Name: Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Kalibrierung von Kalium-Ionen-selektiven Mikroelektroden zur Messung von Kaliumdynamiken in erwachsenen Hippocampus-Schnitten. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kaliumhomöostase im zentralen Nervensystem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Khakh Lab wurde von NIH MH104069 unterstützt. Der Mody Lab wurde von NIH NS030549 unterstützt. J.C.O. Dank der NIH T32 neuronale Mikroschaltungen Training Grant(NS058280).

Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den nationalen Institut Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Kanzlers Animal Research Committee an der University of California, Los Angeles genehmigt. Alle Mäuse waren mit Futter und Wasser zur Verfügung Ad Libitum in einer 12 h hell-dunkel-Umgebung untergebracht. Alle Tiere waren gesund mit keine offensichtlichen Verhaltensänderungen, nicht in früheren Studien einbezogen wurden und während der lichtzyklus geopfert wurden. Daten für Experimente wurden von Erwachsenen Mäusen (6-8 Wochen alt für alle Experimente) gesammelt.
1. Vorbereitung des selektiven Mikroelektroden K+
<ol><li>Silanisierung von Borosilikatglas<ol>
<li>Ausreichende Glaskapillaren aus der Verpackung nehmen und in ein 50 mL konische Rohr legen. 1 M HCl. Wash Elektroden mit sanften Agitation in HCl über Nacht oder mindestens 6 Stunden lang konischem Rohr nach oben einfüllen.</li>
		<li>Spülen Sie kurz Kapillaren mit 70 % Ethanol und dann komplett bei 100-120 ° C für 6 bis 8 Stunden trocknen. Gewaschene Kapillaren in Behältern mit wasserfrei Calcium-Sulfat-Trockenmittel für bis zu 4 Wochen vor dem weiteren Gebrauch aufbewahren.</li>
		<li>Ziehen Sie vor der Silanisierung die Kapillaren zu einer feinen Spitze mit einer Mikroelektrode Puller. Die Mikroelektroden, die wir verwenden sind ca. 2 bis 5 Mikrometer im Durchmesser. Handhaben Sie gewaschene Kapillaren mit Handschuhen, als Silanisierung Öle aus der Haut stören können.</li>
		<li>Legen Sie Mikroelektroden in einem Glasbehälter, sodass die Elektroden von der Unterseite zur Spitze Bruch zu verhindern erhöht sind. Befestigen Sie die Mikroelektroden an den Container mit autoklavierbar Band oder ähnliches Klebeband.</li>
		<li>Entfernen Sie etwa 0,5 mL 5 % Dichlorodimethylsilane (DDS) Silanisierung Lösung aus dem Behälter mit der Stickstoff-Ersatz-Methode (siehe Abbildung 2). Füllen Sie einen Ballon mit Stickstoffgas und legen Sie eine Spritze oder Tube und Nadel auf den Ballon. Stechen Sie die Nadel in den DDS-Behälter bei der Erstellung DDS in eine separate Spritze über eine längere Nadel.</li>
		<li>Wenden Sie die Silanisierung Lösung tropfenweise bis in die Spitzen der Pipetten und sofort zu decken. Stellen Sie den Behälter mit Mikroelektroden Silanisierung Lösung in einen vorgewärmten (170-180 ° C) Labor-Ofen für 10-12 Stunden oder bei 200-220 ° C für 30 Minuten</li>
		<li>Nach der Inkubation den Ofen ausschalten und dann die Platte aus dem Ofen nehmen. Seien Sie vorsichtig beim Entfernen der Plattenrandes aus dem Inkubator, da es sehr heiß ist. Legen Sie die Platte auf einer Bank bei Raumtemperatur für 10-15 Minuten die Gläser abkühlen lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Mikroelektroden aus der Platte (mit einer Rasierklinge oder einem Skalpellklinge Band Abschneiden) und legen Sie sie in einem Trockenmittel gefüllten luftdichten Behälter. Silanisiert Mikroelektroden frei von Feuchtigkeit können bis zu 1 Woche nach der Silanisierung verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grundieren die Elektroden<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung K+ Ionophore cocktail: 5 % w/V Streptomyceten, 93 % V/V 1,2-Dimethyl-3-Nitrobenzene, Kalium 2 % w/V tetrakis(4-chlorophenyl) Borat11. Diese Lösung ist eine schwache gelbe Farbe. Unterhalt in einem luftdichten, undurchsichtige Behälter bei Raumtemperatur. Wenn diese Lösung richtig gelagert mehrere Monate dauern kann.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM HEPES 300 mM NaCl bei pH 7,4 gepuffert. Befestigen Sie die Elektrode in eine Klemme und Abgleich mit der gepufferten NaCl mit einer 28G Microfil Spitze verbunden mit einer Spritze. Beachten Sie, dass die Kochsalzlösung das Ende der Mikroelektrode Spitze erreicht hat. Bestätigen Sie, dass der Mikroelektrode große blasenfrei, die den Stromfluss stören könnten.</li>
		<li>Lösen Sie die Elektrodenspitze mit ca. 10-20 µm breit, mit der stumpfen Seite ein Skalpell oder einer Rasierklinge.</li>
