie die Fluoreszenz mit dem Spektrometer. Stellen Sie sicher, dass das spektrale Signal weit über dem Hintergrundpegel liegt, und beobachten Sie, dass sich die Mikrokapseln nicht in einer Blase befinden. Vermeiden Sie eine längere Beleuchtung der gleichen Mikrokapseln, da SNARF-1 empfindlich auf Photobleaching reagiert.

Drehen Sie den Hebel zurück zu den Okularen. Berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenzintensität von verkapseltem SNARF-1 bei der Wellenlänge, die den Emissionspeaks des protonierten und deprotonierten Farbstoffs entspricht. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve der Verhältnisabhängigkeit vom pH-Wert des Mediums.

Sammeln Sie etwa 10 Mikroliter Blut von eingeschläferten Fischen. Bestimmen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät mit einer Mikroelektrode. Geben Sie dann Blut auf den Objektträger mit getrockneten Mikrokapseln und registrieren Sie das Verhältnis der Fluoreszenzintensität, wie für Kalibrierpuffer beschrieben.

Da Sie den Einfluss der Blutbestandteile auf die Auslesung von verkapseltem SNARF-1 berücksichtigen sollten, passen Sie den linearen Koeffizienten der Kalibrierkurve an, damit die Kurve mit den Messungen im Fischblut übereinstimmt. Um die Nadel für die Injektion vorzubereiten, lösen Sie eine Stahlnadel von der Spitze der Insulinspritze, indem Sie den Kunststoff mit einer scharfen Lanzette entfernen. Führen Sie die Nadel zur Hälfte in die Mikrokapillare des Glases ein.

Löten Sie es schnell und vorsichtig mit einem Gasbrenner an. Verbinden Sie die Glasmikrokapillare mit dem Mikroinjektor und spülen Sie sie dreimal mit sterilem Wasser. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit durch die Nadel fließt.

Füllen Sie das System mit Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im System befinden. Am Tag des Versuchs wird die vorbereitete Suspension von Mikrokapseln in steriler Kochsalzlösung eingenommen, die eine halbe bis sechs Millionen Mikrokapseln pro Mikroliter enthält.

Suspendieren Sie es eine Minute lang wieder durch das Ultraschallbad. Schütteln Sie die Durchstechflasche während der folgenden Injektion regelmäßig, um die Mikrokapseln zu resuspendieren und ihre Aggregation zu verhindern. Holen Sie den Fisch mit einem Löffel aus der Narkose und legen Sie ihn vorsichtig auf einen feuchten Schwamm in einer seitlichen Position, mit dem Kopf nach links, wenn Sie Rechtshänder sind, oder nach rechts, wenn Sie Linkshänder sind.

Saugen Sie kurz vor der Injektion ein bis zwei Millimeter Luft in die Glaskapillare, die mit dem Mikroinjektor verbunden ist. Beladen Sie es dann mit etwa zwei Mikrolitern der dispergierten Mikrokapseln. Stabilisieren Sie den Körper des Fisches vorsichtig mit Ihrer nicht dominanten Hand auf dem Schwamm.

Finde die Seitenlinie des Fisches. Platzieren Sie die Nadel einen Milliliter unterhalb des Mittelpunkts eines Bauchsegments der Seitenlinie. Schieben Sie dann mit einer Schabebewegung die Fischschuppe beiseite und machen Sie einen Einstich.

Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad zur Tischoberfläche in den Körper ein. Schiebe die Nadel in Richtung Wirbelsäule, bis sie vorsichtig auf der Wirbelsäule aufliegt. Geben Sie dann langsam etwa einen Mikroliter der Mikrokapselsuspension in die Niere ab und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.

Spülen Sie den Fisch vom Kopf bis zum Schwanz mit einem Wasserstrahl ab, um verschüttete Mikrokapseln an der Injektionsstelle zu entfernen. Verwenden Sie eine Präparierschere, um die Kiemenabdeckung vom Fischkopf zu entfernen und die Kiemen des Fisches zu entblößen. Spülen Sie die Kiemen mit Wasser ab.

Übertragen Sie den Fisch mit einem Löffel auf einen Objektträger und legen Sie ihn auf den Tisch eines Fluoreszenzmikroskops. Wenn Sie die folgenden Verfahren durchführen, stellen Sie sicher, dass die Kiemen des Fisches nicht austrocknen. Befeuchten Sie sie dazu regelmäßig mit einer Pasteur-Pipette mit Wasser.

Verdunkeln Sie den Raum und untersuchen Sie mit geringer Vergrößerung die Kiemen, um fluoreszierende Mikrokapseln zu finden. Wenn Sie es gefunden haben, schalten Sie das Objektiv auf eine höhere Helligkeit und positionieren Sie es in der Mitte des Sichtfelds. Drehen Sie den Hebel an den Anschluss mit angeschlossenem Spektrometer.

Nehmen Sie das spektrale Signal auf. Drehen Sie den Hebel zurück zu den Okularen. Wiederholen Sie die Messungen für verschiedene Mikrokapseln mehrmals.

Setzen Sie den Fisch zur Erholung mit der richtigen Belüftung in das Aquarium um. Der Messvorgang kann für eine Person mehrmals wiederholt werden, wobei eine wiederholte Anästhesie oder eine andere Fixationsmethode verwendet wird. Das Bild zeigt ein repräsentatives Beispiel für in vivo Messungen von Zebrafischblut und der Hyperkapnie mit dem verkapselten Fluoreszenzfarbstoff SNARF-1.

Unter Kontrollbedingungen bleibt der pH-Wert des Blutes vier Stunden nach der Injektion der Mikrokapseln stabil, während eine fünfminütige Exposition unter erhöhtem Kohlendioxid zu einer Übersäuerung des Fischblutes führt. Bei der Durchführung des Eingriffs ist es wichtig, den Stress der Tiere durch Handhabung und Operation zu minimieren. Mit etwas Übung dauern sowohl die Injektion als auch die Signalregistrierung im Durchschnitt etwa zwei, drei Minuten, so dass dieses Protokoll es ermöglicht, die Manipulationen abzuschließen, bevor der Fisch aus der milden Narkose erwacht.

Achten Sie während des Eingriffs darauf, dass die Kiemen der Fische immer angefeuchtet sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine einfache und effektive Implantation von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem von kleinen Fischen durchführen können. Wie gezeigt, ist diese Technik sehr praktisch für wiederholte In-vivo-Messungen des Blut-pH-Werts bei erwachsenen Zebrafischen unter Verwendung von Mikrokapseln, die mit einer Fluoreszenzsonde gefüllt sind.