Name: Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Mikroinjektionsmethode für Zebrafischlarven mit mikrostrukturierten Arrays. Diese Technik ermöglicht präzise Immobilisierung und verbessert die Gewebetargeting-Genauigkeit für Hochdurchsatzstudien.

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Die Autoren möchte David Langenau danken für die großzügige Bereitstellung von Aquarium Raum; Eric Stone, John C. Moore und Qin Tang für Hilfe bei Zebrafisch Wartung und Reagenzien, und Anne Robertson und Elliott Hagedorn aus Leonard Zon Labor für die Beschaffung der hier verwendeten Zebrafisch-Stamm. Sie möchte auch Octavio Hurtado für Ratschläge, photolithographische Techniken zu danken. FE wurde durch Stipendien aus Shriner es Krankenhaus für Kinder und der amerikanischen Australian Association finanziert. Diese Arbeit wurde von NIH finanziert GM92804 zu gewähren.

Mikroinjektion der Larven wurde von der Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care unter Protokoll 2011N000127 genehmigt.
1. Gerät Fertigung
Hinweis: Alle Computer-gestützte (CAD) Zeichnungsdateien verwendet Photolithographie-Masken, die hier beschriebenen entwerfen (Abbildung 1) sind zum Download zur Verfügung. Siehe Tabelle der Materialien für Links.
<ol><li>Den master-Form-Wafer im Reinraum Klasse 1.000 mit Standardtechniken photolithographische7zu fabrizieren. Für die Mikrostruktur Arrays und Kanäle Muster der Epoxy-basierte negativer Photoresist nacheinander in 3 Schichten mit 3 separaten Masken, gemäß den Anweisungen des Herstellers: 100 µm für die flachen Features, 200 µm für die mittlere Features und 400 µm für die Tiefe verfügt. Für das Bildverarbeitungsgerät Schichten Muster zwei mit 400 µm für die flachen Features und 600 µm für die tiefen-Features.</li>
	<li>Kleben Sie den fertige Wafer auf der Basis eines 15 cm Petrischale für das Gießen (Abbildung 2).</li>
</ol>2. Vorbereitung von mikrostrukturierten Oberflächen Arrays - PDMS
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie Polydimethylsiloxan (PDMS), mit dem Meister Wafer als Form. 50 g PDMS Monomer mit 5 g des Initiators zu kombinieren und mischen in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie vorsichtig um das Gerät auf dem master Wafer mit einem Skalpell, sicherstellen, dass den Kontakt zwischen der Spitze des Skalpells und der Wafer-Oberfläche zu behalten. Mit Pinzette, Schälen der PDMS-Replikat vom Wafer und Übertragung auf eine saubere 10 cm Petrischale, Funktion Seite nach oben (Abbildung 3).</li>
	<li>Behandeln Sie das Gerät mit Sauerstoffplasma mit einem Plasma-Ofen für 35 s, Hydrophobie zu reduzieren.</li>
	<li>Deckel mit Zebrafish Embryos (E3)-haltigem Medium 168 mg/L von Ethyl-3-Aminobenoate-Methanesulfonate (MS-222, pH 7,5). Entfernen Sie alle Bläschen aus tieferen Funktionen von fließenden Wasser über die Oberfläche des Gerätes mit einer Transferpipette.</li>
</ol>3. Vorbereitung der mikrostrukturierte Oberfläche Arrays - Agarose
<ol><li>Um eine Negativform PDMS zu machen, zuerst behandeln Sie eine PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma.</li>
	<li>
Behandeln Sie das PDMS-Gerät mit 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) Silan Dampf eine inerte Oberfläche8erstellen. Kurz:
	<ol>
<li>Ort der PDMS behandelten Feature-Seite nach oben in einer Vakuumkammer in einer Dampfhaube sein.</li>
		<li>Neben dem PDMS legen eine kleine offene Glas oder Aluminium-Schale und sorgfältig pipette 200 µL des PFDTS (98 % Silan) in die Schüssel. Achtung: PFDTS Silan ist sehr volatil, reagiert heftig mit Wasser, ist brennbar und verursacht schwere Haut- und Schäden auf Kontakt. Lesen Sie Muskel-und Skeletterkrankungen im Detail vor Gebrauch.</li>
		<li>Schließen Sie die Vakuumkammer und gelten Sie Vakuum für 15-30 Minuten, oder bis die PFDTS Silan vollständig verdunstet ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie das Gerät in einer Petrischale und als eine Form für frische PDMS, wie in Schritt 2.1-2.3 beschrieben.</li>
	<li>Backen bei 65 ° C für mindestens 3 h, dann schälen die gesamte Schicht frischen PDMS vom behandelten Gerät und in einer frischen Petrischale. Dies dann als eine Negativform einsetzbar, um Agarose zu werfen.</li>
	<li>Um die Agarose vorzubereiten, Kochen Sie eine 2 % ige Lösung von niedrigen gelierende Temperatur Agarose in E3 in der Mikrowelle bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.</li>
