Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Suction Blister Cutaneous Recall-Methode zu demonstrieren, die es uns ermöglicht, antigenspezifische T-Zellen und Zytokine zu ernten, die für die adaptive Immunantwort in vivo repräsentativ sind. Diese Methode kann verwendet werden, um zelluläre Reaktionen und adaptive Immunität beim Menschen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, antigenspezifische T-Zellen mit einer relativ nicht-invasiven und sicheren Methode direkt vom Ort der Immunreaktion zu ernten.

Das Grundprinzip des kutanen Recalls besteht darin, Antigen in die Hautschicht einzubringen. Bei Personen mit vorhandenem immunologischem Gedächtnis des Antigens wandern T-Zellen zum Reaktionsort und induzieren eine lokale Immunantwort, bei der spezifische T-Zellen klonal expandiert und in situ differenziert werden. Die Induktion von Saugblasen über diese Reaktion ermöglicht es uns, diese spezifischen T-Zellen sowie die in vivo produzierten Zytokine zu ernten.

In dieser Videodemonstration verwenden wir PPD als unser Recall-Antigen. PPD wird häufig zur Diagnose einer Mycobacterium tuberculosis-Infektion verwendet. Es induziert aber auch Hautreaktionen bei Menschen, die zuvor mit dem BCG-Impfstoff geimpft wurden, wie Sie in diesem Video sehen werden.

Zu den Materialien für den Tuberkulin-Hauttest gehören Alkoholtupfer, eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer kurzen Nadel von 27 bis 30 Gauge und eine PPD-Lösung, die für den menschlichen Gebrauch zugelassen ist. Verwenden Sie eine PPD-Lösung von 20 Tuberkulineinheiten pro Milliliter. Desinfizieren Sie die Durchstechflasche mit einem Alkoholtupfer.

Und bitte beachten Sie, dass die Zusammensetzung je nach Hersteller variieren kann. Lokalisieren Sie dann die Injektionsstelle auf der ventralen Seite des Unterarms des Freiwilligen und desinfizieren Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer. Verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze mit einer festen Nadel von 29 Gauge und 12 Millimetern.

Mischen Sie vorsichtig und aspirieren Sie 0,1 Milliliter der PPD-Lösung. Achten Sie darauf, dass keine Blasen sichtbar sind. Belasten Sie die Haut und richten Sie die Nadel in einem Winkel von fünf bis fünfzehn Grad mit der Fase nach oben.

Führen Sie die Spitze der Nadel in die Hautschicht ein und stellen Sie sicher, dass die Spitze durch die Epidermis hindurch fast sichtbar ist. Injizieren Sie langsam 0,1 Milliliter PPD-Lösung. Bei richtiger Verabreichung erscheint sofort eine Papel von sechs bis zehn Millimetern.

Die Papel verschwindet nach etwa zehn Minuten. Mehrfache Aussagen von PPD sind möglich, könnten aber eine zusätzliche ethische Genehmigung erfordern. Wenn zwei Injektionen verabreicht werden, streben Sie eine maximale Trennung an, während Sie einen guten Abstand zum Ellbogen- und Handgelenkbereich einhalten.

Die klinische Hautreaktion tritt innerhalb der ersten 24 Stunden auf und wird von einem Juckreiz begleitet. Messen Sie das Ausmaß der Hautreaktion 48 bis 72 Stunden nach der Injektion. Bei der Bewertung des Ansprechens ist es wichtig, die Verhärtung und nicht das Erythem zu messen.

Palpieren Sie die Schwellung des Hutes mit dem Finger. Markiere dann die Ränder der Verhärtung mit einem Kugelschreiber. Verwenden Sie zum Schluss ein weiches Lineal, um den Verhärtungsdurchmesser zu messen und notieren Sie die Ergebnisse in Millimetern.

Nach sieben Tagen ist es an der Zeit, die Saugblase einzuleiten. Zur Induktion der Hautsaugblase verwenden Sie eine Vakuumpumpe mit angebauter Saugkammer. Verwenden Sie entweder ein handelsübliches oder ein kundenspezifisches Gerät.

Wichtig ist, dass die Pumpe im Bereich von minus 20 bis minus 40 Kilopascal einstellbar ist und einen konstanten und zuverlässigen Unterdruck liefert. Der untere Teil der Saugkammer besteht aus einer Platte mit einem kleinen Loch, das mit der Haut in Kontakt kommt. Die Platten können ein oder mehrere Löcher haben und es können verschiedene Größen angebracht werden, um der Hautreaktion gerecht zu werden.

Der obere Teil der Kammer sollte eine visuelle Überwachung der Blase ermöglichen. Desinfizieren Sie vor der Induktion die Haut und die Kammerplatte. Stellen Sie sicher, dass der Arm bequem ruht.

Befestigen und sichern Sie die Kammer, hier mit verstellbaren Gurten. Das Zentrum der Hautreaktion sollte durch das Loch der Bodenplatte sichtbar sein. Schalten Sie die Absaugvorrichtung ein und stellen Sie den Unterdruck auf minus 20 Kilopascal ein.

