Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Mikroinjektion von Zerbrafish-Larven einfacher und genauer zu machen. Diese Methode hilft Forschern mit Hilfe von Zebrafisch-Modellsystemen, Zebrafischlarven in bestimmten Orientierungen in großen Arrays zu immobilisieren. Die Technik ermöglicht einen leichteren Zugang zu spezifischem Gewebe für Mikroinjektionen und Bildgebung und ist sehr effektiv, wenn eine große Anzahl von Larven für Anwendungen wie Infektions- oder Xenotransplantat-Krebsmodelle benötigt wird.

Meine Fertigungsstrategien in Zebrafischmodellen ergänzen sich in hohem Maße. Die eine ist menschengemacht und einfach. Der andere ist live und komplex.

Beide haben die gleiche Größenskala. Sie sind beide transparent. Und beide ermöglichen Beobachtungen mit einer Einzelzellauflösung.

Wie Sie hier zeigen, können sie leicht kombiniert werden, und sie könnten Anwendungen für die Untersuchung praktisch jeder schweren Krankheit haben. Nach der Vorbereitung eines PDMS-Blocks in einer Petrischale, die mit einem dünnen Film aus E-3 bedeckt ist, gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie eine Transferpipette, um die erforderliche Anzahl von Embryonen auf die Oberfläche des PDMS-Blocks zu übertragen. Schieben Sie die Embryonen mit einer Haarschlaufe oder einem ähnlichen Werkzeug in die Mikrostrukturdivots, insbesondere für dorsale und ventrale Ausrichtungen.

Beim Laden von Larven in die Divots ist es wichtig, dass genügend Wasser den PDMS-Block bedeckt, um eine einfache Manipulation zu ermöglichen. Es ist auch wichtig, sie in die Vertiefungen zu schieben, damit sie während der Injektion an Ort und Stelle bleiben. Um den Zebrafisch auf Mikrostrukturkanälen zu orientieren, die zuvor gemäß dem Textprotokoll präpariert wurden, wird E-3 mit einer Transferpipette aus dem gemusterten PDMS-Block entnommen.

Der Pegel von E-3 sollte unter den Rand des Blocks fallen, aber immer noch im Reservoir und in den Kanälen vorhanden sein, und eine dünne Schicht verbleibt auf dem PDMS. Übertragen Sie mit einer Transferpipette 10 anästhesierte Embryonen in das Reservoir und achten Sie darauf, dass die Ränder nicht überlaufen. Manipulieren Sie jeden Embryo mit einer Haarschlaufe in den Trichterkopf, zuerst am Eingang des entsprechenden Kanals, und stellen Sie sicher, dass der Embryo beim Eintritt in den Kanal die richtige Ausrichtung hat.

Schieben Sie dann jeden Embryo mit einer Haarschlaufe den Kanal hinunter, bis er die orientierenden Mikromerkmale in den Kanalwänden erreicht, die ihn an Ort und Stelle halten. Nach der Vorbereitung der Mikroinjektionsnadeln und der Mikroinjektionslösung verwenden Sie eine fein verjüngte Pipettenspitze, um fünf Mikroliter der Lösung in die Nadel zu laden. Montieren Sie die Nadel in einen Mikromanipulator, der auf einem Magnetständer montiert ist, und verbinden Sie ihn mit einem PICO-Pumpen-Mikroinjektor.

Brechen Sie dann mit einer Pinzette die Spitze einer Nadel in einem 45-Grad-Winkel, indem Sie die sich verjüngende Spitze einklemmen. Passen Sie die Größe des Injektionsbolus auf einen Nanoliter an, indem Sie die Injektionszeit an der PICO-Pumpensteuerung anpassen. Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektionsnadel auf dem Mikromanipulationscontroller ein, beginnend mit 45 Grad, wobei die Nadel parallel zur Länge des Embryos verläuft.

Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren. Wenn Sie die Petrischale mit der linken Hand und den Mikromanipulator mit der rechten Hand steuern, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an die vorgesehene Stelle der Mikroinjektion, wie z. B. das Vesikel oticus. Führen Sie die Nadel mit dem Mikromanipulationsregler in das Zielgewebe ein und injizieren Sie mit dem PICO-Pumpenfußschalter das voreingestellte Volumen.