	<li>Die Negativform PDMS übergießen Sie heißen Agarose und entfernen Sie alle Luftblasen in der Agarose für das Gerät durch fließende heißen Agarose über die Features mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Sobald Bläschen entfernt werden, im Kühlschrank bei 4 ° C die Agarose festlegen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Negativform PDMS durch Verformung der PDMS aus unterhalb von hand, übertragen Sie die Agarose-Block auf eine neue Petrischale und nass mit E3 mit MS-222.</li>
</ol>4. Vorbereitung der PDMS Imaging-Geräte
<ol><li>Um nutzbare Geräte zu machen, werfen Sie PDMS, mit dem Meister Wafer als Form. Kombinieren Sie 50 g PDMS Monomer mit 5 g der Initiator (gleiche wie in Schritt 2.1 verwendet) und Mischung gründlich in einem Kunststoff mit einem Gewicht von Schüssel mit einer Gabel aus Kunststoff.</li>
	<li>Gießen Sie die Mischung vorsichtig über die Form.</li>
	<li>In einem Vakuum Exsikkator bei 16-25 InHg (54-85 kPa) für 1 h entgasen.</li>
	<li>Um die PDMS zu heilen, Backen Sie bei 65 ° C für mindestens 3 h. Die PDMS sollte auf eine feste, aber flexible solide heilen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Geräte aus dem Master-Wafer und Häfen mit einem 1,5 mm Schlag ausstanzen.</li>
	<li>Behandeln die Geräte und einem Glasboden 6-Well gut mit Sauerstoffplasma für 35 Platte s, wie unter Punkt 2.6 beschrieben.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Gerät Feature-Side-Down zu jedem Glas Deckglas des 6-Well-Platte, indem es auf eine Herdplatte 85 ° C für 10 min. Hinweis: Zur Bestätigung der erfolgreichen Verklebung Druck fest auf der einen Seite des verbundenen Geräts mit Pinzette. Das Gerät sollte an den Glas-Deckglas bleiben.</li>
</ol>5. Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Kultur-Zebrafisch-Embryonen bis 2 Dpf mit Standardtechniken3.</li>
	<li>Dechorionate Embryonen mit Zange oder 1 mg/mL Protease mischen (siehe Materialtabelle)3 mindestens 30-60 Minuten vor der Verladung auf Gerät, damit sie sich zu begradigen.</li>
	<li>Betäuben Sie Embryonen mit (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) durch Zugabe von 25 X 1 mL Stammlösung auf der E3 in der Petrischale.</li>
</ol>6. Ausrichtung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - Divot-Arrays
<ol><li>Vorbereiten des PDMS-Blocks aus Schritt 2.7 (Abbildung 3A) in der Petrischale, derart, dass sie durch eine dünne (1-2 mm) Schicht von E3, fällt die einfachere Handhabung der Embryonen erlaubt.</li>
	<li>Übertragen Sie erforderliche Anzahl von Embryonen (in der Regel 10-20 pro Zustand) auf die Oberfläche des PDMS-Blocks mit einer Transferpipette.</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), schieben Sie die Embryonen in mikrostrukturierten Divots (Abb. 3A). Verwendung von Divots eignet sich besonders für dorsalen und ventralen Orientierungen. Hinweis: Für die Divots mit einer strengeren passen (dorsale und ventrale), versuchen die Embryonen auf der Oberfläche des Blocks parallel zu den Divot zu positionieren und dann Rollen sie mit einer Haar-Schleife in Position. Schob sie tiefer in das Divot hilft um sie stabil zu halten.</li>
</ol>7. Orientierung der Zebrafisch auf mikrostrukturierte Oberfläche - mikrostrukturierten Kanäle
<ol><li>Gemustert mit mikrostrukturierten Kanäle (Abb. 3 b) mit einer Transferpipette, bis das Niveau der E3 unter den Rand des Blocks fällt, aber noch vorhanden, in das Reservoir und Kanäle und in einer dünnen Schicht auf die PDMS ist PDMS-Block ziehen Sie E3 ab.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 Embryonen aus Schritt 5.3 in das Reservoir mit einer Transferpipette, ohne dabei die Kanten zu überlaufen.</li>
	<li>Mit einer Haar-Schleife, manipulieren Sie jeder Embryo in den Trichter am Eingang des entsprechenden Kanals zu und orientieren Sie, so dass der Kopf des Embryos in Richtung des Kanals ist und der Embryo die entsprechende Ausrichtung beim Eintritt in den Kanal hat.</li>
	<li>Schieben Sie jedes Embryo ab der Kanal mit einer Haar-Schleife, bis es die orientierende Microfeatures in die Kanalwände, die helfen erreicht, um es in Position zu halten. Nutzung von mikrostrukturierten Kanälen empfiehlt sich besonders für die seitliche Ausrichtung. Hinweis: Um Embryo während Mikroinjektion zu reduzieren, versuchen Sie Anpassung der Höhe der Oberflächenspannung durch E3 aus dem Behälter ziehen.</li>
</ol>8. die Mikroinjektion Zebrafisch
<ol><li>
Mikroinjektion Nadel vorbereiten.
	<ol>
