Name: Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie die Wildtyp-Blocking-PCR mit Sanger-Sequenzierung zur hochsensitiven Detektion niederfrequenter somatischer Mutationen in Krebsgeweben. Diese kostengünstige Methode eignet sich für onkologische und hämatologische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung des niederfrequenten Mutationsnachweises mit Wildtyp-Blocking-PCR

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Automatischer DNA-Extraktor</td><td>9001301</td><td>Qiagen</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Nukleinsäuredetektor</td><td>Q32854</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Amplifikationskit</td><td>P4600</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Instrument</td><td>C1000 Touch</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K-Lösung</td><td>D3001-2-A</td><td>zymo Forschungsproteinase</td><td></td></tr><tr><td>K-Speicherpuffer</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo research</td><td></td></tr><tr><td>Enzymkit zur Sequenzierung von Amplifikationen</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

wildtyp-blocking-pcr in kombination mit sanger-sequenzierung zum nachweis niederfrequenter somatischer mutationen

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

Vergleichen Sie die Sequenz des Prüfmusters mit der Referenzsequenz, um den Mutationsstatus des Prüfmusters zu ermitteln. Die BDA-basierte WBT-PCR-Technologie kann die bekannte RHOA G17V-Mutation und andere niederfrequente Mutationen im Amplifikationsintervall von Upstream- und Downstream-Primern nachweisen. Siehe Abbildung 1. Zwei weitere Gene, nämlich IDH2 und JAK1, wurden ebenfalls mit dieser Methode analysiert, Abbildung 2 bzw. Abbildung 3. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode sehr empfindlich ist, wenn es darum geht, niederfrequente Mutationen zu detektieren.
<img alt="DNA-Sequenzierungs-Chromatogramm; Traditionelle PCR vs. WBT-PCR mit Vergleich des RHOA-Mutationsnachweises." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Sequenzierungsergebnis für RHOA. Die Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der RHOA G17-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die der Wildtyp-RHOA G17 entspricht. Das mittlere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.50G&gt;T-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. Das untere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.49-50delinsTT-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Vergleich von WBT-PCR und traditionellem PCR-Chromatogramm, c.515G&gt;A-Mutationsnachweis, IDH2-Gen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Sequenzierungsergebnis für IDH2. Die obige Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der IDH2 R172-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die der Wildtyp-IDH2 R172 entsprechen. Das obere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.515G&gt;A-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweissensitivität von 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="DNA-Sequenzierungsvergleich, WBT-PCR vs. traditionelle PCR für JAK1-Mutationsanalysetabelle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Sequenzierungsergebnis für JAK1. Die obige Abbildung zeigt von oben nach unten die Basenmutation der JAK1 S703-Stelle, die mittels WBT-PCR amplifiziert wurde, und die Sequenzierungsergebnisse nach traditioneller PCR-Amplifikation, die dem Wildtyp JAK1 S703 entsprechen. Das obere Bild zeigt die Sequenzierungsergebnisse der c.2108G&gt;T-Mutation nach Amplifikation mit WBT-PCR-Primern bei einer Nachweisempfindlichkeit von 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fibel</td>
			<td colspan="2">Sequenz der Grundierung</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VR</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTTTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>Grundierung für die Sequenzierung</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Die endgültig entworfene Primerliste von RHOA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Grundierung IDH2 R172</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fibel</td>
			<td>Sequenz der Grundierung</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>Grundierung für die Sequenzierung</td>
			<td>CTGGTTGAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>JAK1 Gen-Primer</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fibel</td>
			<td>Sequenz der Grundierung</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>Grundierung für die Sequenzierung</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Die fertig gestaltete Primerliste von IDH2 und JAK1.

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Dieses Video beschreibt die Wildtyp-blockierende Polymerase-Kettenreaktion (WTB-PCR), die somatische Mutationen nachweist. Bei der PCR-basierten Technik wird eine gesperrte Nukleinsäure (LNA) verwendet, ein Oligonukleotid, das an sein komplementäres Wildtyp-Allel bindet und dessen Elongation blockiert. Die Blockierung ermöglicht selektiv die Amplifikation von niedrig mutierten Allelen über ihre Wildtyp-Varianten in der Probe.

Wildtyp-blockierende PCR zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Die Wildtyp-Blocking-PCR mit anschließender direkter Sequenzierung bietet eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von niederfrequenten somatischen Mutationen in einer Vielzahl von Probentypen.

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere genetische Veränderungen der Zielregion in einer einzelnen Reaktion mit Drop-off-DdPCR und ein einzigartiges paar Hydrolyse Sonden genau zu quantifizieren.

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Lernen Sie die Wildtyp-Blocking-PCR mit Sanger-Sequenzierung zur hochsensitiven Detektion niederfrequenter somatischer Mutationen in Krebsgeweben. Diese kostengünstige Methode eignet sich für onkologische und hämatologische Anwendungen.

Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Weitere Videos entdecken