Intrathorakische Injektion für die Erforschung des erwachsenen Zebrafischherz
May 14th, 2019
Diese Methode basiert auf der Injektion von 0,5 − 3 μL der Lösung in den Thorax von erwachsenen Zebrafischen. Das Verfahren liefert Proteine und chemische Verbindungen effizient in die Nähe des Zebrafisch-Herzens, ohne das Organ zu beschädigen. Der Ansatz eignet sich für die Untersuchung von Wirkungen exogener Faktoren auf verschiedene Gewebe des Herzens.
In der Herzforschung an erwachsenen Zebrafischen werden medikamentöse Behandlungen in der Regel systemisch durchgeführt. Mit intrathorakaler Injektion kann man lokal eine Lösung für das Herz liefern, ohne Myokardschäden zu verursachen. Diese Methode ermöglicht die Lieferung von kleinen Mengen von Medikamenten, Proteinen oder anderen Molekülen in Lösung genau um das Herz eines erwachsenen Zebrafisches.
Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Nadelzieher, um mikroinjectionangepasste Borosilikatglaskapillaren zu ziehen. Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren in einer neun Zentimeter langen Petrischale mit Schienen aus Modellton oder Klebeband auf. Schneiden Sie mit einer gewöhnlichen Schere ein Stück Schwamm und schnitzen Sie eine fischartige Silhouette in der Mitte.
Als nächstes bereiten Sie kleine Aliquots der Injektionslösungen mit den getesteten Proteinen oder anderen Verbindungen vor. Passen Sie ihre Konzentration in Abhängigkeit vom Test an, indem Sie die Substanz in 1x Hanks'ausgewogene Salzlösung verdünnen, die mit 10% Phenolrot ergänzt wird. Um die Arbeitskonzentration von Anästhetika zu erhalten, fügen Sie zwei bis drei Milliliter Tricain-Stammlösung zu einem Becher hinzu, der 100 Milliliter Fischwasser enthält.
Schalten Sie zunächst das Stereomikroskop mit dem Licht von oben ein, und stellen Sie die Vergrößerung auf das 16-fache ein. Den Schwamm mit Fischwasser einweichen und auf eine neun Zentimeter lange Petrischale auf dem Mikroskop legen. Passen Sie den Fokus an, und verwenden Sie unter dem Stereomikroskop eine Iridektomieschere, um das Ende einer Mikrokapillare etwa sieben Millimeter von der Basis zu schneiden, wie in Abbildung 1A des Textprotokolls beschrieben.
Setzen Sie die geschnittene Mikrokapillare in den Nadelhalter des Mikroinjektorgeräts ein. Laden Sie mit den Microloader-Spitzen eine Steuerungslösung, um den Einspritzdruck einzurichten, um den entsprechenden Durchfluss zu erhalten, und entleeren Sie dann die Nadel. Danach laden Sie das ausgewählte Volumen der Injektionslösung in die Spitze der Kapillare, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
Verwenden Sie ein Netz, um einen erwachsenen Fisch zu fangen, und übertragen Sie ihn in die Anästhetikumlösung. Nach ein bis zwei Minuten, wenn der Fisch aufhört zu schwimmen und die Bewegung von Operculum reduziert wird, berühren Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel, um sicherzustellen, dass er nicht auf irgendeinen Kontakt reagiert. Als nächstes, schnell und vorsichtig übertragen Sie die Fische in die Nut des nassen Schwamms, mit der ventralen Seite nach oben.
Der Kopf des Fisches sollte von der dominanten Hand des Bedieners wegzeigen. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop sorgfältig die Bewegung des schlagenden Herzens unter der Haut der Fische. Bestimmen Sie visuell den Injektionspunkt über dem schlagenden Herzen und in der Mitte des Dreiecks, definiert durch die ventralen Knorpelplatten.
Setzen Sie die Spitze der Kapillare in einem Winkel zwischen 30 und 45 Grad relativ zur Körperachse ein. Durchdringen Sie die Haut mit der Spitze der Mikrokapillare vorsichtig in das Perikard. Sobald sich die Nadel im Perikard befindet, drücken Sie das Pedal des Mikroinjektors, um die Injektion abzuschließen.