<li>Borosilikatglas Microcapillary Nadeln mit einer Mikropipette Puller als zuvor beschriebenen4zu machen. Die daraus resultierende Nadeln sollten bis zu einem Punkt an einem Ende mit einer konischen Länge von ca. 10 mm abgeschrägt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösung injiziert werden, in diesem Fall 100 nM Lockstoffgradient (N-Formylmethionine-Leucyl-Phenylalanin (fMLP) oder Leukotrien B4 (LTB4)) und 100 nM 70 kDa Rhodamine Dextran Tracer mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Laden Sie 5 µL der Lösung in die Nadel mit einer fein konische Pipette Tipp (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Montieren Sie die Nadel in einem Mikromanipulator auf magnetische Stativ montiert und angeschlossen an eine Picopump Microinjector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brechen Sie die Spitze der Nadel in einem 45 °-Winkel durch Kneifen die kegelförmige Spitze mit der Pinzette.</li>
	<li>Passen Sie Injektion Bolus Größe 1 nL durch die Einspritzzeit auf dem Picopump Controller einstellen.</li>
	<li>Stellen Sie den Winkel der Mikroinjektion Nadel. Ein Nadel-Winkel von 45° auf die Mikromanipulation Controller ist im Allgemeinen ein guter Ausgangspunkt, mit der Nadel parallel zu der Länge des Embryos. Ein steilerer Winkel kann verwendet werden, um die seitliche Bewegung des Embryos während der Mikroinjektion zu minimieren.</li>
	<li>Steuerung der Petrischale mit der linken Hand und die Nadel Mikromanipulator mit dem Recht, bringen Sie die Nadel so nah wie möglich an den vorgesehenen Ort der Mikroinjektion, in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel. Hinweis: Die Gleichheitspartei Vesikel kann als längliche Organ posterior für das Auge mit zwei kleineren ausgeprägte dunkle längliche Strukturen (Otolithen) identifiziert werden.</li>
	<li>Mit dem Mikromanipulation Controller durchdringen Sie das Zielgewebe (in diesem Fall die Gleichheitspartei Vesikel) zu, so dass die Spitze der Nadel in die Blase und injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke mit der Picopump-Fuß-Schalter. Hinweis: Wenn das Gewebe eindringen widersteht, möglichst leichtes Klopfen des Mikromanipulation Controller Knopfes.</li>
	<li>Um die Embryonen zu lösen, fließen Sie E3 über die Oberfläche von oben nach unten mit einer Transferpipette oder durch Schütteln das Gericht, dass die Embryonen in die umliegenden E3 freigesetzt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen ohne MS-222 mit einer Transferpipette auf eine Erholung Schüssel mit E3.</li>
</ol>9. screening von Embryonen mit dem PDMS Imaging-Gerät
<ol><li>Erstklassige Gerät aus Schritt 4.7 durch fließende E3 (+ MS-222) durch den Hafen. Dies kann mit einer 1.000 µL Pipette oder eine schmale Spitze Transferpipette.</li>
	<li>Füllen Sie den Brunnen mit E3 + MS-222, bis das Gerät bedeckt ist.</li>
	<li>Liefern Sie 4 injizierte Embryonen von 8.7 Schritt in jeder gut mit einer Transferpipette. Embryonen können vorher betäubt werden bei Bedarf durch Inkubation in E3 + MS-222 für 1 – 2 min. vor dem Laden (Schritt 5.3).</li>
	<li>Mit einem Tool Mikromanipulation (Haar Schleife o.ä.), richten Sie die Embryonen an den Eingängen der bildgebenden Kanäle in der gewünschten Richtung (Tail-erste oder kopfüber, abhängig vom verwendeten Gerät), und schieben Sie sie teilweise in das Gerät (Abb. 4A). Damit sie gleichmäßig in das Gerät zu ziehen.</li>
	<li>Zeichnen Sie E3 durch das Gerät aus dem Hafen mit 1.000 µL Pipette oder Transferpipette, bis die Embryonen in die Kanäle in der richtigen Ausrichtung für imaging (Abbildung 4 b) gezeichnet werden. Hinweis: Achten Sie darauf, die Embryonen über den Fang Punkt zu saugen, wird die Embryonen schädigen und ihre Ausrichtung ändern.</li>
	<li>Übertragen Sie Well-Platte auf Mikroskop für imaging (Abbildung 4).</li>
	<li>
Bild mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop.
	<ol>
<li>Einstellen Sie Vergrößerung durch Auswahl der entsprechenden Objektiv. 10 X ist in der Regel eine nützliche Vergrößerung für imaging Zebrafisch Neutrophilenzahl Migration.</li>
		<li>Einstellen Sie Intensität der Lichtquelle und Belichtungszeit für jeden Kanal so, dass jedes Signal klar, aber nicht gesättigt ist.</li>
		<li>Die Aufnahmen Sie für jeden Kanal. Hier verwendeten wir grünes fluoreszierendes Protein (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) und Kanäle übertragen. Mehrkanal-Bilder können während der Post-Processing kombiniert werden (Abbildung 4 b-Ich).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir die Verwendung von Geräten wir vor kurzem entwickelt, um 2 Dpf Zebrafisch Mikroinjektion5erleichtern und stellen eine einfache Agarose-freie Halterung für die komfortable Darstellung von Embryonen. Diese Werkzeuge markieren Sie das Dienstprogramm photolithographische Techniken für die Herstellung von Geräten nützlich für Zebrafisch-Techniken.
Wir haben gefunden MSA Geräte besonders nützlich für die Injektion von Zellen oder Partikel anfällig für Agg...