		<li>Tragen Sie mit einer Mikropipette ein kleines Tröpfchen (~0.1 µl) des K+ Ionophore nahe der Spitze der Mikroelektrode. Wenn die Elektrode richtig silanisiert wurde die gebrochene Spitze das Tröpfchen absorbiert. Füllen Sie die Elektrode 1 – 2 mm mit dem K+ Ionophore, und entfernen Sie überschüssiges mittels Tissue-Papier.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kalibrierung des selektiven Mikroelektroden K+
<ol><li>Vorbereitung der Kalibrierlösungen<ol>
<li>Erarbeiten Sie Lösungen der verschiedenen Konzentrationen von KCl in gleicher Osmolarität künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) NaCl durch KCl ersetzen. Für die Kalibrierung der Elektroden verwendeten wir 0,1, 1, 10 und 100 mM K+ ACFS, 4.5. Die Rezepte für diese Kalibrierlösungen sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Chemische</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">endgültige mM</td>
			<td rowspan="2">0,1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4,5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g / Mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>variiert</td>
			<td>1,51 g</td>
			<td>1,50 g</td>
			<td>1,44 g</td>
			<td>1,4 g</td>
			<td>0,345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>1 M Lager</td>
			<td>variiert</td>
			<td>20 µl</td>
			<td>200 µl</td>
			<td>900 µl</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1 M Lager</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>1 M Lager</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 µl</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119,98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0,29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nahco33
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0,437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wasser</td>
			<td colspan="7">q.s. 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Kalium-Kalibrierlösungen
<ol start="2"><li>Mikroelektrode Kalibrierung<ol>
<li>Bubble-alle Lösungen mit 95 % O25 % CO2 für mindestens 20 Minuten vor Beginn des Experiments. Beginnen, das Bad mit 4,5 mM [K+] Vorrichtung ACFS mit einer Rate von 3 mL pro Minute. Legen Sie die K+ selektivere Elektrode in Elektrodenhalter an der Elektrode Headstage auf dem Manipulator angebracht. Diese Headstage ist an einen entsprechenden Verstärker angeschlossen. Legen Sie die Spitze der Elektrode in Bad Perfusat.</li>
		<li>Sicherstellen der Masseelektrode Ag/AgCl in derselben Lösung getaucht ist und stabil läuft. Gelten Sie Kalibrierlösungen in einer schrittweisen Mode und zeichnen Sie die möglichen Änderungen in mV über die Elektrodenspitze auf. Warten Sie auf das Potential an der Elektrodenspitze, einen stabilen Wert zu erreichen, bevor Sie mit der nächsten Lösung wechseln</li>
		<li>Messen Sie die Steady-State-Spannungsänderung in Reaktion auf die Anwendung der Kalibrierlösungen auf der Elektrodenspitze. Bestätigen Sie, dass die Neigung der Elektrode Antwort mindestens 52 und nicht mehr als 58 mV pro Protokoll Wechsel in [K+].</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung des akuten Hippocampal Gehirnscheiben
<ol><li>Vorbereitung der Slice-Lösungen<ol>
<li>Bereiten Sie 500 mL Saccharose schneiden Lösung bestehend aus: 194 mM Saccharose, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, und 26 mM Nahco33, 290-300 mOsm, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2.</li>
		<li>Bereiten Sie 1-2 Liter Aufnahmelösung (ACFS) bestehend aus: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, MgCl21 mM, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4und 26 mM Nahco33; pH 7,3-7,4 (nach sprudeln), 290-300 mOsm, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2. Füllen Sie einen Becher mit einem Gehirn Scheibe Halter Kammer mit recording-Lösung und halten Sie es bei 32-34 ° C. Füllen Sie die Vibratome Kammer mit Eiswasser Matsch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akuten Slice-Vorbereitung<ol>
<li>Betäuben Sie tief eine Maus indem man es unter einer Glasglocke mit ca. 2-3 mL Isofluran voraufgeladen. Überprüfen Sie Zehe Prise Reflex, und wenn nicht mehr reagiert, schnell enthaupten mit ein paar scharfen Scheren oder Guillotine, da Ihr Tiere Protokoll erfordert.</li>
		<li>Machen Sie einen ca. 2-3 cm Schnitt mit der Schere aus dem kaudalen Teil des Schädels an die Kopfhaut entlang der Mittellinie geschnitten. Während manuell einfahren der Kopfhaut, stellen Sie zwei 1 cm horizontale Einschnitte aus dem Foramen Magnum entlang der Seiten des Schädels. Dann schneiden mit feinen Schere Sie einem Schnitt der Länge des Schädels, entlang der Mittellinie von der Rückseite des Schädels an der Nase.</li>