Nach der Injektion die Kapillare vorsichtig aus dem Thorax ziehen und den Fisch sofort in einen Tank mit Systemwasser zur Rückgewinnung geben. Überwachen Sie die Fische bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie. Um die Auswirkungen der Injektion zu analysieren, sammeln Sie das Herz zum gewünschten Zeitpunkt und bereiten Sie es für die weitere Analyse vor.
In dieser Studie werden exogene Verbindungen und Proteine in die Perikardhöhle geliefert, um deren Wirkung auf das Herz bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen. Um diese Methode zu validieren, werden zwei Testexperimente durchgeführt, indem Farb- und Fluoreszenzfarbstoffe in eingeschläferte Fische injiziert werden. In beiden Assays zeigt die Gesamtanalyse die Kennzeichnung des gesamten Herzens einschließlich der Herzkammer, des Atriums und des Bulbus arteriosus.
Diese Ergebnisse zeigen eine effiziente Streuung der Injektionslösungen auf der Herzoberfläche. Um die Eignung der intrathorakalen Injektion mit der intraperitonealen Injektion für Herzstudien zu vergleichen, wird eine ähnliche Menge an DAPI mit beiden Methoden injiziert. Die Herzen werden dann entweder nach fünf Minuten oder nach 120 Minuten fixiert.
Keine DAPI-positiven Zellen werden in den Herzen nach intraperitonealer Injektion zu einem der beiden Zeitpunkte beobachtet. Im Gegensatz dazu führen die intrathorakalen Injektionen zum Vorhandensein von DAPI-markierten Kernen im Myokard. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrathorakale Injektion die Abgabe der Verbindung an das Herz verbessert, im Vergleich zur intraperitonealen Injektion.
Um die Eignung dieser Methode für Herzregenerationsstudien zu testen, ventrikeln kryoinjured, und dann Injektionen werden an drei und sieben Tagen nach der Kryoverletzung durchgeführt. Sowohl das Myokard als auch das verletzte Gewebe enthalten zahlreiche DAPI-positive Zellen, was auf ein effizientes Eindringen dieses Farbstoffs in das intakte Herz und das fibrotische Gewebe hindeutet. Darüber hinaus wird injiziertes Phalloidin AF649 auch durch Kardiomyozyten der Peri-Verletzungszone und einige rekrutierte Fibroblasten des verwundeten Bereichs aufgenommen.
Dieses Experiment zeigt, dass die Medikamente das Epikard kreuzen und in das zugrunde liegende Myokard eindringen können. Nach dem Testen der Effizienz der intrathorakalen Injektionen mit Farbstoffen werden die Auswirkungen von Proteinen, die auf das Herz injiziert werden, analysiert. Dazu werden die Auswirkungen des exogenen Zytokins auf verschiedene Prozesse untersucht.
Die biologischen Aspekte der Kardiomyozytenproliferation, extrazelluläre Matrixabscheidung, Immunzellrekrutierung und kardioprotektive Genexpression werden durch intrathorakale Injektion von Zytokin aktiviert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die intrathorakale Injektion eine geeignete Strategie für die gezielte Abgabe von Proteinen bietet, um deren Auswirkungen auf verschiedene Herzgewebe in einer Vielzahl von Assays zu untersuchen. Das Einsetzen der Nadel in das Perikard ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche Injektion.
Die Form der Nadel, der Eindringwinkel und die Punktionsstellen sind faktoren, die das Einführen der Nadel beeinflussen. Nach oder vor der intrathorakalen Injektion kann man Kryoverletzungen durchführen, um die Wirkung der injizierten Moleküle auf die Herzregeneration zu analysieren. Intrathorakale Injektion wurde bei Zebrafischen verwendet, um die Herzvorbedingung zu studieren.