Erhöhen Sie nach dreißig Minuten den Druck auf minus 25 Kilopascal. Nach 60 Minuten erhöhen Sie den Druck weiter auf minus 30 Kilopascal. Und halten Sie den Druck hier, bis sich eine einzelne Blase vollständig gebildet hat.

Die Induktionsphase des Blisters dauert in der Regel etwa ein bis drei Stunden. Dabei erfolgt die eigentliche Blasenbildung allmählich innerhalb der letzten 30 Minuten, wie hier in hoher Geschwindigkeit demonstriert. Wenn es Anzeichen eines Blasenplatzes oder einer Blutung gibt, wird empfohlen, den Druck langsam abzulassen und die Einleitung frühzeitig zu stoppen.

Blister können als einzelne oder mehrere ineinander übergehende Blister erscheinen. Der Prozess ist oft mit einem Juckreiz verbunden. Nachdem sich der Blister vollständig gebildet hat, lassen Sie den Druck ab und entfernen Sie vorsichtig die Saugkammer.

Bei korrekt induzierten Blasen wird die epidermale Schicht vollständig von der Hautschicht getrennt, so dass ein mit Flüssigkeit gefüllter Hohlraum entsteht. Schützen Sie die Blase, indem Sie einen weichen Verband auf die umliegende Hautstelle auftragen und eine harte Kappe über die Blase legen, hier aus einem 15-Milliliter-Kunststoffschlauch. Befestigen Sie die Kappe mit einem nicht allergenen Klebeband, gefolgt von einem weichen, dehnbaren Verband.

Weisen Sie den Freiwilligen an, den Schutzverband über Nacht aufzubewahren. Am nächsten Tag den Verband vorsichtig entfernen und den Blasenbereich mit Spray desinfizieren. Verwenden Sie eine sterile 2-Milliliter-Spritze mit einer 23-Gauge-Nadel, um den Inhalt der Blister zu entnehmen.

Führen Sie die Nadel in die obere Seitenseite des Blasendachs ein und saugen Sie die Flüssigkeit langsam an. Vermeiden Sie es, den Boden der Kavität zu berühren, aber stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Flüssigkeit auffangen, da das Blasenvolumen gering sein kann, wie in diesem Beispiel. Die zusammengebrochene Blase heilt ohne Narbenbildung ab.

Legen Sie einen Schutzverband über die Blase. Übertragen Sie dann die Blisterflüssigkeit in ein steriles Röhrchen. Schleudern Sie vier Minuten lang bei 600 g mit einer Tischzentrifuge.

Ernten Sie danach den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in 500 Mikrolitern Zellmedium. Die frischen Zellen sind nun bereit für die Zählung und weitere Analyse. Saugblisterzellen können für In-vitro-Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, verwendet werden.

In diesem Experiment mit BCG-geimpften Freiwilligen lag die Zellausbeute zwischen 15.000 und über 200.000 Zellen pro Blister. Hier isolierten wir Zellen aus einer einzigen Saugblase und stimulierten die Zellen mit PPD in vitro, gefolgt von einer Färbung und Durchflusszytometrie. Zum Vergleich führten wir eine parallele Analyse von PBMCs desselben PCG-geimpften Freiwilligen durch.

In den Panels sehen Sie Populationen von CD4-positiven T-Zellen, die für die interzelluläre Produktion von TNF-alpha, Interferon-gamma und IL2 gefärbt sind. Bei diesem Freiwilligen waren über 30% der CD4-positiven T-Zellen, die aus der Haut isoliert wurden, antigenspezifisch. In PBMCs betrug dieser Anteil weniger als 1%Darüber hinaus waren die individuellen Zytokinprofile von Blisterzellen sowohl für T-Zellen des zentralen Gedächtnisses als auch für Effektor-T-Zellen repräsentativ, was zeigt, wie diese Methode es uns ermöglicht, langlebige Gedächtnisreaktionen zu untersuchen, die in vivo erzeugt werden.

Abbildung A zeigt, dass Flüssigkeit, die aus Saugblasen gewonnen wird, auf in vivo produzierte Zytokine analysiert werden kann. In Abbildung B kultivierten wir vier Tage lang Zellen, die aus Saugblasen in Gegenwart von Mycobacterium tuberculosis gewonnen wurden, und zeigten, wie Saugblasenzellen in der Lage sind, Interferon-gamma und TNF alpha ex vivo zu produzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen aus Saugblasen nach der Ablagerung von kutanen Antigenen induziert und erntet.

In dieser Demonstration haben wir ein Antigen verwendet, das für die Tuberkuloseforschung von besonderer Bedeutung ist. Die Grundprinzipien dieser Methodik können jedoch im Bereich der adaptiven Immunität oder in Studien zur Untersuchung von T-Zell-Targeting-Wirkstoffen von Nutzen sein. Bitte denken Sie auch daran, dass Ethik und Sicherheit bei der Arbeit mit menschlichen Freiwilligen oberste Priorität haben.

Denken Sie auch daran, dass die Arbeit mit menschlichen Proben gefährlich sein kann und dass die Sicherheitsvorkehrungen im Labor immer befolgt werden sollten.