		<li>Mit feinen Pinzette eingefügt, in der Nähe der Mittellinie, zurückziehen des eingeritzten Schädels in zwei Portionen. Extrahieren Sie das Gehirn der Maus aus dem Schädel zu und verwenden Sie eine Klinge um zu entfernen, das Kleinhirn und der olfaktorischen Lampen, die jeweils an der kaudalen und rostral Teile des Gehirns befinden. Diese können durch die große Risse identifiziert werden, die sie aus dem Kortex trennen.</li>
		<li>Montieren Sie den Gehirn-Block auf der Vibratome Tablett mit super-Klebstoff. Füllen Sie Vibratome Tablett mit eiskalten Cutting-Lösung.</li>
		<li>Schneiden Sie Gewebeschnitte auf der koronalen Ebene bei 300 µm Dicke. In der Regel können 6 koronale hippocampale Scheiben gesammelt werden.</li>
		<li>Nach jedem Schnitt sofort übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe halten Becherglas auf 32-34° c erwärmt Halten Sie die Abschnitte bei dieser Temperatur für 20 min vor dem Entfernen der Becher mit den Abschnitten und stellen Sie diese bei Raumtemperatur mindestens 20-30 Minuten vor der Aufnahme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Messung von elektrisch evozierten K+ Dynamik
<ol><li>Einrichten der Slice-Vorbereitung<ol>
<li>Legen Sie vorsichtig die Gehirn-Scheibe in der Badewanne mit einer Pasteurpipette und halten Sie ihn sanft mit einem Platin Harfe mit Nylon-Saiten.</li>
		<li>Sicherzustellen, dass die Spitzen der anregenden bipolare Elektrode parallel zueinander und sind mit dem Flugzeug der Scheibe. Langsam, im Laufe von ca. 6-7 Sekunden, legen Sie den Elektroden in CA3 Stratum Radiatum ca. 40-50 µm tief um Schaffer Sicherheiten zu stimulieren. Im koronalen Abschnitte können CA3 etwa als der Teil des Hippocampus richtige Lateral, das Granulat Zellschicht an der hippocampalen Genu mit der Stratum Radiatum fallen mediale und ventralen auf der pyramidalen Zellschicht identifiziert werden.</li>
		<li>Legen Sie die K+-selektiven Elektrode in CA1 Stratum Radiatum ca. 50 µm tief, langsam senken die Elektrode über ca. 3-4 Sekunden. Das Potenzial, über die Elektrode zu stabilisieren, bevor Stimulationen auf die Scheibe zu ermöglichen: Dies dauert in der Regel 5 bis 10 Minuten. Wenn die Scheibe spontane zeigt Veränderungen der extrazellulären K+ dann verwerfen und wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer neuen Scheibe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie evozierten K+ -Freigabe<ol>
<li>Gelten Sie Züge der elektrischen Stimulation (8 Impulse) durch manuell drücken den Auslöser auf der Stimulator während der Aufnahme Digital Antworten. Gelten Sie Stimulation bei 10 Hz und 1 ms Pulsbreite, beginnend bei 10 µA Impuls Amplitude.</li>
		<li>Gelten Sie zunehmende Stimulation Amplituden um einen Faktor von 2, bis eine maximale K+ Antwort Amplitude erkannt wird. Wenn Sie keine Antwort angezeigt werden, verschieben Sie die Position der Elektrode näher K+ Stimulation Standort in Schritten von 100 µm</li>
		<li>Bestimmen Sie die Impuls-Amplitude, die die halbe maximale Reaktion produziert. Nach unserer Erfahrung ist dies zwischen 40-160 µA, je nach Qualität der Vorbereitung, Alter des Tieres und der Abstand zwischen Stimulation Elektroden und selektiven Elektrode K+ .</li>
		<li>In dem gleichen Segment mit einem Impuls-Amplitude am niedriger als die Amplitude, die die halbe maximale Reaktion produziert einen Schritt (z.B. wenn 80 µA eine Hälfte-maximale Reaktion erzeugt, verwenden 40 µA) gelten Reiz Züge der zunehmenden Anzahl von Impulsen. Zunächst haben wir Züge der 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 und 128 Impulse verwendet.</li>
		<li>Um zu bestätigen, dass K+ Signale durch Aktionspotential Abfeuern von elektrisch stimuliert Schaffer Sicherheiten Bad vermittelt werden, gelten Sie 0,5 µM TTX in ACFS für 10 Minuten und wiederholen Sie die Stimulation-Protokoll. Keine evozierten Antworten sollten beachtet werden.</li>
		<li>Nach Beendigung der Slice-Experiment, zu bestätigen, die Elektrode unterhält seine Empfindlichkeit durch neu kalibrieren der Elektrode in die Kalibrierlösungen und Gewährleistung der Reaktion ist nicht um mehr als 10 % von der ersten Kalibrierung abgewichen</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode, die wir hier beschreiben konnten wir K+ Dynamik als Reaktion auf die elektrische Stimulation von Schaffer Sicherheiten in akuten hippocampal Scheiben von Erwachsenen Mäusen zu beurteilen. Unsere Methode der Vorbereitung K+ Ion selektiv Mikroelektroden ist ähnlich wie bei den zuvor beschriebenen Verfahren12,13,14,15. Diese Methode hat jedoch Vorteile gegenüber ...