Ein Protein namens CNTF wurde injiziert und hat gezeigt, zytoprotektive und pro-regenerative Programme im Herzen zu verbessern.
Überblick
Diese Studie präsentiert eine Methode für die intrathorakale Injektion bei erwachsenen Zebrafischen, die eine gezielte Abgabe von Proteinen und Verbindungen zum Herzen ermöglicht. Die Technik zeigt eine verbesserte Effizienz und reduzierte Myokardschäden im Vergleich zu herkömmlichen systemischen Verabreichungsmethoden.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsgebiet
- Herzforschung
- Zebrafisch-Modellsystem
- Intrathorakale Injektionstechniken
Hintergrund
- Standardmäßige Medikamentenverabreichungsmethoden können zu systemischen Wirkungen oder Herzschäden führen.
- Diese Methode bietet einen lokalisierten Ansatz zur Untersuchung des Herzens unter verschiedenen Bedingungen.
- Frühere Studien verfügten nicht über gezielte Verabreichungsstrategien für Herzstudien bei Zebrafischen.
Verwendete Methoden
- Intrathorakale Injektion von Verbindungen in die perikardiale Höhle
- Erwachsene Zebrafische als biologisches System
- Verwendung von Mikroskopie zur Überwachung der Injektion und Herzanalyse
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abgabe von Proteinen und Farbstoffen ins Herz ohne Schäden.
- DAPI-Färbung zeigte deutlich bessere Ergebnisse mit intrathorakaler Injektion im Vergleich zur intraperitonealen Injektion.
- Bestätigte effektive Eindringtiefe der Verbindungen in das Myokard und Reaktion in Bezug auf zelluläre Prozesse.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode verbessert die gezielte Abgabe von therapeutischen Wirkstoffen zur Untersuchung kardialer Funktionen.
- Sie birgt Potenzial zur Förderung der biologischen Forschung in Herzregeneration und Präkonditionierung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Intrathoracic injection in adult zebrafish enables targeted delivery of proteins and compounds to the heart, supporting mechanistic de-risking in cardiac target validation. This method improves predictive confidence by allowing focal administration of test agents directly onto the heart surface, reducing systemic variability in preclinical assays. It provides a disease-relevant system for studying cardiac regeneration and preconditioning with enhanced translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering exogenous factors directly to cardiac tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise compound delivery without myocardial damage.
- Predictive Value: Improves target confidence by demonstrating efficient penetration of injected substances into myocardium and underlying tissues.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming compound distribution across heart chambers.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent pericardial delivery and quantitative readouts.
- Platform Utility: Facilitates screening readiness and scalability for evaluating protein and chemical compound effects on heart tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant studies of cardiac preconditioning and regeneration in adult zebrafish.
- Mechanistic De-risking: Enables analysis of injected molecule effects on cardiomyocyte proliferation, extracellular matrix deposition, and immune cell recruitment post-injury.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides data to inform go/no-go decisions based on compound penetration and tissue-specific responses.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling hypothesis testing and biological de-risking in cardiac research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by delivering test compounds directly to the heart.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative delivery of proteins and chemicals to cardiac tissue.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outcomes such as DAPI labeling, phalloidin incorporation, and cellular process activation.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical validation by modeling cardiac regeneration and preconditioning responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for localized compound delivery across multiple cardiac assays and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cardiac pathway analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of compound delivery to the zebrafish heart.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct heart tissue exposure data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, zebrafish handling, and microinjection techniques.
- Depends on specialized instrumentation including needle pullers, microinjectors, and stereo microscopes.
- Necessitates cross-team standardization of injection volumes, needle angles, and pericardial targeting.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly for consistent epicardial penetration.
- Limited by the technical skill required to avoid myocardial damage during capillary insertion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Tools and Solutions for Injections
1:30
Preparation of the Injection Station
2:28
Preparation of the Fish for Intrathoracic Injection
3:04
Microinjection into the Pericardium
4:07
Results: Validation and Analysis of the Intrathoracic Injection Method
6:35
Conclusion