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell für viele Bereiche, von der grundlegenden Entwicklungsbiologie, umfangreiche genetische Studien und chemische Bildschirme1,2. Routinemäßige genetische Manipulationen, wie gen-Überexpression, Zuschlag, CRISPR/Cas9 Mutagenese und Transgenese verlassen sich auf Mikroinjektion von genetischem Material in der einzelligen Zygote, die zur Entwicklung von einfachen, leicht zu bedienende, kommerziell geführt hat verfügbare Tools zur Ausrichtung und Stabilisierung von Eiern für Injektion3. Andere Ansätze, wie z.B. Transplantation und Infektion, erfordern oft Mikroinjektion in späteren Embryonen und Larven mit größeren Spurweite Kapillare Nadeln4. Verwendung von größeren g-Nadeln stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen, da es immer schwieriger, das Zielgewebe zu durchdringen, ohne Drücken oder Rollen des Embryos ist. Unter diesen Bedingungen kann Einholung der entsprechenden Wasser Spannung erforderlich, um den Embryo zu stabilisieren, während Trocknung während des Verfahrens zu vermeiden schwierig ist und die Embryonen nicht ideal für die Injektion in das Zielgewebe orientieren.
Nach Mikroinjektion ist es oft sinnvoll, Bildschirm injizierte Embryonen diejenigen auswählen, die erfolgreich injiziert wurde und Bilder von den ersten Zeitpunkt zu erfassen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate entwickelt, die helfen, um 2 Dpf Embryonen in verschiedenen Ausrichtungen Mikroinjektion5, sowohl für schnelle Image-basierten Screening nach der Injektion zu stabilisieren.
Um ausreichende strukturelle Auflösung in diesen Geräten zu erhalten, haben wir photolithographische Techniken verwendet. In mikroelektronischen Industrie und mehr vor kurzem hochgerechnet auf mikrofluidischen Fertigung allgemein verwendet, können diese Ansätze vertikale Strukturen von 1-1.000 µm, einer Skala gut geeignet zur Manipulation von Zebrafisch-Embryonen und Larven bis hin erreichen. Alle Geräte wurden hergestellt mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die billig, körperlich robust, biologisch inert und transparent ist.
Mikrostrukturierte Oberfläche Arrays (MSAs) wurden als Blöcke von PDMS mit einer gemusterten Oberfläche formatiert, analog zu der einfache Kanäle in Agarose Blöcken gebräuchlich für Ei Mikroinjektion. Nach der Injektion Screening können 6 imaging-Geräte in ein standard Glasboden-6-Well-Platte angeordnet. Diese Geräte eignen sich für einfache Befüllung von Embryonen, während der Entlade Verfahren bequem Rettung von bestimmten Embryonen, Erleichterung ermöglicht Image-basierte screening Ansätze in benutzerfreundlicher Weise als diese Geräte zuvor erarbeiteten die Beebe-Labor-6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td>Zum Gießen der Geräte. Das Kit enthält PDMS-Monomer und Initiator</td></tr><tr><td>Agarose mit niedriger Geliertemperatur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Zum Gießen von Agarose-Geräten</td></tr><tr><td>PFDTS Silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>Zum Gießen von negativen PDMS-Formen</td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Zur Betäubung von Zebrafischen</td></tr><tr><td>Rhodamin Dextran 70.000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>Zur Rückverfolgung von Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>Leukotrien B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophiler Chemolockstoff</td></tr><tr><td>N-Formylmethionin-leucyl-phenylalanin (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophiler Chemolockstoff</td></tr><tr><td>15 cm Petrischale</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>Zum Gießen vom Master-Wafer</td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>Für bildgebende Geräte</td></tr><tr><td>Mikrokapillaren aus Borosilikatglas</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>Für Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>Für den Transfer von Zebrafischembryonen</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Zum Laden der Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1,5 mm Stanze</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>Zum Stanzen von Ports in PDMS-Bildgebungsgeräten</td></tr><tr><td>Nr. 11 Skalpell</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>Zum Schneiden PDMS</td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>Zum Dechorionieren von Embryonen und Brechen von Mikroinjektionsnadelspitzen</td></tr><tr><td>Marzhauser Mikromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>Zum Manipulieren von Mikroinjektionsnadeln</td></tr><tr><td>Magnetisches Stativ</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>Zur Montage von Mikromanipulatoren</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump Controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>Zur Steuerung des Mikroinjektionsvolumens und -timings</td></tr><tr><td>EVOS Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>Zur Abbildung von injizierten Embryonen</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Zur Visualisierung von Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>AutoCAD Software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Laden Sie AutoCAD-Dateien herunter von: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 und auf der Wiki-Seite der ZFIN-Community-Protokolle: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protokoll+Wiki &nbsp;</td></tr></tbody></table>