Kalium-Ionen-Konzentrationen sind fest im Gehirn geregelt, und deren Schwankungen üben einen starken Einfluss auf die Membran-Ruhepotential aller Zellen. Im Hinblick auf diese kritische Beiträge ist ein wichtiges Ziel der Biologie, die zellulären und biophysikalischen Mechanismen zu bestimmen, die verwendet werden, um die Konzentration von K+ fest zu regulieren in den extrazellulären Raum in verschiedenen Organen des Körpers1 , 2. eine wichtige Voraussetzung in diesen Studien ist die Fähigkeit, K+ Konzentrationen genau zu messen. Obwohl viele Komponenten, die zur Kalium Homöostase im Gehirn in gesunden und Kranken Staaten beitragen identifizierten3,4,5, wurden wurde weitere Fortschritte aufgrund der speziellen Art der verlangsamte Messung von Kalium vorbereiten Ionen selektive Mikroelektroden. Mikroelektrode Sensoren sind der Goldstandard für die Messung von K+ -Konzentrationen in Vitro, Gewebe und in Vivo.
Neuere Ansätze zur K+ Überwachung sind in der Entwicklung mit optischen Sensoren, aber diese eine biologisch relevante Bereich von K+ -Konzentrationen nicht erkennen oder nicht wurde komplett in biologischen Systemen, überprüft haben obwohl erste Ergebnisse erscheinen Sie vielversprechend6,7,8. Im Vergleich zu optischen Sensoren, sind Mikroelektroden grundsätzlich beschränkt sich auf eine Punktquelle Messung von Ionen, obwohl Elektroden die räumliche Auflösung9verbessert werden könnte. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Einzel-barreled Mikroelektrode Sensoren zur Überwachung der K+ Dynamik.
In dieser Arbeit berichten wir detaillierte schrittweise Verfahren zu K+ selektive Mikroelektroden, mit einer Streptomyceten-basierte Kalium Ionophore, die hochselektiven erlaubt (104 Fach K+ + Na Selektivität) K+ Bewegung über Membranen10. Eine natürlich vorkommende Polypeptid, Streptomyceten fungiert als eine K+ durchlässige Pore und erleichtert den Fluss von K+ hinunter die elektrochemischen Gradienten. Wir beschreiben auch, wie die Elektroden zu kalibrieren wie zu speichern und sie verwenden und schließlich zur Messung der K+ Konzentration Dynamik in akuten hippocampal Hirnschnitten von Erwachsenen Mäusen bereitgestellt. Die Verwendung von solchen Elektroden zusammen mit genetisch veränderten Mäusen, die spezifische Ionenkanäle vorgeschlagen, extrazelluläre K+ Dynamik regulieren fehlt zeigen sollte, die zellulären Mechanismen verwendet durch das Nervensystem, die ambient Konzentration von K zu kontrollieren + in das extrazelluläre Milieu.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Maus: C57BL/6NTac Inzuchtmäuse</td><td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl gemahlenes Pellet</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benutzerdefinierte Mikrofil 28G Spitze</td><td>Welt Präzisionsinstrumente</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Wolframstab</td><td>A-M Systeme</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Bipolare Stimulationselektroden</td><td>FHC</td><td>MX21XEW (T01)</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>Welt Präzisionsinstrumente</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Gras S88 Stimulator</td><td>Gras Instrumente Unternehmen</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten aus Borosilikatglas</td><td>World precision instruments</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>A bis D Platine</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Signalverstärker</td><td>Multiclamp 700A oder 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Patch Computer</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat Monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dimethyl-3-nitrobenzol</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumtetrakis (4-chlorphenyl)borat</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% Dimethyldichlorsilan in Heptan</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

