Machen, Prüfung und Verwendung von Kalium-Ionen selektive Mikroelektroden im erwachsenen Gehirn Gewebe Scheiben

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Herstellung, Kalibrierung und Verwendung monopolarer Kaliumionen-selektiver Mikroelektroden. Die Verwendung solcher Elektroden ermöglicht die quantitative Bestimmung der Dynamik der evozierten Kaliumionenkonzentration in adulten Hirnschnitten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Physiologie zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung der zellulären und molekularen Mechanismen der Kaliumionenhomöostase im Zentralnervensystem.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Mikroelektrodensensoren nicht nur eine einfache und unkomplizierte Herstellungsmethode darstellen, sondern auch den Goldstandard für die Messung der Kaliumionenkonzentration darstellen. Um die Kapillaren aus Borosilikatglas für die Silanisierung vorzubereiten, legen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das konische Röhrchen mit einmolarer Salzsäure und inkubieren Sie die Glaskapillaren in Salzsäure unter leichtem Rühren über Nacht für mindestens sechs Stunden.

Spülen Sie anschließend die Kapillaren kurz mit 70%igem Ethanol aus und trocknen Sie sie anschließend sechs bis acht Stunden lang bei 100 bis 120 Grad Celsius vollständig ab. Lagern Sie die gewaschenen Kapillaren in Behältern mit wasserfreiem Calciumsulfat-Trockenmittel bis zu vier Wochen, bevor Sie sie weiter verwenden. Ziehen Sie vor der Silanisierung die Kapillaren mit einem Mikroelektrodenabzieher zu einer feinen Spitze.

Legen Sie dann die Mikroelektroden mit autoklavierbarem Klebeband in einen Glasbehälter, so dass die Elektroden von unten angehoben sind, um einen Bruch der Spitze zu verhindern. Entfernen Sie anschließend etwa 0,5 Milliliter 5%ige DDS-Silanisierungslösung mit der Stickstoffersatzmethode aus dem Behälter. Füllen Sie einen Ballon mit Stickstoffgas und befestigen Sie eine Spritze oder einen Schlauch und eine Nadel am Ballon.

Führen Sie dann die Nadel in den DDS-Behälter ein, während Sie DDS mit einer längeren Nadel in eine separate Spritze aufziehen. Tragen Sie anschließend die Silanisierungslösung tropfenweise auf die Spitzen der Pipetten auf und decken Sie den Behälter sofort ab. Stellen Sie den Behälter mit den Mikroelektroden mit Silanisierungslösung in einen vorgeheizten Laborofen bei 170 bis 180 Grad Celsius für 10 bis 12 Stunden oder bei 200 bis 220 Grad Celsius für 30 Minuten.

Nach der Inkubation die Platte aus dem Ofen nehmen. Stellen Sie die Platte 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur auf eine Bank, damit die Gläser abkühlen können. Nehmen Sie die Mikroelektroden von der Platte und geben Sie sie in einen mit Trockenmittel gefüllten luftdichten Behälter.

Silanisierte Mikroelektroden, die frei von Feuchtigkeit gehalten werden, können bis zu einer Woche nach der Silanisierung verwendet werden. Um die Elektroden zu grundieren, bereiten Sie eine Stammlösung aus Kalium-Ionophor-Cocktail vor und bewahren Sie sie in einem luftdichten, undurchsichtigen Behälter bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie als Nächstes eine Stammlösung aus 10-Millimolar-HEPES-gepuffertem 300-Millimolar-Natriumchlorid bei pH 7,4 vor.

Fixiere die Elektrode in einer Klemme. Anschließend harken Sie die Spitze der Elektrode mit einem stumpfen Instrument auf eine Breite von etwa 10 bis 20 Mikrometern und füllen Sie dann die Elektrode mit dem HEPES-gepufferten Natriumchlorid unter Verwendung einer 28-Gauge-MicroFil-Spitze, die mit einer Spritze verbunden ist. Beobachten Sie, dass die Kochsalzlösung das Ende der Mikroelektrodenspitze erreicht hat, und stellen Sie sicher, dass die Mikroelektrode frei von großen Blasen ist, die den Stromfluss beeinträchtigen könnten.