Wenn das Gewebe nicht eindringen kann, tippen Sie vorsichtig auf den Knopf des Mikromanipulationsreglers. Um die Embryonen freizusetzen, verwenden Sie eine Transferpipette, um E-3 von oben nach unten über die Oberfläche zu leiten, oder indem Sie die Schale so schwenken, dass die Embryonen in das umgebende E-3 freigesetzt werden. Übertragen Sie die Embryonen in eine Aufwachschale mit E-3 ohne MS-222.

Um die Embryonen mit dem PDMS-Gerät in den Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte zu screenen, verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette oder eine Transferpipette mit schmaler Spitze, um das Gerät zu entleeren, indem Sie E-3 durch den Port fließen lassen. Verwenden Sie E-3 und MS-222, um die Vertiefung zu füllen, bis das Gerät abgedeckt ist. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um vier zuvor injizierte Embryonen in jede Vertiefung zu geben.

Positionieren Sie die Embryonen mit einer Haarschlaufe oder einem ähnlichen Werkzeug an den Eingängen der Bildgebungskanäle in der gewünschten Ausrichtung und schieben Sie sie teilweise in das Gerät. Dies wird dazu beitragen, sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen. Ziehen Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette oder einer Transferpipette E-3 aus dem Port durch das Gerät, bis die Embryonen in der richtigen Ausrichtung für die Bildgebung in die Kanäle gezogen werden.

Übertragen Sie die Well-Platte in ein inverses Fluoreszenzmikroskop. Um die Embryonen abzubilden, passen Sie die Vergrößerung an, indem Sie das geeignete Objektiv auswählen, z. B. 10x für die Darstellung der Neturaohil-Migration von Zebrafischen. Passen Sie die Intensität der Lichtquelle und die Belichtungszeit für jeden Kanal an, sodass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.

Nehmen Sie schließlich Bilder für jeden fluoreszierenden und übertragenen Kanal auf. Unter Verwendung des mikrostrukturierten Kanalgeräts zur Stabilisierung von Embryonen in lateraler Ausrichtung wurde die Fähigkeit von Neutrophilen getestet, auf die Standard-Chemoattraktoren fMLP und LTB4 zu reagieren, die in die otischen Vesikel mikroinjiziert wurden, und zwar zwei Tage nach der Befruchtung. Um die Rekrutierung von Neutrophilen sichtbar zu machen, wurden Injektionen mit hochmolekularem Rhodamindextran verfolgt und in transgenen Embryonen mit grün fluoreszierenden Neutrophilen durchgeführt.

Nicht injizierte Embryonen und Embryonen, die nur mit Rhodamin injiziert wurden, wurden als Negativkontrollen verwendet. Nach der Mikroinjektion wurden die Embryonen in das Bildgebungskanalgerät übertragen und 30 Minuten und fünf Stunden nach der Injektion mit einem EVOS-Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Wie erwartet wurde eine kleine Anzahl fluoreszierender Neutrophilen zu einem frühen Zeitpunkt in das simuliert injizierte otische Vesikel rekrutiert, wahrscheinlich aufgrund einer beschädigten vermittelten Rekrutierung.

Interessanterweise wurde beobachtet, dass sich der Rhodamin-Dextran-Tracer während des Experiments in den Otolithen anreicherte. Für beide Chemolockstoffe wurden Neutrophile in höherer Zahl rekrutiert, insbesondere als Reaktion auf LTB4. Einmal gemeistert, kann diese Technik die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikroinjektion von Zebrafischen erheblich verbessern.

Die Entwicklung dieser Technik wurde durch spezifische Herausforderungen in unserem Labor vorangetrieben. Wir haben diesen Ansatz verfeinert, um den Anforderungen unserer Projekte zu Pilzinfektionen und Tumor-Xenotransplantaten in Zebrafischmodellen gerecht zu werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mikrostrukturierte Oberflächenarrays für die Mikroinjektion von Zebrafischen und für erweiterte Live-Bildgebung verwendet werden.