machen, prüfung und verwendung von kalium-ionen selektive mikroelektroden im erwachsenen gehirn gewebe scheiben

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Kalium-Ionen wesentlich dazu beitragen, die Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K+ Konzentration ist daher ein entscheidender Regulator der Erregbarkeit der Zelle. Konzentrationen von extrazellulären K+ beeinflussen die ruhenden Membran potenzielle und zellulären Erregbarkeit durch Verschiebung der Gleichgewichte zwischen geschlossenen, offenen und inaktivierten im Hinblick auf spannungsabhängige Ionenkanäle, die Aktionspotentials zugrunde liegen verändert Initiierung und Leitung. Daher ist es wertvoll, extrazelluläre K+ Dynamik im Gesundheits- und Kranken Staaten direkt zu messen. Hier beschreiben wir, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K+-selektive Mikroelektroden. Wir ihnen in Erwachsene hippocampal Gehirnscheiben elektrisch evozierten K+ Konzentration Dynamik Messen eingesetzt. Die vernünftige Nutzung von solchen Elektroden ist ein wichtiger Bestandteil der zelluläre und biophysikalische Mechanismen zu bewerten, die extrazelluläre K+ -Konzentrationen im Nervensystem Steuern musste Toolkit.

Für selektive Messung der extrazellulären K+bereiteten wir IONENSELEKTIVE Mikroelektroden beschichtet mit einer hydrophoben Schicht durch Silanisierung sauber Borosilikatglas Pipetten (Abbildung 1A). Diese Beschichtung ermöglicht die K+ -Ionophore mit Streptomyceten zum Ausruhen an der Spitze der Elektrode und erlauben nur K+ Fluss durch eine schmale Öffnung an der Elektrodenspitze (Abbildung 1 b)...

Kalium-Ionen zur Membran-Ruhepotential der Zellen und extrazellulären K+ -Konzentration ist ein entscheidender Regulator der zellulären Erregbarkeit. Wir beschreiben, wie zu machen, zu kalibrieren und monopolare K+-selektive Mikroelektroden. Mit Hilfe dieser Elektroden ermöglicht die Messung von elektrisch evozierten K+ Konzentration Dynamik in Erwachsene hippocampal Scheiben.