mikrostrukturierter apparate für optimierte mikroinjektion und imaging von zebrafischlarven

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafisch entstanden als ein leistungsfähiges Modell der verschiedenen menschlichen Krankheiten und ein nützliches Werkzeug für eine zunehmende Anzahl von experimentellen Studien über grundlegende Entwicklungsbiologie durch zu großen genetischen und chemischen Bildschirme. Allerdings setzen viele Experimente, insbesondere im Zusammenhang mit Infektionen und Xenograft Modelle auf Mikroinjektion und Bildgebung von Embryonen und Larven, die aufwändige Techniken sind, die Fähigkeit und Kompetenz erfordern. Um die Präzision und den Durchsatz des aktuellen Mikroinjektion Techniken zu verbessern, entwickelten wir eine Reihe von mikrostrukturierter Apparate zu orientieren und zu stabilisieren Zebrafisch-Embryonen im 2 Tage Post Düngung (Dpf) ventral, dorsal oder seitliche Ausrichtung vor der Verfahren. Um die Darstellung der Embryonen zu erleichtern, haben wir auch ein einfaches Gerät mit Kanälen, die 4 Zebrafisch seitlich parallel gegen ein Glas Deckglas orient entwickelt. Zusammen, belegen die Werkzeuge, die wir hier präsentieren die Wirksamkeit photolithographische Ansätze um nützliche Geräte für die Optimierung von Zebrafisch-Techniken zu generieren.

