Die Lambda wählen Sie cII Mutation-Detection-System

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, schrittweise Verfahren zu visualisieren, die am Lambda Select cII-Mutationsassay in kultivierten Zellen von transgenen Nagetieren oder den entsprechenden Tieren beteiligt sind, die mit chemischen und physikalischen Wirkstoffen von Interesse behandelt wurden. Diese Testmethode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mutationsforschung zu beantworten, wie z.B. ist eine Testsubstanz mutagen? Und wenn ja, wie stark ist es als Mutagen?

Induziert es sequenzspezifische Mutationen? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine minimale bis praktisch jede Testverbindung handelt. Die Methode kann für Mutagenitätstests in Säugetierzellen unter Verwendung eines chromosomal integrierten Reportergens verwendet werden.

Um eine einzige Verpackungsreaktion zu erhalten, werden fünf Mikrogramm genomische DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das die erste Reaktionsmischung enthält. Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 30 Grad Celsius für 90 Minuten. Nach der Inkubation 12 Mikroliter des zweiten Reaktionsgemisches in das Röhrchen geben und weitere 90 Minuten bei 30 Grad Celsius ziehen lassen.

Geben Sie nach 90 Minuten 1,1 Milliliter SM-Puffer in das Röhrchen. Wirbeln Sie dann das Röhrchen mit der verpackten DNA bei Raumtemperatur etwa 10 Sekunden lang kräftig durch. Geben Sie schnell einen Impuls in der Mikrozentrifuge.

Lassen Sie die Tube dann bis zum Gebrauch auf Eis. Fügen Sie als Nächstes 50 Mikroliter Chloroform für jeden Milliliter verpackter DNA hinzu. Wenn die Probe nicht am selben Tag verarbeitet wird, dann wirbeln Sie die Probe vorsichtig und lagern Sie sie bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius.

Bereiten Sie 16 sterile Rundbodenröhrchen und 16 TB1-Agarplatten für eine einzelne verpackte DNA-Probe vor. Verwenden Sie zehn Röhrchen für das Screening und sechs für die Titerung. Aliquotieren Sie dann 300 Mikroliter G1250-Beschichtungskultur in jedem Rundbodenröhrchen.

Als nächstes fügen Sie zum Titern 10 Mikroliter verpackte DNA zu 990 Mikrolitern SM-Puffer und einer Verdünnung von 1:100 hinzu. Wirbeln Sie dann die Probe vortexen. Geben Sie 20 oder 100 Mikroliter der 1:100-DNA-Lösung in jedes der drei Titer-20- bzw. Titer-100-Röhrchen.

Geben Sie zu Screening-Zwecken 100 Mikroliter der unverdünnten verpackten DNA-Probe in jedes der 10 Screening-Röhrchen. Verarbeiten Sie alle 16 Titer- und Siebröhrchen. Wirbeln Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang, um die Komponenten zu mischen.

Inkubieren Sie dann die Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die E.coli des Wirts die Phagen absorbieren können. Fügen Sie als nächstes 2,5 Milliliter geschmolzenes TB1-Top-Agar hinzu. Halten Sie diese 55 Grad Celsius auf die entsprechenden Titer- und Screening-Röhrchen.

Nach der Zugabe die Röhrchen sofort vorsichtig vortexen. Gießen Sie nun den TB1-Agar in die entsprechende Titer- oder Screening-TB1-Agarplatte. Lassen Sie die Platten 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.

Sobald der Agar erstarrt ist, invertieren Sie und lassen Sie alle 10 Screening-Platten im stationären Inkubator bei 24 Grad Celsius für 46 bis 48 Stunden. Lassen Sie die restlichen sechs Titerplatten über Nacht oder einen Tag bei 37 Grad Celsius in einem stationären Inkubator. Nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius wird die Anzahl der Plaques gezählt, die sich in allen 3 Titer 20 und Titer 100 Platten gebildet haben.

Nach der Inkubation bei 24 Grad Celsius wird die Anzahl der Plaques gezählt, die sich in den 10 Screening-Platten gebildet haben. Um die mutitativen Plaques zu verifizieren, entkernen Sie die Plaque mit einer sterilen Pipettenspitze mit breiter Bohrung. Übertragen Sie dann die Plaque in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 500 Mikrolitern sterilem SM-Puffer gefüllt ist.

Inkubieren Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Mischen Sie anschließend einen Mikroliter der entkernten Phagenlösung mit 200 Mikrolitern der G1250-Plattierungskultur in einem sterilen Rundbodenröhrchen. Dann die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach 30 Minuten wird die entkernte Phagenlösung in 2,5 Milliliter geschmolzener TB1-Top-Agar getaucht und 46 bis 48 Stunden lang bei 24 Grad Celsius inkubiert. Sobald die sekundären Plaques sichtbar sind, verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine einzelne, gut isolierte Lambda cII-Mutantenplaque zu entnehmen. Übertragen Sie die Plaque mehrmals in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 25 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser in einer Pipette gefüllt ist.

Lassen Sie die Tube fünf Minuten lang auf kochendem Wasser stehen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 18.000 G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Unmittelbar nach der Zentrifugation werden 10 Mikroliter des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das 40 Mikroliter des PCR-Mastermixes enthält.

Nach der PCR-Amplifikation reinigen Sie das paraamplifizierte Produkt der 432-Base mit dem cII-Gen und seinen flankierenden Regionen, die mit dem PCR-Aufreinigungskit eingebaut wurden. Sequenzieren Sie dann das cII-Transgen mit einem DNA-Analysegerät, um die Mutationen nachzuweisen. Die Plaques, die sowohl in der Titer-20- als auch in der Titer-100-Platte erhalten wurden, sind gut sichtbar, wenn man sie neben einen weißen Leuchtkasten und vor einem dunklen Hintergrund hält.

Hier stellt das Balkendiagramm die mutagene Potenz verschiedener Chemikalien in den getesteten physikalischen Verbindungen dar. Dies geschieht durch die Analyse des Ausmaßes des Anstiegs der relativen cII-Mutantenfrequenz, die aus den embryonalen Faserblasten der Maus isoliert wurde. Das Balkendiagramm zeigt alle diese Testreagenzien mit einer statistisch signifikanten Faltungszunahme der cII-Mutantenhäufigkeit.

Als nächstes werden die Mutationsspektren des cII-Transgens in den embryonalen Faserblasten der Maus demonstriert, die mit UVB bestrahlt wurden. Das Tortendiagramm zeigt einen signifikanten Anstieg der relativen Häufigkeit des Übergangs von Einzel- oder Tandemcytidin zu Thymidin bei Pyrimidindinukleotiden im Vergleich zur Kontrolle. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht bis zehn Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, ohne die Vorbereitungszeiten für die bakterielle Streifenplatte in der Kultivierung.

In der DNA-Sequenzierung, nach der Bewertung der cII-Mutanten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Mutationsanalyse einer Testsubstanz in einem In-vitro-Modellsystem durchführt.