Tragen Sie mit einer Mikropipette einen kleinen Tropfen des Kalium-Ionophors in der Nähe der Spitze der Mikroelektrode auf. Wenn die Elektrode richtig silanisiert wurde, wird das Tröpfchen von der abgebrochenen Spitze absorbiert. Füllen Sie die Elektrode bis zu ca. 1 Millimeter mit dem Kaliumionophor und entfernen Sie den Überschuss mit Seidenpapier.

Um die Mikroelektroden zu kalibrieren, blasen Sie alle Kalibrier- und Pufferlösungen mindestens 20 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff/5 % Kohlendioxid, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Beginnen Sie mit der Perfusion des Bades mit 4,5 Millimolar Kaliumionen, das ACSF enthält, mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute. Setzen Sie die Kaliumionen-selektive Elektrode in den Elektrodenhalter ein, der am Elektrodenkopftisch am Manipulator befestigt ist.

Führen Sie dann die Spitze der Elektrode in das Badperfusat ein. Stellen Sie sicher, dass die Silber/Silberchlorid-Erdungselektrode in derselben Lösung gebadet ist und der Fluss gleichmäßig ist. Wenden Sie Kalibrierlösungen schrittweise an und erfassen Sie die Potentialänderungen in Millivolt über die Elektrodenspitze.

Warten Sie, bis das Potential an der Elektrodenspitze einen stabilen Wert erreicht hat, bevor Sie zur nächsten Lösung wechseln. Messen Sie dann die stationäre Spannungsänderung als Reaktion auf das Auftragen der Kalibrierlösungen auf die Elektrodenspitze. Vergewissern Sie sich, dass die Steigung der Elektrodenspannungsantwort mindestens 52 und nicht mehr als 59 Millivolt pro zehnfacher Änderung der Kaliumkonzentration beträgt.

Um Hippocampus-Schnitte vorzubereiten, machen Sie einen zwei bis drei Zentimeter großen Schnitt aus dem kaudalen Teil des Schädels, um die Kopfhaut entlang der Mittellinie zu schneiden. Während Sie die Kopfhaut manuell zurückziehen, machen Sie zwei ein Zentimeter lange horizontale Schnitte vom Foramen magnum entlang der Seiten des Schädels. Machen Sie dann mit einer feinen Schere einen Schnitt entlang der Mittellinie von der Rückseite des Schädels bis zur Nase.

Führen Sie dann eine feine Pinzette in der Nähe der Mittellinie ein und ziehen Sie den eingeschnittenen Schädel in zwei Teilen zurück. Entnehmen Sie das Mäusegehirn aus dem Schädel und verwenden Sie eine Klinge, um das Kleinhirn, den präfrontalen Kortex und die Riechkolben zu entfernen, die sich jeweils im kaudalen und rostralen Teil des Gehirns befinden. Montieren Sie dann den Gehirnblock mit Sekundenkleber auf die Vibratomus-Schale.

Füllen Sie die Vibratome-Schale mit eiskalter Schneidlösung. Anschließend werden Gewebeschnitte auf der koronalen Ebene mit einer Dicke von 300 Mikrometern geschnitten. In der Regel können vier bis sechs koronale Hippocampusschnitte entnommen werden.

Nachdem jedes Stück geschnitten ist, geben Sie die Scheibe sofort in das auf 32 bis 34 Grad Celsius erwärmte Becherglas. Halten Sie die Schnitte 20 Minuten lang auf dieser Temperatur, bevor Sie das Becherglas mit den Schnitten vor der Aufnahme mindestens 20 bis 30 Minuten lang auf Raumtemperatur bringen. Um die Dynamik der Kaliumionen zu messen, legen Sie die Gehirnscheibe vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette in das Bad und halten Sie sie vorsichtig mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.

Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der bipolaren Stimulationselektrode ungefähr parallel zueinander und auf gleicher Höhe mit der Ebene der Scheibe sind. Führen Sie die Elektroden im Laufe von fünf bis sieben Sekunden langsam etwa 40 bis 50 Mikrometer tief in das CA3-Stratum radiatum ein, um die Schaffer-Kollateralen zu stimulieren. Führen Sie dann die Kaliumionen-selektive Elektrode vorsichtig bis zu einer Tiefe von etwa 50 Mikrometern in das CA1-Stratum radiatum ein, indem Sie die Elektrode über einen Zeitraum von etwa drei bis vier Sekunden langsam absenken.

Lassen Sie das Potential über die Elektrode stabilisieren, bevor Sie Stimulationen auf die Scheibe anwenden, was normalerweise fünf bis 10 Minuten dauert. Wenn die Scheibe übermäßige spontane Veränderungen der extrazellulären Kaliumionenkonzentrationen aufweist, verwerfen Sie den Vorgang und wiederholen Sie den Vorgang mit einer neuen Schnitte. Um die evozierte Freisetzung von Kaliumionen zu messen, wenden Sie elektrische Stimulationszüge über den Stimulusisolator an, während Sie die Reaktionen digital aufzeichnen.

Wenden Sie die Stimulation mit 10 Hertz und einer Millisekunde pro Impuls an, beginnend bei 10 Mikroampere Stimulusamplitude. Wenden Sie die um den Faktor zwei erhöhenden Stimulationsamplituden an, bis eine maximale Kaliumreaktionsamplitude erkannt wird. Wenn keine Reaktion beobachtet wird, bewegen Sie die Position der Kaliumionen-selektiven Elektrode in Schritten von 100 Mikrometern näher an die Stimulationsstelle.

Um zu bestätigen, dass Änderungen der Kaliumionenkonzentration durch das Abfeuern des Aktionspotentials der elektrisch aktivierten Shaffer-Kollateralen vermittelt werden, wird 0,5 mikromolare TTX 10 Minuten lang in ACSF im Bad angewendet und das Stimulationsprotokoll wiederholt. Es sollten keine evozierten Reaktionen beobachtet werden. Nach dem Grundieren der Elektroden mit der verfüllten HEPES-gepufferten Kochsalzlösung und dem Kaliumionophor können die Elektroden auf ihre schnelle Reaktion auf schrittweise Änderungen der Kaliumionenkonzentrationen im Bad und auf die lineare Reaktion auf Änderungen der Kaliumionen im Bad über den Kalibrierbereich von 0,1 bis 100 Millimolar in einer Weise getestet werden, die durch die Nernst-Gleichung vorhergesagt wird.

Das stationäre Potential kann gegen die Kaliumionenkonzentration im Bad aufgetragen werden, um die Steigung der Linie zu bestimmen, die ungefähr V 58,2 Millivolt und nicht weniger als 52 Millivolt pro zehnfacher Änderung der Kaliumionenkonzentration betragen sollte. Die Reaktionsfähigkeit der kaliumselektiven Elektroden wurde weiter getestet und die Reaktion auf einen Anstieg des Kaliums um 5,5 Millimolare mit Anstiegs- und Abklingzeitkonstanten von etwa 85 Millisekunden beobachtet. Sobald die stimulierende und die Kaliumionen-selektive Elektrode in das Gewebe eingeführt wurden und die Aufzeichnung eine stabile Basislinie erreicht hat, können Impulse mit zunehmender Stromamplitude angelegt werden.

Die Wellenform dieser Aktivität erscheint als schneller Anstieg des Kaliums mit einer exponentiellen Zerfallsrate, die mit der TTX-Anwendung aufgehoben wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie mit Sorgfalt und Genauigkeit ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Elektrodenspitze so klein wie möglich zu halten, um genaue Aufnahmen zu ermöglichen, aber groß genug, um ein geringes Rauschen zu ermöglichen.