Der hier beschriebene Ansatz zeigt die Konstruktion (Abbildung 1) und Herstellung von Geräten für den Einsatz mit 2 Dpf Zebrafisch, photolithographische (Abbildung 2) und weichen lithografischen (Abbildung 3) Techniken. Mit dieser Methode können Schnelltests vieler Design-Iterationen und Änderungen und Umbauten und Optimierung der Mikrostruktur Dimensionen für die Verwendung mit Zebrafisch auf andere...

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen und Larven ist eine entscheidende, aber anspruchsvolle Technik in vielen Modellen der Zebrafisch. Hier präsentieren wir Ihnen eine Reihe von Microscale Tools zur Unterstützung bei der Stabilisierung und Ausrichtung der Zebrafisch für Mikroinjektion und Imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Mikroinjektion von Zerbrafish-Larven einfacher und genauer zu machen. Diese Methode hilft Forschern mit Hilfe von Zebrafisch-Modellsystemen, Zebrafischlarven in bestimmten Orientierungen in großen Arrays zu immobilisieren. Die Technik ermöglicht einen leichteren Zugang zu spezifischem Gewebe für Mikroinjektionen und Bildgebung und ist sehr effektiv, wenn eine große Anzahl von Larven für Anwendungen wie Infektions- oder Xenotransplantat-Krebsmodelle benötigt wird.Meine Fertigungsstrategien in Zebrafischmodellen ergänzen sich in hohem Maße. Die eine ist menschengemacht und einfach. Der andere ist live und komplex.Beide haben die gleiche Größenskala. Sie sind beide transparent. Und beide ermöglichen Beobachtungen mit einer Einzelzellauflösung.Wie Sie hier zeigen, können sie leicht kombiniert werden, und sie könnten Anwendungen für die Untersuchung praktisch jeder schweren Krankheit haben. Nach der Vorbereitung eines PDMS-Blocks in einer Petrischale, die mit einem dünnen Film aus E-3 bedeckt ist, gemäß dem Textprotokoll, verwenden Sie eine Transferpipette, um die erforderliche Anzahl von Embryonen auf die Oberfläche des PDMS-Blocks zu

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Dieses Video zeigt, wie Morpholino-oder mRNA in Zebrafisch-Embryonen können bei der Ein-Zell-Stadium zu verringern oder zu erhöhen das Niveau der spezifischen Genprodukte bei der späteren Entwicklung injiziert werden.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei...

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.

Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Ein innovatives Verfahren zur Herstellung von mikrofluidischen Geräten mit Polyethylenterephthalat (PET)-Laminierung reduziert die Kosten und die Komplexität des Einfangens und der Bildgebung mehrerer lebender Zebrafischembryonen erheblich.

Kostengünstige Mikrofluidik-Designs für die Laminierung von Polyethylenterephthalat für die Multiplex-Bildgebung von Zebrafischen

Lernen Sie eine optimierte Mikroinjektionsmethode für Zebrafischlarven mit mikrostrukturierten Arrays. Diese Technik ermöglicht präzise Immobilisierung und verbessert die Gewebetargeting-Genauigkeit für Hochdurchsatzstudien.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

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