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Herstellung, Kalibrierung und Verwendung monopolarer Kaliumionen-selektiver Mikroelektroden. Die Verwendung solcher Elektroden ermöglicht die quantitative Bestimmung der Dynamik der evozierten Kaliumionenkonzentration in adulten Hirnschnitten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Physiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der zellulären und molekularen Mechanismen der Kaliumionenhomöostase im Zentralnervensystem.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Mikroelektrodensensoren nicht nur eine einfache und unkomplizierte Herstellungsmethode darstellen, sondern auch den Goldstandard für die Messung der Kaliumionenkonzentration darstellen. Um die Kapillaren aus Borosilikatglas für die Silanisierung vorzubereiten, legen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das konische Röhrchen mit einmolarer Salzsäure und inkubieren Sie die Glaskapillaren in Salzsäure unter leichtem Rühren über Nacht für mindestens sechs Stunden.Spülen Sie anschließend die Kapillaren kurz mit 70%igem Ethanol aus und trocknen Sie sie anschließend sechs bis acht Stunden lang bei 100 bis 120 Grad Celsius vollständig ab.

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Wir nutzen die Patch-Clamp-Technik, um GABA-aktivierte Einkanal-Ströme (GABAA-Kanälen, GABAA-Rezeptoren) und die synaptischen und Tonic Ströme erzeugen sie in Neuronen zu messen. Aktivierung der Kanäle sinkt neuronale Erregbarkeit in Gesundheit und...

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

Neuronen sind zunächst geprägt elektrophysiologisch. Dann das Zytoplasma aus den aufgezeichneten Neuronen wird abgesaugt und einer Transkription-PCR-Analyse umzukehren, um die Expression von mRNAs für Neurotransmitter-Synthese-Enzyme, Ionenkanäle und Rezeptoren zu erkennen.

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

Das Video demonstriert die evozierte Dynamik der Kaliumionenkonzentration bei der elektrischen Stimulation von koronalen Hippocampus-Hirnschnitten von Mäusen. Eine bipolare Stimulationselektrode wird in das Stratum radiatum der CA3-Region im Hippocampus eingeführt, und eine Kaliumionen-selektive Elektrode wird in das Stratum radiatum CA1 eingeführt. Die elektrische Stimulation bewirkt ein Aktionspotential, das zur Freisetzung von Kaliumionen führt. Schließlich bestätigt das Fehlen einer...

Messung der Dynamik der evozierten Kaliumionenkonzentration in koronalen Hippocampusschnitten

Dieses Video zeigt, wie man den extrazellulären Raum in einem Gehirnschnitt charakterisiert, indem ionenselektive und Iontophorese-Mikroelektroden verwendet werden, um elektrische Signale zu messen und zu vergleichen. Dieser Prozess hilft bei der Bestimmung des Volumenanteils und des Verdrillungsgrades des Raums.

Charakterisierung des extrazellulären Raums in einem Hirnschnitt mit ionenselektiven und Iontophorese-Mikroelektroden

Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

In diesem Artikel zeigen wir eine Methode zur Herstellung von akuten Hirnschnitten bei physiologischer Temperatur, unter Verwendung einer konventionellen physiologischen Lösung ohne spezielle Modifikationen für das Schneiden (wie z.B. Zugabe von Saccharose) und ohne intrakardiale Perfusion des Tieres vor der Schnittvorbereitung.

Slice It Hot: Akute erwachsenen Gehirn Slicing in physiologischen Temperatur

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Wir demonstrieren die Herstellung, Kalibrierung und Eigenschaften von zwei Arten von ionenselektiven Mikroelektroden (doppelläufig und konzentrisch) zur Messung von Ionenkonzentrationen im Hirngewebe. Diese werden dann in der Präparation von Hippocampus-Schnitten der Maus verwendet, um zu zeigen, dass die exzitatorische Aktivität sowohl die extrazelluläre Kalium- als auch die Natriumkonzentration verändert.

Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Erfahren Sie die Herstellung und Kalibrierung von Kalium-Ionen-selektiven Mikroelektroden zur Messung von Kaliumdynamiken in erwachsenen Hippocampus-Schnitten. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in die Kaliumhomöostase im zentralen Nervensystem.

Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Weitere Videos entdecken